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Bioengineering

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

doi: 10.3791/56260 Published: November 8, 2017

Summary

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Abstract

Células estaminais pluripotentes embrionárias e induzida pode auto renovar e se diferenciar em vários tipos de células do corpo. As células pluripotentes são assim, cobiçadas por pesquisa em medicina regenerativa e estão atualmente em ensaios clínicos para doenças oculares, diabetes, doenças cardíacas e outras doenças. O potencial de se diferenciar em tipos de células especializadas, juntamente com os recentes avanços no genoma de tecnologias, incluindo o sistema CRISPR/Cas de edição forneceram oportunidades adicionais para costurar o genoma de iPSC para variadas aplicações incluindo a doença de modelagem, terapia gênica e polarização vias de diferenciação, para citar alguns. Entre as tecnologias de edição disponíveis, o CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes tem emergido como uma ferramenta de escolha para a edição específica do genoma eucariótico. Os CRISPRs são facilmente acessível, barato e altamente eficiente em edições específicas de engenharia. O sistema requer uma nuclease Cas9 e uma sequência de guia (20-mer) específica para o destino de genômico adjacentes um 3-nucleotide "NGG" protospacer-adjacente-motivo (PAM) para direcionamento Cas9 para o locus genômico desejado, ao lado de um traçador de vinculação Cas9 universal (RNA chamada RNA guia única ou sgRNA). Aqui nós apresentamos um passo a passo do protocolo para a geração eficiente de iPSC alimentador independente e livre de pegada e descrever metodologias para edição de genoma de iPSC usando complexos Cas9 ribonucleoprotein (RNP). O genoma edição protocolo é eficaz e pode facilmente ser multiplexado por sgRNAs pre-complexantes para mais de um destino com a proteína Cas9 e simultaneamente entregando dentro das células. Finalmente, descrevemos uma abordagem simplificada para a identificação e caracterização de iPSCs com edições desejadas. Tomados em conjunto, as estratégias delineadas são esperadas para agilizar a geração e edição de iPSC para múltiplas aplicações.

Introduction

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A reprogramação de células somáticas humanas ao estado pluripotentes pela superexpressão de reprogramação fatores revolucionou a investigação em células estaminais com aplicações em modelagem de doença, medicina regenerativa e desenvolvimento de drogas. Vários métodos de reprogramação não-virais estão disponíveis para entrega de reprogramação fatores e gerando iPSCs, mas o processo é a mão de obra intensiva e não muito eficiente1. Os métodos virais, apesar de eficiente, estão associados com problemas de integração do vírus e tumorigenicidade2,3,4. Neste manuscrito, relatamos o uso de citoplasmática vírus Sendai para entrega reprogramação fatores e estabelecer linhas de iPSC pegada livre que a falta de integração de qualquer sequências de vetor viral em seus genomas5. Sendai vírus é um vírus de RNA que é diluído de passagens de citoplasma ~ 10 célula após a infecção e produz fatores de reprogramação em abundância, levando a rápida e eficiente de reprogramação6,7. As iPSCs estabelecida pode então ser prontamente uma transição para médio alimentador-free para evitar o uso de fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como alimentador células8.

Nesta publicação, além de delinear o vírus Sendai mediado reprogramação, descrevemos um protocolo melhorado para edição iPSCs, que tem o potencial para fornecer células humanas ilimitadas com modificações genéticas desejadas para a pesquisa. Nós usamos tecnologia CRISPR/Cas9 para a modificação de iPSCs, que agora está sendo usado para uma ampla gama de aplicações, incluindo bate-ins e nocautes, exclusões de genômicas em grande escala, biblioteca em pool de triagem para a descoberta do gene, genética de numerosos organismos-modelo e terapia de gene a9,10,11. Esta técnica envolve a formação de complexos de Streptococcus pyogenes-derivada Cas9 nuclease e 20-mer guia RNAs que alcançar o reconhecimento do alvo através de base-emparelhamento com sequência genômica alvo adjacente ao 3' protospacer nucleotídeo adjacente sequência de motivo (PAM). A nuclease Cas9 induz um nucleotídeos de interrupção dupla encalhado ~ 3 do site da PAM, que é posteriormente reparados predominantemente por não-homóloga fim juntando o caminho (NHEJ) por inserções ou exclusões no quadro de leitura aberto e desse modo funcional nocaute de genes12.

Nosso protocolo melhorado inclui os detalhes para cultura de células de pâncreas humanas, sua reprogramação na mitotically inativado fibroblastos embrionários de rato (MEFs) para alcançar uma eficiência mais elevada de reprogramação, posterior adaptação à cultura livre de alimentador para Matrigel, caracterização de iPSCs estabelecido, CRISPR guiado RNA concepção e preparação, entrega em iPSCs como complexos de RNP, única célula classificação para gerar linhas clonais de iPSCs editado, fácil de rastreio e identificação de edições e caracterização de única célula clones. Exclusões de genômicas eficientemente foram geradas neste estudo pela introdução de proteína Cas9 e dois complexos de RNP sgRNA CRISPR para induzir quebras encalhadas dobro (DSBs) e exclusão da intervenção do segmento. Esse método capitaliza sobre o uso de dois guias para gerar exclusões no quadro de leitura aberto, alta eficiência de NHEJ levando ao baixo número de clones que precisa ser caracterizado e fácil triagem preliminar dos clones por capilar automatizado unidade de electroforese, analisador de fragmento. Estes genoma eficazes métodos para gerar modelos de doenças humanas baseadas em células-tronco de edição logo se tornará uma abordagem padrão e rotina em qualquer laboratório de células-tronco. Finalmente, genoma preciso edição tornará possível ir além da modelagem de doença de células-tronco e potencialmente poderia ajudar a catalisar terapias baseadas em células.

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Protocol

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1. protocolo de reprogramação

  1. geração de iPSC humana de células pancreáticas humanas primárias
    1. casaco 6-poço da placa com colágeno frio 1,5 mg/mL e deixe-a do gel a 37 ° C por 1 h.
    2. Placa de passagem antecipada humanas pilhas pancreatic principais no meio de Prigrow III (~ 1-1,5 × 10 5 células) em um colágeno revestida 6-placa em dia -2 para atingir aproximadamente 2,5 × 10 5 células ou pelo menos 60% confluencia por bem no dia do transdução (dia 0). Para o primeiro estudo, chapa de pelo menos 2-3 poços para ficar bem com confluência desejada no dia 0. Use pelo menos um bem como um controle para contar as células.
    3. No dia de transdução (dia 0), aquecer 1 mL de meio de Prigrow III em um banho de água para cada poço a ser transformados. Colheita de células de um controle bem em 1 mL de meio FBS 10% com 1 mL de tripsina/EDTA por 5 min ou até as células detach para realizar uma contagem de células. Para fazer 10% médio FBS, adicionar DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamina, 1% piruvato de sódio e 1% não aminoácidos essenciais.
    4. Contagem e verificar a viabilidade das células usando o contador de célula e calcular o volume de cada vírus necessários para atingir o alvo com base do título número e vírus de celular. Use a multiplicidade de infecção (MOI) de KOS = 5, hc-Myc = 5 e hKlf4 = 3 para as células do pâncreas.
    5. Um conjunto de degelo de Sendai vector tubos no armazenamento no gelo-80 ° C e adicionar cuidadosamente os volumes calculados de cada um dos três tubos vector Sendai para 1 mL de meio de Prigrow III, pré aquecido a 37 ° C. pipeta suavemente para misturar a solução. Um poço em uma placa de 6 é suficiente para transducing com vetores virais de Sendai para gerar células reprogramadas.
    6. Aspire o meio de Prigrow III de células e lentamente adicione a mistura de vírus a reprogramação de poços que contém as células. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com um ambiente umidificado de 5% de CO 2.
    7. Cuidadosamente descartar a mistura de vírus em células e substitua meio fresco Prigrow III no dia seguinte, 24 h após a transdução. Cultura de células para a 5D e mudar o meio cada dia alternativo.
    8. No dia 5, preparar MEFs em 0,1% gelatina pré-revestido pratos de cultura de 10 cm (1,3 x 10 6 células/prato). Crescer MEFs T175 frascos até dia 4 e dia 5, expor as células para 6.000 rads de uma fonte de radiação-γ antes da semeadura de células 13 ou uso a fonte comercial do MEF.
    9. No dia 6, use 1 mL de solução de desprendimento celular por 10 min para separar as células transduzidas, todos eles em pratos MEF no meio de Prigrow III da placa com inibidor de rocha (estoque de 5 mM, final 10 µM) e incubar durante uma noite em uma incubadora de 37 ° C, com uma atmosfera umidificada re de 5% de CO 2.
    10. Alterar o meio de Prigrow III a hESC médio no dia seguinte. Para fazer 500 mL do meio de hESC, adicionar DMEM/F-12, substituição de soro de nocaute de 20% (v/v) (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamina; 100 µM não essenciais aminoácidos e 100 µM 2-Mercaptoetanol. Mudar o meio suavemente todos os dias agora.
    11. Observar as placas regularmente para o surgimento de aglomerados de células ou colônias indicativa das células reprogramadas. As células transformadas formam agregados clonais com morfologia de paralelepípedos e grande núcleo e nucléolo. Marcar o provável ' iPSC ' colônias e verifique-os regularmente para o crescimento.
    12. Quase quatro semanas depois de transdução como colônias estão prontas para a colheita ou transferência, preparar placas MEF 24 boas por chapeamento 1.3 x 10 6 placa revestidos de células/gelatina como antes para a transferência das colônias única.
      1. Preparar matriz da membrana (por exemplo, Matrigel) controlos baseado em factor de diluição no certificado de análise. Adicione uma alíquota de 25 mL de DMEM/F-12 para revestir quatro 6 placas (1 mL/poço) e incubar a temperatura ambiente (RT) pelo menos 1 h antes do uso. Escolher manualmente a 12-24 colônias usando uma ponta de pipeta estéril para aspirá-los e transferir para placas MEF em 500 µ l de meio hESC.
      2. Aspire a mídia no poço para suavemente, interromper ou separar as colônias. Também escolha 24-48 colônias em placas de 24 poços matriz membrana revestida. Para as placas de membrana revestida, use mTeSR1 (suplementado com inibidor de pedra 10 µM) por 24 h e mudam todos os dias. Dentro de 6-10 d de arrancar as colônias, eles estão prontos para ser transferido para as novas placas de membrana 24-bem e/ou 12-poços para expansão clonal.
    13. Se necessário, retire as colônias em MEFs usando colagenase 1 mg/mL por 20 min, lavar duas vezes com hESC/mTeSR1 e transferência para membrana revestido placas 12 ou 24-boas. Se não houver suficiente robustas colônias crescendo na membrana da etapa 1.1.12 matriz, congelar as colônias em MEFs usando iPSC congelando mídia conforme o fabricante ' diretrizes de s.
    14. Separar as colônias robustas chapeadas na membrana na etapa 1.1.12 usando 500 µ l de dispase por 20 min e placa novamente na membrana de matriz revestido placas 12-boas. Raspar manualmente quaisquer células diferenciadas ou contaminantes células de alimentador MEF para enriquecer para pluripotentes clones na membrana.
    15. Expandir os clones após 6-8 d crescendo na membrana revestido placas por dissociando com solução de dispase como antes e chapeamento agregados de pequenas células frescas membrana revestida 6 ou 12-placa. Médio de mudança mTeSR1 diariamente. Caracteriza os clones reprogramados pela fosfatase alcalina, coloração, immunostaining pluripotência marcadores (OCT3/4 NANOG), FACS análise e marcadores de superfície pluripotentes e ensaios de diferenciação. Crescer e cultura os clones em placas com revestimento em membrana para todos os ensaios incluindo CRISPR edição conforme explicado acima, a menos que outra solução de revestimento é especificamente mencionada.
  2. IPSCs caracterização da humana
    1. coloração fosfatase alcalina
      Nota: um kit comercial é usado aqui. Consulte a tabela de materiais.
      1. Putativo iPSCs humana na placa de 24 e cultura para 4-5 d da placa com mudança de mídia diariamente.
      2. Para iniciar o protocolo de coloração, Aspire o meio de cultura e lavar as células com 1 mL de 1X PBS com 0,05% Tween 20 (PBST).
      3. Adicionar 0,5 mL de solução de correção no kit sobre as células e incubar a RT para 2 a 5 min.. aspirar a solução de correção e em seguida, lave as células fixas com PBST. Não permita que os poços secarem.
      4. Adicionar 0,5 mL de solução de substrato AP recentemente preparada por bem, misturando a solução A, B e C. Incubar as células no escuro (embrulhado com papel alumínio ou em um recipiente escuro) à temperatura de 5 a 15 min.
        Nota: Estreitamente monitorar a mudança de cor e parar a reação, quando a cor se transforma brilhante para evitar coloração inespecífica.
      5. Parar a reacção por aspirar a solução de substrato AP e lavagem dos poços duas vezes com 2 mL de 1X PBS.
      6. Observar as colônias sob o microscópio e capturar as imagens em 4 X ou ampliação de 10x usando qualquer microscópio de campo claro com uma câmera.
    2. Immunostaining
      1. placa iPSCs humana em placa de 24 e cultura para 4-5 d com mudança de mídia diariamente.
      2. Lavar as células uma vez brevemente com PBS e correção para 20 min com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.
      3. Lavar três vezes por 10 min (3x, 10 min) com PBS em RT.
      4. Sites de específico
      5. saturar com 10% soro normal de cabra ou burro (NS, dependendo o anticorpo secundário animal foi erguido em) em PBS durante 40 min à RT Para apenas intracellular epitopes, incluem 0,3% TX-100 em PBS (TX/PBS) para permeabilize.
      6. Lavagem de 3 x 5 min com PBS em RT.
      7. Diluir os anticorpos OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 e SOX17 em uma solução fresca de 5% NS em PBS e incubar durante 2 h em RT, ou durante a noite em 4 ° C.
      8. Lavar 3 x por 5 min com PBS em RT.
      9. Diluir apropriado secundário Alexa Fluor 488 ou 568 anticorpos em 5% NS/PBS e incubar as células por 1h no RT.
      10. Lavar 3 x por 5 min em RT.
      11. Incubar com DAPI em PBS para 10 min e lavar 2x por 5 min em RT. Use um microscópio fluorescente para tirar fotos.
    3. Classificação de célula fluorescência-ativado (FACS)
      1. placa iPSCs humanas em uma placa de 6 e cultura até as colônias tornam-se 80% confluente (pelo menos 10 5 células /Sample.) com mudança média diária de mTeSR1.
      2. No dia do experimento, isolar as células e dissociar a uma suspensão de célula única, conforme explicado acima no protocolo. Lave com média de 10% FBS.
      3. Para marcadores de superfície, resuspenda em 0,5-1 mL de meio FBS 10% e manter na Ice.
      4. Para marcadores intracelulares, resuspenda em 1 mL de 4% PFA/PBS e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lavar com média de 10% FBS. Resuspenda em 0,1% TX/PBS e incube por 15 min no gelo. Lave novamente com média de 10% FBS. Resuspenda em 0,5-1 mL de meio FBS 10% e manter na Ice.
      5. Adicionar 50 µ l de suspensão de células para 50 µ l de 10% FBS médio contendo quantidade de TRA-1-60, TRA-1-81 ou anticorpos SSEA-4 recomendada e incube por 30 min a 1 h.
      6. Duas lavagens com 10% FBS.
      7. Resuspenda em 100 µ l de 10% médio FBS contendo anticorpos secundários fluorescentes e incube por 30 min. Lave duas vezes com 10% FBS e ressuspender em volume apropriado de 10% FBS. As células vivas podem ser diferenciadas de células mortas pelo corante iodeto de propidium adicionado no < 1 µ g/mL para estimar a apoptose celular durante o processo.
    4. Tri-linhagem diferenciação
      1. sementes de duas placas de 6-poços com 1,5 a 2 x 10 6 iPSCs/bem no meio de mTeSR1 com inibidor de pedra 10 µM.
      2. Permitem que as células a crescer para 2-3 d com diariamente mTeSR1 mudança médio até os poços são 80-90% confluente.
      3. Para indução de ectoderma, adicionar meio de indução neural (NIM) de acordo com o fabricante ' instruções de s em 2-3 poços das placas 6-poços.
      4. Alterar o meio RPMI contendo 2% B27 suplemento menos insulina e 12 µM CHIR99021 para indução de mesoderme em 2-3 poços das placas 14. Add RPMI única contendo 2% B27 suplemento menos insulina para as próximas 24 h. adicionar 5 µM, IWP4 ao meio RPMI com 2% B27 suplemento menos insulina para as próximas 24 horas. Depois de 72 h, substituir a mídia com RPMI contendo 2% B27 suplemento levando à geração de bater cardiomyocytes em 2-3 d.
      5. Para indução de endoderme, mudar o meio em poços das placas para 131 MCDB suplementados com 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 1 x Glutamax, glicose 10 mM, 0.5% BSA, 100 ng/mL GDF8 e 5µM de CHIR99021 por 24 h. cultura no mesmo meio sem CHIR99021 6-poços para 2-3 d 15.
      6. Seguir o protocolo de imunocoloração da etapa 2 para todas as três linhagens e verifique se a expressão de marcadores pertinentes.

2. Edição de humano iPSC genoma usando CRISPR-Cas9

  1. sgRNA e preparação de Cas9 proteína
    1. Cas9 alíquota proteína microcentrifuga tubos em condições estéreis e armazenar as alíquotas por congelamento dos tubos a -80 ° C.
    2. Desenha dois direcionamento guia RNAs por gene baseados no software do MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) ou qualquer outro CRISPR guia projeto webtool. Alvo de primeiro ou segundo exon do gene (baseado no frame de leitura aberto) para gerar nocautes. Escolha os dois guias para que eles cortaram juntas (~ 30-100 bp separado) e podemos facilmente Visualizar a exclusão usando o mesmo conjunto de iniciadores de triagem. Escolha os guias da saída do software com base no índice de qualidade superior e menor número de sites de fora do alvo. Projeto triagem primeiras demão usando a explosão de cartilha do programa (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Iniciadores de rastreio deve ser pelo menos 100 bp longe o Cas9 corta sites e o tamanho do produto do PCR deve ser de preferência entre 400-700 bp para mais fácil amplificação por PCR.
    3. Design sgRNA complementares dois oligo DNAs (19-22 nucleotídeos de comprimento, dependendo da sequência guia) com um Bsa1 corte local em cada extremidade. O oligo DNAs pode ser sintetizado comercialmente e recozido para formar o DNA da dobro-costa. Para recozimento, adicionar 1 μL de cada de 100 µM de guias, 25 µ l de tampão (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM de NaCl, 1 mM EDTA) de recozimento e 23 µ l de água. Incubar em um thermocycler programado para começar a 95 ° C por 2 min e então gradualmente refrigerando a 25 ° C mais 45 min.
    4. Clone a 2 µ l do fragmento resultante em uma enzima de restrição Bsa1 digerido 1 µ l de in-house vetor de pCR2.1 de promotor T7 com um sítio de ligação Cas9 usando T4 DNA ligase conforme o fabricante ' protocolo de s.
    5. Sequenciar os fragmentos de DNA clonados e quando a fidelidade é estabelecida, em vitro transcrever os clones usando um kit de T7 para gerar guia único RNAs. Purificar o sgRNAs com um kit comercial e eluir em água livre de RNase. Verificar a concentração de RNA.
  2. Transfeccao de hiPSCs
    1. cultura hiPSCs no meio de mTeSR1 como descrito acima até que as células são 40-50% de Confluencia.
    2. Duas horas antes de nucleofection, substitua o meio com 2 mL de meio de mTeSR1 escaldadas contendo inibidor de pedra 10 µM.
    3. Uma hora mais tarde, preparar poços de destino para nucleofected células por aspiração de membrana, preparado como acima, de placa de 12 e substituindo com escaldadas 1 mL de meio de mTeSR1 com inibidor de pedra 10 µM. Manter a 37 ° C para a incubação.
    4. Suplemento de
    5. preparar nucleofection mistura de mestre (escala adequadamente dependendo das amostras) para cada amostra por adicionando µ l 16,4 de célula primária de P3; 3,6 µ l de suplemento 1 do kit de nucleofector; 0,5 µ g de proteína Cas9 e 0,5 µ g de cada sgRNA em 22 µ l por volume de reação. vetor GFP pMAX também foi nucleofected conforme o fabricante ' recomendações de s em células aproximadamente estimar a eficiência de iPSC transfeccao.
    6. Cada um Lave bem com 2 mL de PBS RT após aspirar o meio contendo inibidor de pedra dos poços de iPSC. Em seguida, Aspire PBS, adicionar 1 mL de solução de desprendimento de célula e incubar a placa a 37 ° C durante 10 min.
    7. Ressuspender as células em 3 mL de meio de mTeSR1 e suavemente Pipetar para cima e para baixo para gerar uma suspensão de célula única. Células de transferência dissociada de uma centrífuga de 15 mL tubo contendo 5 mL de meio de mTeSR1.
    8. Contar células com contador de célula e calcular o volume total exigido para 0,5 x 10 6 células/do transfection. Coloque a quantidade desejada de células num tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 200 x g durante 5 min à RT e aspire o sobrenadante.
    9. Ressuspender cada unidade de 0,5 x 10 6 células em 22 µ l da mistura do transfection mestre preparada na etapa 4. Rapidamente transferi células na câmara central de um poço de uma tira de nucleocuvette. Coloque a fita em um dispositivo e nucleofect nucleofector células usando o programa CB150.
    10. Depois de nucleofection, adicione rapidamente 80 µ l de meio de mTESR1 escaldadas contendo inibidor de pedra 10 µM a cada poço das células nucleofected. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo.
    11. Transferência suavemente as células da faixa de poços da membrana pré-revestida 12 placa contendo meio de mTeSR1 com inibidor de rocha preparada no passo 3.
    12. d após 1, mude para mTeSR1 fresco médio sem inibidor de rocha. Células de colheita 2-3 d após nucleofection para classificação de célula única.
  3. Isolamento de célula única do alvo hiPSCs
    1. um dia antes da classificação, preparar placas de 96 poços MEF semeando placa 2 x 10 6 células/gelatina-revestida em média de 10% FBS. Aproximadamente 70-80% dos clones sobreviver após nucleofection e 2-3 placas MEF podem ser preparadas para cada experimento edição.
    2. Após a incubação durante a noite, mudar a médio médio hESC (conforme descrito anteriormente) suplementada com 100 ng /bFGF mL, 1 x SMC4 (inibidores adicionados aos meios de comunicação para melhorar a viabilidade celular único) e 5mg/mL fibronectina para promover a adesão.
    3. Substituir o médio sobre o hiPSCs na placa 12-poços de mTeSR1 para mTeSR1 suplementado com 1 x SMC4 pelo menos 2 h antes de célula única classificação.
    4. o meio de hiPSCs de aspirar e lavar as células suavemente com PBS. Adicionar 500 µ l de solução de desprendimento de células em cada poço e incubar a 37 ° C por 10 min depois de aspirar a PBS. Gerar a suspensão de célula única, adicionando 1 mL de mTeSR1 (unsupplemented) a cada poço e pipetagem subindo e descendo suavemente várias vezes.
    5. Colocar suspensão de células em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar durante 5 min à x 200 g no RT. aspirado sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de mTeSR1.
    6. Classificar as células em células únicas usando um classificador de pilha com bocal de 100 mm em condições estéreis com uma célula no poço individual das placas de 96 poços, preparadas na etapa 1.
    7. Quatro dias depois da classificação, formação de colônia deve ser aparente; neste momento substituir o meio de cultura com hESC suplementado com 1 x SMC4.
    8. Oito dias depois da classificação, substitua médio médio hESC e cultura para 2 m.
    9. Separar as colônias usando colagenase 1 mg/mL por 20 min e transferi-los para placas de 24 poços membrana revestida em mTeSR1 com inibidor de rocha. Deixe os clones de célula única crescer e extrair seu DNA genômico após duplicação ou expandi-las. Use primers específicos de gene para amplificar o alvo do DNA por PCR.
    10. Kit de analisador de fragmento de uso para triagem inicial da PCR amplificados alvo genômico da região todos os clones, executando-as através do gel/corante misture conforme o fabricante ' instruções s. Estime o tamanho do fragmento resultante no software PROSize, comparando-o com a escada apropriada, que é executada com as amostras. Sequenciar o esperado ' edição ' clones e analisar dados de sequenciamento para confirmar a edição ou apagamentos.
    11. Para diferenciar clones monoallelic e biallelic, amplificar a sequência editada com PCR e clone no vetor pJET1.2. Enviar pelo menos 8-10 clones para sequenciamento e verifique a sequência para confirmar a edição em um ou ambos os alelos.
    12. Uma vez com sucesso alvo iPSC clones foram identificados através da genotipagem, examinar para confirmar que eles não perderam a pluripotência ou adquirida anormalidades cromossômicas através do processo.

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Representative Results

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Nesta publicação, seguimos um protocolo simples, mas eficiente para a geração de iPSC de células pancreáticas humanas usando integração ou vetores de vírus livre de pegada de Sendai. A figura 1A mostra uma representação esquemática do presente protocolo de reprogramação. As células pancreáticas humanas foram adquiridas comercialmente, cultivadas em meio de Prigrow III e transfectadas com vírus Sendai como explicado acima. Eixo transduzido em forma de células pancreáticas não mostrou qualquer alteração morfológica ~ 5 dias após transdução vírus Sendai no dia 0, mas então tornar-se arredondado com maior núcleo e nucléolo. Algumas colônias iniciais foram vistas após uma pós- transdução de semana mas eles não foram escolhidos, como em nossa experiência, estas colônias rapidamente se dissociam e são geralmente as 'células reprogramadas parcialmente cedo' que não estabelecem colônias robustas. Aproximadamente 10-15 dias pós-transdução de, pequenas colônias luminosos foram observadas e foram escolhidas depois de crescimento (figura 1B, superior direito). Colônias de iPSC humana são compactas, hermeticamente embalados com bordas claras (consideradas como 'células reprogramadas totalmente') (figura 1B, meio de fundo de dia 23) e 'células reprogramadas parcialmente' estão soltas com lacunas na colônia (figura 1B, dia 23 canto inferior direito). As colônias de células pancreáticas reprogramadas foram crescendo no dia 18 (figura 1Bcanto inferior esquerdo) e eram grandes o suficiente para ser colhidos manualmente por dia 23 (figura 1B, médio inferior). As colônias foram chapeadas em placas com revestimento em membrana após a colheita para obter livre de alimentador de iPSC por dia 30-40 (esquerdaFigura 2A, ). Algumas destas colónias 'robusto' livre de alimentador foram expandidas e caracterizadas para a expressão da fosfatase alcalina, pluripotência e marcadores de superfície em condições de livre de alimentador. Todos os clones testados foram positivos para fosfatase alcalina quando eles viraram vermelho brilhante após o ensaio (Figura 2A, direito). Os marcadores de pluripotência OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-60 e TRA-1-81 observaram-se também a ser altamente expressa em todos os clones por imunocoloração ou análise de FACS (Figura 2B e Figura 3A).

Estes resultados demonstram que as colônias de iPSC humana geradas a partir de células pancreáticas expressaram marcadores de pluripotência em condições de livre de alimentador. A pluripotência também foi avaliada por diferenciação dirigida de iPSC humana para três camadas germinativas: ectoderme, a mesoderme e a endoderme. Clones na membrana potente diferenciadas para neurônios TUJ1-positivo (ectoderme), NKX2-5-positivo batendo cardiomyocytes (mesoderme) e células de endodermal SOX17-positivo (Figura 3B).

Após caracterização completa, 3-robusta, livre de alimentador de iPSC clonal linhas foram escolhidas para edição de estudos do genoma. Os dois guias com BsaI locais do corte nas extremidades foram projetados para cada gene cortar juntos (ou seja, n menos de ~ 100 bp). O esquema do protocolo é mostrado na Figura 4. Esta estratégia de exclusão utilizados para os genes alvo nos permitiu facilmente excluir uma parte do primeiro ou segundo exon de um gene. Esta estratégia foi muito eficiente e pudéssemos isolar clones editados em cada tentativa. Os guias foram clonados em vetor BsaI digerido e em vitro transcrito conforme descrito acima. Nós nucleofected guias (RNA) e proteína Cas9 como complexos RNP para edição rápida e eficaz. Nós também classificados as células como células únicas em MEFs como recuperação de células é maior em comparação com as células classificadas individualmente em placas com revestimento em membrana. DNA genômico foi isolado de todos os clones, a parte de destino foi amplificada por PCR e resolvida no analisador de fragmento de tela para alterações em tamanhos de fragmentos de alvo em comparação com os controles. O tamanho do fragmento foi comparado com a escada a correr com as amostras para detectar clones 'editadas' (parte inferiorFigura 4, ). Isto fez a triagem dos clones fácil como podemos ir > 90 clones em um prato e os resultados foram obtidos com a precisão de ± 3 bp. Os clones selecionados em seguida foram sequenciados para confirmar o selvagem-tipo e do mutantes de clones. Clones de sua não tinham nenhuma supressão ou adição de bases, enquanto clones mutantes tiveram qualquer adição ou exclusão na sequência, em comparação com a sua. Os clones mostrando supressão ou adição no sequenciamento eram pJET1.2 expandido e clonado em vetor para identificar clones monoallelic e biallelic de sequenciação de colónias de pelo menos 8-10 por clonagem. Monoallelic clones tinham bases excluído ou adicionado em um alelo e o outro era inalterado e semelhante ao alelo a sua. Clones de Biallelic tinham exclusões em ambos os alelos. Aproximadamente três cem clones foram selecionados para todos os genes-alvo, que identificou aproximadamente 9 clones de exclusão de monoallelic e 3 biallelic exclusão clones em cada caso. Isto corresponde aproximadamente a uma redução de 3 vezes na frequência de geração de clones de biallelic comparado com clones de monoallelic. Heterogeneidade dentro da exclusão amplicons refletido imperfeito e inconsistente reparo NHEJ. A expressão do gene finalmente foi confirmada pela extração de RNA de células-alvo e através da realização de RT-PCR.

Figure 1
Figura 1: reprogramação de células pancreáticas humanas para células pluripotentes alimentador-livre (iPSC). (A) A protocolo esquemático para a geração de iPSC de células pancreáticas humanas é mostrado. As células do pâncreas foram cultivadas em placas com revestimento em colágeno e então transferidas para MEFs após transdução com vetores de vírus Sendai humano. As colônias totalmente reprogramada foram então transferidas para a membrana hESC qualificado e caracterizadas. (B) morfológicos muda depois de transdução vírus Sendai. Antes a transdução, células pancreáticas mostram típico do eixo, como morfologia (superior esquerdo, dia 0). Pequenas e apertadas colônias aparecem na MEFs por dia 12, assemelhando-se colónias de células pluripotentes humanas. Normalmente as colônias de iPSC humano totalmente reprogramadas têm limites muito claros e podem ser pego por dia 23-30. Uma colônia dissociada no dia 23 é mostrada na parte inferior direita. Todas as imagens foram capturadas na ampliação de 100 X (objetivo de X 10 e 10 X ocular). Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: caracterização de iPSC humana. (A), A imagem de contraste de fase típica de uma colônia de iPSC após a colheita e a cultura em condições de livre de alimentador (40 X, objectivo de X 4 e 10 ocular X; esquerda) após vírus Sendai reprogramação das células pancreáticas. Fosfatase alcalina manchada vermelho iPSC colônia está à direita. Para a coloração da fosfatase alcalina, as colônias de iPSC eram fixas e manchado vermelho após a adição da solução de substrato do kit. As imagens foram captadas em 40 X. (B) imunocoloração para marcadores de pluripotência NANOG e OCT3/4 no alimentador-livre humana pancreática iPSCs derivado de células. DAPI foi usado núcleo azul como um controle. Todas as imagens foram tiradas na ampliação de 100 X. Barra de escala = 100 µm em todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 3: caracterização de pluripotência e diferenciação potencial de iPSC. (A), FACS análise de marcadores de superfície SSEA4, TRA-1-60 e TRA-1-81 em iPSCs alimentador-livre. As células foram dissociadas para suspensão de célula única e manchadas para marcadores de superfície SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. O pico roxo contém células de iPSC negativo (controle de anticorpo) e iPSC pancreático pode ser visualizado como o pico verde. (B) imagem de imunofluorescência de genes marcadores de camada germinativa. A expressão da ectoderme marcadores TUJ1 (verde), NKX2-5 mesoderme (vermelho) e endoderme SOX17 (vermelho) nas células após diferenciação dirigida de iPSC do pâncreas. Correspondente controle nuclear mancha DAPI é azul. Todas as imagens foram tiradas na ampliação de 100 X. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: esquemático da estratégia de exclusão CRISPR/Cas9. Um par de sgRNA foi projetado (vermelho marcado) com BsaI locais do corte no final (mostrado como F e R) de preferência visando o primeiro exon, recozidos, clonado em BsaI digerido modificado vector (pCR2.1, BsaI local destacada cinzento), sequenciado e em vitro traduzido. A sequência de sublinhado de vetor mostra a parte eliminada após digestão BsaI. A posição de triagem primeiras demão é indicada em azul. Cas9 e guia RNAs foram nucleofected em iPSC alimentador-livre como um complexo para exclusões genômicas. iPSCs foram então única célula classificada em placas de 96 poços MEF, cultivadas, transferidos para a membrana, expandido e selecionados pelo analisador de fragmento. Para a execução das amostras no analisador, DNAs genômico de Cas9 e guia transfectado clones na membrana foram extraídos e atravessou a mistura de gel/corante no analisador para selecionar para potenciais clones 'editadas' (médio inferior). Os marcadores de escada relevantes, WT e potenciais clones editados são marcados. A expressão do gene foi confirmada pela extração de RNA e análise com Q-PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Reprogramação de células somáticas humanas para iPSCs tem proporcionado um grande impulso para os campos de pesquisa de biologia básica, medicina personalizada, modelagem de doenças, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa16. Muitos métodos atuais e amplamente utilizados de iPSC humana geração requerem o uso de vírus com o risco de uma integração do genoma do hospedeiro ou epissomal vetores com baixa eficiência de reprogramação. Aqui, apresentamos um método eficiente para gerar iPSCs alimentador-livre a partir de células pancreáticas humanas com Sendai-vírus, o que leva a 'pegada livre' e reprogramação eficiente. Os resultantes iPSCs humanas são livres de transgenes viral, manter a pluripotência e evitar o uso de fatores exógenos desconhecidos. A geração de iPSCs em condições de livre de alimentador tem baixa eficiência de reprogramação, para que podermos reprogramou as células pancreáticas primárias em células de alimentador e depois mudou-se as colônias de membrana alimentador-livre para expansão, a cultura e a caracterização. A fusão dessas técnicas fornece estável, confiável e mais eficiente programação de iPSC.

Também geramos iPSCs de fibroblastos humanos e outras células primárias com esse método, o que sugere que o vírus Sendai podem ser usado para reprogramar a grande variedade de células. Considerações são importantes: a necessidade de confluência ideal de células primárias para ser reprogramado como muito poucos ou muitos impactos de células reprogramação eficiência; uma passagem anterior de células primárias quando as células se dividem ainda de forma otimizada; vectores de titulação cuidadosa da viral que resulte em apoptose celular mínima e uma alta eficiência, levando a fácil pick-up de colônias robustas; verificar a perda de expressão de transgene vector Sendai por PCR em 10-15 passagens para assegurar que as iPSCs são 'pegada livre'; e, condições estéreis estritas para cultura de iPSC na membrana.

Usamos um método conveniente e eficiente de modificação do genoma CRISPR para editar o genoma de iPSC. Esta técnica combina proteína Cas9 e sgRNA, complexos de RNP para reconhecer e decompor as sequências de DNA complementares. Pode ser facilmente adaptado para direcionar uma sequência genômica simplesmente alterando o guia bp 20 RNA. Nosso método fornece um protocolo fácil, eficiente e reprodutível, edição de iPSCs humana como eles são mais trabalhosos, difíceis de transduce, e caro de manter do que as outras células. Nós projetamos a pelo menos dois guias adjacentes mas não sobrepostas para cada gene alvo para que um único conjunto de iniciadores de triagem pode ser usado para a seleção de clones editados. Além disso, o uso de dois guias ~ 30-100 bp separado gera uma grande exclusão, que pode ser facilmente visualizada durante o exame preliminar e garanta a depleção de proteína. As guias podem ser testadas em células HEK-293 inicialmente para estimar a eficiência antes de iniciar o ensaio no iPSC. Além disso, é fundamental para estabelecer parâmetros para transfeccao rotineiro dos reagentes para iPSC. Usando o pMAXGFP do plasmídeo, eficiências de Transfeccao de > 80% e as eficiências de segmentação/interrupção de gene de 3-10% em iPSCs são rotineiramente alcançadas. A entrega direta dos complexos Cas9 RNP em células em nosso protocolo proporciona uma acção rápida e rápida rotatividade e mantém altas taxas de modificação do alvo. Nossa abordagem emprega célula única classificação após nucleofection de guias e proteína Cas9, superar um obstáculo significativo de gene direcionamento no misturado a população de iPSC e garantindo o clonality das células. Esta abordagem global 'romance' é simples, fácil de multiplex, leva apenas algumas semanas e não requer qualquer seleção de antibiótica. Nós não observaram qualquer perda na eficiência introduzindo sequencialmente exclusões por CRISPRs dentro de uma linha celular ou iPSCs, embora cariotípica análise precisa ser realizada nesses casos para garantir estabilidade genômica. Os clones também devem ser verificados para a expressão de marcadores de pluripotência. Embora, não um foco desta publicação, este protocolo pode ser cooptado para induzir modificação genética exacta, incluindo o modelo de reparação na transfecção cocktail17,18.

Finalmente, com base na nossa experiência, considerações importantes para iPSC edição protocolo são: projeto racional de guias para minimizar ou evitar completamente fora mutações alvo especialmente na região da"semente" ou perto do motivo de PAM sendo modificado; Otimizando a eficiência do nucleofection nas iPSCs para assegurar a entrega de RNPs; verificação da qualidade de guias preparados; titulação de guia e concentrações de proteína Cas9 e validar sua atividade por clivagem bioquímicos em vitro ensaios ou como descrito neste artigo em cellssuch humana como HEK células que são mais fáceis de cultura e transfect; usar de início iPSCs de passagem que está em fase de registo de crescimento e atingindo a confluência de ~ 50%; manuseamento cuidadoso de células com suave médio muda seguindo a classificação de célula única para garantir a sobrevivência das células.

Acreditamos que o protocolo descrito acima delineado no detalhe adequada irá equipar os leitores com um roteiro para geração e edição de iPSC de forma reproduzível.

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Disclosures

BT é dos membros fundadores da renovar Biosciences Inc..

Acknowledgments

Trabalho no laboratório foi apoiado pela bolsa de pós-doutorado para Dr. Anjali Nandal e grant exploratória de Maryland Stem Cell Research Fund para BT (TEDCO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit Invitrogen A16517 Thaw on ice; S No: 1
Trypsin EDTA Gibco Life Tech 25300-054 0.05%, 100 ml; S No: 2
Rock inhibitor (Y-27632) Milipore SCM075 Use 10 μM; S No: 3
DMEM/F-12 medium Invitrogen 11330-032 S No: 4
Serum replacement (KSR) Gibco 10828028 S No: 5
DMEM Invitrogen 11960069 1X; S No: 6
Fetal bovine serum Thermo Scientific SH30071.03 Aliquot; S No: 7
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid Thermo Scientific 35050061 1/100; S No: 8
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050 1/100; S No: 9
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 55 mM, 1/1,000; S No: 10
Hausser Hemacytometers Hausser Scientific 02-671-54 S No: 11
0.1% Gelatin Solution STEMCELL Technologies 7903 Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12
SSEA-4 antibody Santacruz sc-21704 1/100; S No: 13
TRA-1-81 antibody Cell Signaling 4745S 1/200; S No: 14
OCT4 antibody Santa Cruz sc-5279 1/1,000; S No: 15
Collagen I, Rat Tail Life Technologies A10483-01 Keep cold; S No: 16
Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) Invitrogen A21202/A10042 1/2,000; S No: 17
DPBS Hyclone SH30028LS 1X; S No: 18
100-mm tissue culture dish Falcon 353003 S No: 20
96-well tissue culture plate Falcon 353078 S No: 21
6-well tissue culture plate Falcon 353046 S No: 22
Dissecting scope  Nikon SMZ745 S No: 23
Picking hood NuAire NU-301 S No: 24
15 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 188271 S No: 25
50 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 227261 S No: 26
Sodium pyruvate Invitrogen 11360 S No: 28
β-mercaptoethanol Sigma M7522 S No: 29
Prigrow III medium ABM TM003 S No: 31
Countess™ Cell Counter Invitrogen C10227 S No: 32
Faxitron X-ray system Faxitron CellRad S No: 33
Accutase Innovative cell Technologies AT-104 S No: 34
Collagenase Life Technologies 17104019 1mg/ml stock; S No: 35
Dispase STEMCELL Technologies 7923 S No: 36
hESC qualified matrigel BD Biosciences 354277 To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37
bFGF R & D 233-FB Stock 10 ug/ml; S No: 38
Paraformaldehyde EMS 15710 4% stock in PBS; S No: 39
TRA-1-60 Santa Cruz sc-21705 1/100; S No: 40
NANOG ReproCELL RCAB0004P-F 1/100; S No: 41
Tween 20 Sigma P9416-100ML S No: 42
Alkaline Phosphatase kit Stemgent 00-0055 S No: 43
Cas9 protein PNA Bio CP01-50 Thaw and aliquot; S No: 44
Goat or donkey serum Sigma D9663/G9023 S No: 45
Triton X-100 Sigma X100-100ML S No: 46
DAPI Thermo Scientific D1306 S No: 47
Tris Sigma 9285-100ML S No: 48
NaCL Sigma S7653-250G S No: 49
EDTA Sigma BP2482-500 S No: 50
T4 DNA ligase NEB M0202T S No: 51
Mega Shortscript T7 kit Thermo Scientific AM1354 S No: 52
Mega Clear kit Thermo Scientific AM1908 S No: 53
SMC4 BD Biosciences 354357 S No: 54
Fibronectin STEMCELL Technologies 7159 S No: 55
CloneJET cloning kit Thermo Scientific K1232 S No: 56
Fragment analyzerTM Advanced Analytical S No: 57
mTeSR1 medium kit STEMCELL Technologies 5850 Warm to room temperature; S No: 58
Freezing medium mFreSR™ STEMCELL Technologies 5855 S No: 59
Freezing medium CryoStor® STEMCELL Technologies 7930 S No: 60
MEFs Globalstem GSC-6301G S No: 61
L-glutamine Invitrogen 25030081 S No: 62
Human pancreatic cells ABM T0159 S No: 63
STEMdiff™ Neural Induction Medium Stemcell Technologies 5835 S No: 64
RPMI Thermofisher 11875-093 S No: 65
2% B27-insulin Thermofisher A1895601 S No: 66
CHIR99021 Stemcell Technologies 72052 S No: 67
IWP4 Stemcell Technologies 72552 S No: 68
2% B27 Thermofisher 17504044 S No: 69
MCDB 131 Life Technologies 10372019 S No: 70
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S8761-100ML S No: 71
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G S No: 72
BSA Proliant 68700 S No: 73
GDF8 Pepro-Tech 120-00 S No: 74
TUJ1 antibody EMD Milipore AB9354 S No: 75
NKX2-5 antibody Santa Cruz Sc-14033 S No: 76
SOX17 antibody R & D systems AF1924 S No: 77
Propidium iodide Thermo Scientific P3566 S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™ Lonza AAF-1002 S No: 79
FACSAria II (cell sorter) BD biosciences SORP UV S No: 80

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References

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Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9
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Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System. J. Vis. Exp. (129), e56260, doi:10.3791/56260 (2017).More

Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System. J. Vis. Exp. (129), e56260, doi:10.3791/56260 (2017).

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