Summary
En robust protokoll overvåke nevrale bestander av time-lapse video-mikroskopi etterfulgt av programvarebaserte etterbehandling er beskrevet. Denne metoden representerer et kraftig verktøy for å identifisere biologiske hendelser i en valgt befolkning under live bildebehandling eksperimenter.
Abstract
Forstå mekanismene som styrer kritiske biologiske hendelser av nevrale celle populasjoner, som spredning, differensiering eller cellen skjebne beslutninger, vil være avgjørende for design strategier for mange sykdommer som påvirker nervesystemet. Gjeldende metoder for å spore celle populasjoner stole på sine endelige resultatene i stillbilder og de generelt klarer ikke å gi tilstrekkelig midlertidig løsning å identifisere atferdsmessige funksjoner i enkeltceller. Videre variasjoner i celledød, atferdsmessige heterogenitet i cellen innbyggere, fortynning, spre eller lav effektiviteten av markørene brukes til å analysere celler er alle viktige handicap som fører til ufullstendig eller feil read-outs av resultatene. Derimot representerer utfører live bildebehandling og enkelt celle sporing under riktige forhold et kraftig verktøy for å overvåke hver av disse hendelsene. Her er en time-lapse video-mikroskopi protokoll, etterfulgt av etterbehandling, beskrevet spore nevrale populasjoner med enkeltcelle oppløsning, ansette bestemt programvare. Metodene beskrevet aktiverer forskere å ta opp viktige spørsmål om cellen biologi og avstamning progresjon av forskjellige nevrale populasjoner.
Introduction
For å utvikle nye og mer effektive strategier for å generere neural bestander, må vi først forstå grunnleggende mekanismer som har celler med en regenererende nevrale potensial. Forfølge dette målet krever en omfattende kunnskap om faktorene som regulerer balansen mellom gågaten, spredning/differensiering, modus og tidspunktet for divisjon, celle syklus lengde, vandrende kapasiteter, levedyktighet, etc. Selv om det er en teknisk tilnærming som har vært ansatt mange år1, live bildebehandling og direkte observasjon fortsatt det beste alternativet til å overvåke hendelser ovenfor. I motsetning til mange andre tilnærminger sentrert på sluttpunktet readouts, live bildebehandling og enkelt celle sporing gir informasjon over hele lengden av et eksperiment2,3,4,5, 6. dermed tillegg av midlertidig løsning tillater celledød, heterogene celle atferd eller cellen skjebne beslutninger, samt mange andre kritiske hendelser identifiseres som ellers kunne passere ubemerket. Ideelt disse funksjonene celleområde bør beste overvåket på den enkeltcelle nivå i vivo, der både iboende (celle autonome) og ytre (celle nisje) signaler er tatt hensyn.
Men selv i i vitro situasjonen hendelser skjer i et miljø som ikke gjengir det naturlige miljøet, lav kultur forholdene vanligvis brukes i disse protokollene er mer egnet til å avsløre innebygde karakteristikkene av celler. Dessuten kan en mer enkle kontroll av det omliggende miljøet, ved å endre vekstmediet, utgjøre et verdifullt verktøy for å undersøke personlige rollen hver extrinsic faktor som definerer nevrale nisje, så vel som miljøfaktorer som kan bli indusert i patologisk scenarier7,8,9,10,11,12,13. Derfor, når konfigurert, som protokollen foreslått her, live bildebehandling gir en mulig i vitro løsning for å løse de fleste spørsmålene tidligere nummerert.
I korthet, beskriver denne protokollen maskinvare, programvare, oppdrettsforholdene og de viktigste trinnene som kreves for å utføre en live bildebehandling eksperiment etterfulgt av enkeltcelle sporing. Denne tilnærmingen gir verdifull informasjon som hjelper for å avdekke grunnleggende aspekter av biologi og avstamning progresjon, flere nevrale befolkninger.
Protocol
Følgende avsnitt beskriver trinn kreves for å utføre live bildebehandling etterfulgt av enkeltcelle sporing av flere nevrale populasjoner (figur 1). Alle prosedyrer som involverer dyr beskrevet i denne protokollen må være gjennomført i henhold til veiledning av International Council for laboratoriet dyr Science (ICLAS).
Figur 1. Ordningen illustrerer de viktigste eksperimentelle trinnene i prosedyren, dvs.: kultur, live bildebehandling, PICC og datainnsamling, enkelt celle sporing og sluttresultatet. Trinnene er nummerert i henhold arbeidsflyten for protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. celle kultur: Isolasjon og Plating av den valgte nevrale befolkningen eller celle avstamning
Merk: Eksempler på sin søknad til ulike celle populasjoner gis i forbindelse med denne protokollen, validere sin nytteverdi for å analysere biologi av neural celler. Disse inkluderer: voksen nevrale stamceller (aNSCs) avledet fra musen SubEpendymal sone (SEZ) (for en detaljert isolasjon protokollen se14); Postnatal kortikale astrocyttene å studere neuronal omprogrammering (for en detaljert isolasjon protokollen se15); Postnatal lillehjernen astrocyttene (for en detaljert isolasjon metoden se16); og mus Nevro-2a neuroblastom celle linje (N2a).
- Frø cellene direkte belagt på poly-D-lysine 24-og plater. Bruk 1 mL av kultur medium per brønn. Inkuber platene på 37 ° C og 8% CO2 for aNSCs, eller på 37 ° C og 5% CO2 for astrocyttene/mobiltelefon linjen for 2t før live bildebehandling. Unngå bruk av coverslips å forhindre uønsket bevegelse som motorisert mikroskop scenen er fordrevet som gjør enkeltcelle sporing unfeasible.
Merk: Cellen tettheter og kultur medier i forsøkene er: 30-40000 celler/godt for aNSCs i Dulbecco modifiserte Eagle's medium (DMEM:F12 næringsstoff blanding mellom); 20.000 celler/vel for N2a celler i DMEM høy glukose medium, 80 000 celler/godt for lillehjernen astrocyttene i DMEM høy glukose medium; og 55-65 000 celler/godt for postnatal astrocyttene i DMEM:F12 næringsstoff blanding medium. - Standardisere kultur protokollen ved å justere celle tettheten av kulturen til det laveste antallet celler gjennomførbart. Likevel må celle tetthet være tilstrekkelig høy å opprettholde levedyktigheten til kulturen.
Merk: Hvis cellen tetthet er for høy, det overskytende rusk eller dårlig dissosiasjon (klumper) kan hindre sporing av enkeltceller.
2. live bildebehandling av Time-lapse Video-mikroskopi
- Slå på mikroskopet, kamera, maskinvare og inkubasjon systemer. Still inn temperaturen og lufttrykk 37 ° C og 8% CO2 for aNSCs eller 37 ° C og 5% CO2 for astrocyttene/mobiltelefon linjen. Tillat temperaturen og CO2 -nivåer å stabilisere seg 1-2 h.
Merk: Bestemt utstyr er nødvendig for å utføre time-lapse video analyse, inkludert: lyse felt/fase kontrast/fluorescens mikroskop med motorisert komponenter; inkubasjon enheter som styrer temperatur, CO2 og fuktighet; og til slutt, pålitelig og tilstrekkelig kraftig maskinvare og programvare som kan anskaffe og håndtering av antall bilder under live bildebehandling eksperimenter (Vennligst sjekk Tabellen for materiale). - Når cellene er godt festet til plate (2t etter plating), kan du bruke en permanent markør penn for å gjøre et lite merke på bunnen av en brønn som ikke brukes for å spore, dvs. en brønn som ikke inneholder celler.
Merk: Dette merket vil bli brukt som en referanse til null xyz-koordinater, og den kan brukes når som helst under eller etter eksperimentet, eller mellom endringene av medium, å gå tilbake til nullstillingen. - Plasser platen inne visningskroppen inkubasjon kammer og feste platen til scenen for å unngå eventuelle uønskede bevegelser under forskyvning av visningskroppen motorisert scenen.
- At temperaturen i celle kultur medium til equilibrate i kammeret for ca 20 min. Dette trinnet vil unngå tap av fokus under innspillingen på grunn av utvidelse av komponenter.
- Start programmet live bildebehandling og velg time-lapse modulen satt opp eksperimentet.
- Angi den totale varigheten av eksperimentet og bilde oppkjøpet sykluser i "tidsplan kategorien menyen". På grunn av iboende Phototoksisitet av den overførte eller fluorescens lys brukes, kan du definere et tilstrekkelig intervall å balansere mellom timelige oppløsningen for analysen og den potensielle celledød.
Merk: For eksempel totalt 120 timer ble valgt for aNSC kulturer, anskaffe brightfield bilder hver 5 min. vurdere at oppkjøpet av 120 timer av en enkelt film i denne konfigurasjonen vil kreve 120-150 GB gratis lagringsplass i det computer apparatet. - Velg bilde plasseringene definert av x og y koordinatene og brennvidde (z-koordinat) i den "xyz poeng tab menyen". Inkluder referansepunktet (xyz null koordinat) utgangsposisjon for å hente koordinatene til enhver tid.
- Velg oppkjøpet i "bølgelengde kategorien valgmenyen", brightfield bare eller i kombinasjon med epifluorescence eksitasjon ved behov. Velg eksponeringstid. Huske på at overeksponering overføres, og spesielt fluorescerende lys, kan kompromittere celle levedyktighet (som angitt ovenfor).
- For aNSCs, lillehjernen astrocyttene og N2a celler, velger du brightfield (10-50 ms eksponeringstid).
- For transduced kortikale astrocyttene velger brightfield (10-50 ms eksponeringstid) i kombinasjon med rød/grønn fluorescens, avhengig av reporteren brukes for eksperimentet (rød eksitasjon bølgelengde: 550 nm og 400 ms eksponeringstid, grønne eksitasjon bølgelengde: 460-500 nm og 100 ms eksponeringstid).
- Define navnet på eksperimentet og mappen der bildene skal lagres. Lagre listen med posisjoner å laste eksperimentet når som helst, og når betingelsene er definert, utføre eksperimentet ved å klikke på knappen "Kjør nå".
- Stoppe eksperimentet og Juster fokus betingelsene klikke "overskrive z-knappen" en gang per dag før eksperimentet er fullført. Hvis endringene i medium er nødvendig under live bildebehandling, stoppe eksperimentet og hente platen fra tid forfalle kammeret.
Merk: Endringer i pH i medium på grunn av celledød eller over spredning og variasjoner i romtemperatur, kan påvirke riktig fokusere på mikroskopet på cellene. For sensitive kulturer (som aNSCs) anbefaler vi bruk av middels supplert med 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) (siste konsentrasjon: 1 mM).
3. etter imaging Immunocytochemistry (PICC), innsamling, og behandling
- Når eksperimentet er fullført, pause programvaren og hente platen i fiksering og PICC, som beskrevet i neste trinn.
- Utføre celle fiksering: vask cellene gang med 1 mL fosfat bufret saltvann (PBS) og legge til 500 µL av paraformaldehyde (PFA) (4% i PBS), rugende 10 min ved romtemperatur (RT).
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er en sterk bindemiddel og bør håndteres forsiktig for å unngå kontakt med hud eller øyne. Det må redigeres bare i avtrekksvifte. - Vask cellene tre ganger med 1 mL av PBS og legge til 500 µL av blokkering løsningen (PBS som inneholder 2% (wt/vol) av bovin serum albumin (BSA) og 0,2% (vol/vol) av en ikke-ioniske surfactant). Inkuber 1t på RT.
- Fjern blokkering løsningen og legge 250-400 µL av primære antistoffer løsningen. Inkuber 2t på RT. Primære antistoffer løsningen inneholder primære antistoffer fortynnet i PBS som inneholder 2% (wt/vol) av BSA og 0,2% (vol/vol) av en ikke-ioniske surfactant. Antistoffer brukes i eksperimenter beskrevet her: GFAP (1:500), βIII-tubulin (1:1, 000) og α-tubulin (1:1, 000). Som dette utføres direkte i brønnen, større mengder løsningene kreves (250-400 µL) å dekke alle cellene.
- Vask tre ganger med 1 mL av PBS og legge til 250-400 µL av sekundær antistoffer løsningen (utvannet som beskrevet i trinn 3.4). Sekundær antistoffer brukes i eksperimenter beskrevet her: anti-musen Fluorescein (FITC) (1:800), anti-kanin Cy3 (1:500). Inkuber 1t på RT i mørket.
- Vask tre ganger i 1 mL av PBS. Holde cellene i 1 mL av PBS påfølgende trinnene av protokollen.
- Plasser platen tilbake på mikroskopet scenen og feste det til scenen for å unngå uønsket bevegelse under forskyvning av motoriserte mikroskop scenen.
- Hente xyz nullstilling bruker varemerket i trinn 2.2 og re-sette posisjonene denne referansepunkt ved å trykke knappen "Offset alle X, Y, Z". Re-sette fokusavstand kor.
- Anskaffe en siste runde med bilder, konfigurere nødvendige betingelser for fluorescens utslipp i "bølgelengde kategorien valgmenyen" for å oppdage antigener tidligere målrettet i PICC.
- Kort, i tillegg til brightfield, aktivere FITC (eksitasjon: 495 nm) og Cy3 (eksitasjon: 550 nm) Kjøp valg i programvaren. Bruke 10-50 ms for brightfield 400 ms eksponering å gjenkjenne fluorophores og trykk knappen "1 tid loop" å erverve en siste runde med bilder.
Merk: Intensiteten av fluorescensen kan variere avhengig av PICC utfallet. Justere mot tiden for å få optimal bildekvalitet.
- Kort, i tillegg til brightfield, aktivere FITC (eksitasjon: 495 nm) og Cy3 (eksitasjon: 550 nm) Kjøp valg i programvaren. Bruke 10-50 ms for brightfield 400 ms eksponering å gjenkjenne fluorophores og trykk knappen "1 tid loop" å erverve en siste runde med bilder.
- Merker programvarens fil/eksport og eksportere bilder i Tagged Image File Format (Tiff) eller formatet Joint Photographic Experts Group (Jpeg) til en forhåndsdefinert målmappe.
- Konvertere bilder eksporteres til formatet som kreves av sporing: The sporing verktøyet17 (tTt). For å oppnå dette, Definer inndataene og utgang mappen i "tTt omformer verktøyet" opererer vinduet, samt markører brukes for posisjoner (xy), kanaler (c) og tidspunkt (t), og trykk "Konverter bilder".
Merk: Bilder må endres i samsvar med bestemte innstillinger og de lagres i enkeltmapper for hver posisjon i eksperimentet. Instruksjoner for installering, krav, døpe av stillinger/bilder og bruk av sporing verktøyet er tilgjengelig for nedlasting på: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html.
4. enkeltcelle sporing
- Etter døpe dataene, kan du kjøre tTt programvaren. Velg en bruker navnet og tTt arbeidsmappen.
Merk: Sporing verktøyet arbeidsmappen vil holde alle analysert data og eksporterte resultatene. Arbeidsmappen må ha navnet tTtexport, som inneholder undermapper som heter "AVIexport", "Configs", "TreeExport" og "tTtfiles". - Velg å bli lastet inn i "Velg eksperiment mappevinduet", som angir banen til mappen der eksperimentet er lagret, og klikk "Last eksperimentet".
- Kjøre Logg filkonverteringsprogrammet å omdanne lastet bildene i et format som kan leses av sporing (for eksperimenter lastet for første gang, dette oppi automatisk av programvaren).
- Velge en plassering for sporing av klikker på symbol (etter konvertering, en oversikt over plasseringer under forsøkene vises i "posisjon layoutvinduet"). Hver posisjon representeres ved et symbol som består i et bilde av plasseringen og det tilsvarende (se figur 1).
- Når plasseringen er valgt og en liste over de tilgjengelige bildene vises til høyre for "posisjon layoutvinduet", merker du dem og klikker "Load images".
- Når innlastingen er fullført og "Celle redigeringsvinduet" vises, Velg bølgelengder og bilde intervall spores i "Celle redigeringsvinduet". Bølgelengde 0 tilsvarer brightfield, 1 tilsvarer FITC, 2 til Cy3, og 3 DAPI. I eksperimentene beskrevet her, intervall 1 ble brukt, dvsalle bildene lastet. For å avklare, betyr intervall 2 lasting av hver andre bildet.
- Når bildene er lastet, gå tilbake til "posisjon layoutvinduet" og dobbeltklikk på ikonet som representerer tidligere lastet plasseringen. "Filmen" vises vinduet der enkeltcelle sporing utføres.
- Etter sporing verktøyet instruksjonene, går du til sporing. Velg 0 kanalen (tilsvarende brightfield), og justere lysstyrken og kontrasten ("Juster gamma-knappen"). Start sporing ved å trykke F2-tasten.
Merk: Under sporing merkede cellen vil bli fulgt ved å plassere musepekeren på den og trykke på "0". Celledeling, celle apoptose og tapt celle knapper er tilgjengelige til å overvåke disse bestemt celle hendelser.
5. sluttresultatet
- Når enkeltcelle sporing er fullført og avkommet identifisert, lagre eksperimentet (kategorien cellen redaktør vindu/fil / lagre gjeldende tre som) og fortsette å eksportere resultatene.
- Eksportere avstamning trær og celledata i "eksport menyen" i "Celle redigeringsvinduet". Likeledes, eksportere celle bilder og filmer via "eksport menyen" tilgjengelig via "Film vindu". Bildene, avstamning trær, data og filmer vil bli eksportert til mappen tTt arbeid.
Representative Results
Metoden beskrevet kan kritiske spørsmål om cellebiologi av flere nevrale bestander å være løst. For eksempel, har det vært mulig å overvåke utviklingen av neurogenic og oligodendrogliogenic slektslinje aNSCs7,8,14,18. Ved å spore enkelt aNSCs og deres avkom (figur 2A, B), var det mulig å demonstrere at aNSCs isolert i vitro opprettholde deres neurogenic natur, mest generere neuroblasts, og at de følger en sekvens foreslåtte i vivo19 men ikke tidligere vist på enkeltcelle nivå. Videre kultur systemet tillatt asymmetrisk celledelinger til visualiseres for første gang i aNSC avstamning fra SEZ (figur 2B), gir en unik modell for å studere NSC selvtillit fornyelse8,14. Likeledes, og uavhengig av slekten analysert, var det mulig å få verdifulle data om cellevekst, runder av divisjon celle levedyktighet og celle syklus lengde.
Figur 2. Eksempel på aNSCs isolert fra SEZ, og analyseres av live bildebehandling og enkelt celle sporing. Fase kontrast bilder viser utviklingen av klone på ulike tidspunkt (dag-h: min). Det endelige bildet tilsvarer etter bildebehandling immunocytochemistry (PICC) for Glial fibrillary Sure protein (GFAP, rød), βIII-tubulin (grønn) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå). (A) analyse av symmetrisk neurogenic trær gjennom ulike runder med forsterke divisjoner å generere etter mitotisk neuroblasts. Røde piler peker til cellene i symmetrisk trærne. Til høyre vises avstamning trærne tilsvarende kloner og generert av tTt. (B) eksempel på en stamfar generere en asymmetrisk neurogenic treet, med en gren under forsterke divisjoner å produsere neuroblasts mens den andre gir opphav til quiescent GFAP positiv cellene til en potensiell selvtillit fornyelse-hendelse. Til høyre vises avstamning treet generert av tTt. I alle avstamning trær: "N" skildrer mitotisk etter neuroblasts; "G", quiescent GFAP-positive celler. "X", celledød; og "?" en tapt celle. Skala linjen representerer 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Live bildebehandling og enkelt celle sporing analyse også gir en nøyaktig avlesning av trekkfugler kapasitet av nevrale innbyggere. Slik informasjon er Hentet fra postnatal lillehjernen astrocyttene og sendt til en scratch såret analysen20, generere informasjon om den gjennomsnittlige avstanden reist av astrocyttene når du lukker såret (Figur 3). Dessuten var det mulig å se at noen av astrocyttene delt under helbredelsesprosessen, mens andre forblir uforandret gjennom hele eksperimentet. Påfallende, synes de som delt oppfører seg mer produktive vandrende enn sine ikke-delte kolleger (reiser dobbelt så langt i gjennomsnitt). Dette fenomenet antyder en svært interessant heterogene i astrocyttene kapasitet til å danne et arr på skade som ville ha blitt utvannet ut i avlesing av en klassisk end-point analyse eksperiment.
Figur 3. Analyse av hos postnatal lillehjernen astrocyttene i en ripe sår analysen. Fase kontrast bilder skildrer såret på ulike tidspunkt (dag-h: min). Avstamning trær, generert av tTt programvare, illustrerer representant virkemåten, i cellen divisjon, av astrocyttene mens lukke såret. Histogrammet viser den gjennomsnittlige avstanden reist av astrocyttene analysert av enkeltcelle sporing (gjennomsnittlig ± S.E.M.). Skala linjen representerer 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En annen interessant funksjon av time-lapse video-mikroskopi eksperimenter er kapasiteten til å sammenligne spredning og differensiering i en celle befolkningen. Vi testet N2a celler belagt under forhold som fremmer spredning (i nærvær av 10% fosterets bovin serum (FBS)) eller differensiering (i nærvær av 0,5% FBS + 10 µM arakidonsyre). Det var mulig å følge avstamning utviklingen av disse cellene under proliferativ forhold (figur 4A), mens unike celler ikke sprer og de danner neurites (figur 4B). Bemerkelsesverdig, enkelt celle sporing tillatt kolonier med forskjellige spredning kapasiteter skilles og neurite forlengelse (og retraksjon) evalueres, gir presis og kvantitative data som kan deretter eksporteres.
Figur 4. Overvåking av N2a cellebiologi spredning (A) eller differensiering forhold (B). Fase kontrast bildene viser utviklingen av klone på ulike tidspunkt (dag-h: min). Det endelige bildet tilsvarer etter bildebehandling immunocytochemistry (PICC) for α-tubulin (grønn). (A) enkeltcelle sporing gjør runder av divisjon overvåkes, samt heterogenitet i proliferativ responsen av andre celler. Til høyre illustrerer avstamning treet generert av tTt proliferativ problemet av N2a celler. (B) celler under differensiering forhold avslutte cellen syklus og generere neurites, en prosess som kan effektivt avmålt av etter bildebehandling analyse. Enkelt celle sporing, representert ved avstamning treet til høyre, illustrerer hvordan N2a celler avslutte cellen syklus og stanse celledeling under differensiering forhold. Skala linjen representerer 50 µm.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Slutt, live bildebehandling og enkelt celle sporing er svært nyttig å overvåke morfologiske og molekylære endringer når celler sendes til omprogrammering. Live bildebehandling av postnatal astrocyttene transduced med Achaete-scute homolog 1 (Ascl1) gir verdifulle data om morfologiske endringene som oppstår under omprogrammere eller blokkeringen av celledeling når astrocyttene blir omprogrammeres (se Figur 5). Videre Ascl1 signaltransduksjon er kombinert med Albin på en konstruksjon koding for grønne fluorescens protein (GFP) under den doble Cortin (DCX) kontrollen, er det mulig å definere nøyaktige tidspunktet når neuronal spesifikke indikatorer Begynn å bli uttrykt i omprogrammeres cellene (figur 5). Time-lapse video-mikroskopi kan også antall celler som fullfører reprogrammering å være kvantifisert og forhold til cellene dør under denne prosessen. Overvåke slike hendelser førte til identifisering av kritiske "sjekkpunkter" i cellene som var vellykket omprogrammeres9.
Figur 5. Analyse av postnatal kortikale astrocyttene utsatt for neuronal omprogrammering. Omprogrammere ble indusert ved signaltransduksjon med pro-neurogenic Ascl1-rød fluorescens protein (RFP) vektorer. Neuronal konvertering ble overvåket av co signaltransduksjon med en vektor koding GFP under kontroll av en DCX promoter. Fase kontrast bilder viser utviklingen av omprogrammering på ulike tidspunkt (dag-h: min). Fluorescens bilder RFP og GFP uttrykk, henholdsvis. Live bildebehandling og enkelt celle sporing avgjørende hendelser følges, for eksempel morfologiske endringer, fravær av cellen divisjon under reprogramming, celledød, og det akkurat den gangen da omprogrammeres celler begynner å uttrykke neuronal markører kan defineres . Skala linjen representerer 80 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
En av de viktigste verdiene av live bildebehandling er muligheten til å utføre nøyaktig avstamning sporing, Klargjørende kritiske aspekter av slekten progresjon i en neural befolkning. Avstamning sporing defineres som identifikasjon og overvåkning av alle avkom av en enkelt stamfar, fra grunnleggeren av klone til etterfølgende klonen dannet21. Bemerkelsesverdig, alternative metoder ansatt avstamning sporing (f.eks, viral signaltransduksjon eller flerfarget reporter konstruksjoner21) har en viktig ulempe, der sluttresultatet er basert på stillbilder og det gjør ikke nødvendigvis utgjør hele sekvensen. Dette betyr at celledød, heterogenitet i atferden til celle befolkningen, fortynning, spre eller dårlig effektiviteten av markører, sammen med andre viktige handicap, føre til ufullstendig eller feil read-outs av resultater2. Videre gjør live bildebehandling forskeren analysere viktige funksjoner i biologi nevrale befolkninger, som modus og timing av cellen divisjon, cellevekst, migrasjon, spredning versus differensiering, celle syklus lengde, neurite formasjon, kompleksitet og lengde, celle skjebne utvalget (differensiering) eller konvertering (omprogrammering).
I tillegg live bildebehandling kan suppleres lett med andre analyse skal hente data fra enkeltceller som for eksempel RNA sekvensering. For å oppnå kombinert nytte både live bildebehandling og andre teknikker krever imidlertid at disse cellene tidligere overvåket i filmene re identifisert og individuelt samlet for sekundære analysen. Dette kan oppnås ved bruk av mikroskop med posisjonelle koordinater, ved å bruke fluorescerende journalister for bestemte celler eller analysere fordelingen av grupper av celler som referanser. Faktisk, kombinasjonen av transcriptome profilen og virkemåten til enkeltceller kan representere en kraftig rute å belyse nye molekylær stikkordene involvert i biologi av celler.
En av de viktigste problemene som kan kompromittere en live bildebehandling eksperiment er en utilstrekkelig celle kultur tetthet. Som indikert tidligere, på høy tetthet kan overskytende av rusk eller dårlig dissosiasjon (klump formasjon) påvirke kvaliteten og romlig oppløsning på bilder, gjør enkeltcelle sporing unfeasible. Derfor skal vilkårene i ulike celle populasjoner under studien justeres til det laveste antallet celler mulig kompromiss levedyktigheten til cellekultur.
Hyppigheten av bildeopptak er også avgjørende og skal være nøye tilpasset, spesielt når fluorescens belysning brukes. Overeksponering sendt og spesielt fluorescens lys kan kompromittere celle levedyktighet. Lang ventetid mellom fangst av bildene kan eventuelt forstyrre timelige oppløsningen til analysen.
En annen avgjørende skritt under live bildebehandling eksperimentet er periodiske justering av fokus. Feil i den riktige innstillingen/re-setting av fokus avstand kan hindre enkeltcelle sporing. Videre er det nødvendig å nøye sjekke at inkubasjon kammeret beholder tilstrekkelig temperatur, fuktighet og CO2 nivåer, endring uønskede varianter som kan indusere celledød.
Til slutt, når PICC er utført, er det viktig å hente riktig xyz null posisjon før den siste runden av bildeopptak. Feil re-setting av xyz nullstilling vil gjøre det vanskelig å matche fase kontrast og immunofluorescence bilder, hindrer identifikasjon av cellen avkommet.
Selv om denne tilnærmingen har mange positive fasetter, hardnakkethet noen begrensninger på live bildebehandling av nevrale befolkninger fremdeles. For eksempel gjør lav celle tetthet kreves for å utføre vellykkede enkeltcelle sporing av aNSCs det umulig å ansette biokjemiske analyser, for eksempel Western blotting14. I tillegg, overvåking raskt dele populasjoner som lillehjernen astrocyttene eller N2a celler er timelig begrenset som det er for vanskelig å spore celler som kulturer nær samløpet. Videre kompromiss mange kultur metoder, i tillegg til de iboende biologiske begrensningene knyttet til isolering av celler, ofte celle levedyktighet over lengre perioder, begrense varigheten av live bildebehandling eksperimenter. Til slutt, isolere celler fra naturen har både positive og negative effekter. Cellene isolert fra sine fysiologiske nisje kan ikke motta viktige signaler som modulerer deres atferd, mens på samme tid, den representerer en kraftig måte å teste effekten av disse signalene individuelt i avstamning utviklingen av nevrale bestander.
Gitt begrensningene beskrevet ovenfor, er det klart at det perfekte metodologiske scenarioet vil være å utføre live bildebehandling og enkelt celle sporing eksperimenter under normale fysiologiske forhold i vivo. Gjeldende teknikker er imidlertid ikke følge enkeltceller i lange perioder i dype områder av hjernen2. Derfor bør fremtidens live bildebehandling fokusere på å overvinne denne begrensningen, satsing å fullt analysere cellebiologi på enkeltceller i vivo med mest mindre interferens mulig av fysiologiske miljø3.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Beatriz Gascon for hennes assistanse og kunst arbeid i figur 1. Vi takker også Dr. C. Norris for hans hjelp. Arbeidet presentert her ble støttet av forskningsmidler, "røde de excelencia consolidar-Ingenio spansk Ion kanal initiativ" (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE CM (S2013/is-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) og Fundación Ramon Areces Grant program (PR2018/16-02). Felipe Ortega erkjenner Ramon y Cajal Program av det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne (MEC: RYC-2013-13290).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
| 24 wells plate | Falcon | 352047 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
| DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
| Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
| Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
| Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
| Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
| Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
| Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
| Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
| CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
| CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
| pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
| 310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
| Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
| High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
| Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
| OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
| Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
| HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |
References
- Conklin, E. G. The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology. Science. 21 (536), 525-529 (1905).
- Ortega, F., Costa, M. R. Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents. Front Neurosci. 10, 78 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Schroeder, T. Tracking hematopoiesis at the single cell level. Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. Quantitative single-cell approaches to stem cell research. Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).
- Ortega, F., et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling. Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Gascon, S., et al. Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).
- Kleiderman, S., et al. Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma. Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).
- Bunk, E. C., et al. Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone. Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).
- Aravantinou-Fatorou, K., et al. CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons. Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).
- Jimenez, A. I., et al. Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes. Glia. 26 (2), 119-128 (1999).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
