Summary
Ett robust protokoll att övervaka neurala populationer av time-lapse video-mikroskopi följt av mjukvaran-baserat efterbehandling beskrivs. Denna metod utgör ett kraftfullt verktyg för att identifiera biologiska händelser i en vald population under levande imaging experiment.
Abstract
Förstå de mekanismer som styr viktiga biologiska händelser av neurala cellpopulationer, såsom proliferation, differentiering eller cell öde beslut, kommer att vara avgörande för design terapeutiska strategier för många sjukdomar som påverkar nervsystemet. Nuvarande metoder för att spåra cellpopulationer lita på deras slutliga utfallen i stillbilder och de i allmänhet misslyckas att ge tillräcklig temporal upplösning att identifiera beteendemässiga dragen i enstaka celler. Dessutom variationer i celldöd, beteendemässiga heterogenitet inom en cell befolkningen, utspädning, sprida eller låga effektivitet av de markörer som används för att analysera celler är alla viktiga nackdelar som leder till ofullständig eller felaktig Läs-outs av resultaten. Däremot utgör utför live imaging och enda cell spårning under lämpliga förhållanden ett kraftfullt verktyg för att övervaka alla dessa händelser. Här beskrivs en time-lapse video-mikroskopi protokollet, följt av efterbearbetning, för att spåra neurala populationer med enstaka cell upplösning, anställa särskild programvara. De metoder som beskrivs ge forskarna möjlighet att ta itu med viktiga frågor angående cell biologi och härstamning progressionen av distinkta neurala populationer.
Introduction
För att utveckla nya och mer effektiva behandlingsstrategier för att regenerera neurala populationer, måste vi först förstå de grundläggande mekanismer som upprätthåller celler med regenerativ neurala potential. Detta mål kräver omfattande kunskap av de faktorer som reglerar balansen mellan rofylld, spridning/differentiering, läge och timing av cellcykelns längd, livskraft, flyttande kapacitet, division, etc. Även om det är en teknisk metod som har använts i många år1, live imaging och rikta observationen fortfarande det bästa alternativet för att övervaka händelser som anges ovan. I motsats till många andra metoder centrerad på slutpunkten utläsningar, live imaging och enda cell tracking informera hela längd av ett experiment2,3,4,5, 6. således tillägg av temporal upplösning tillåter celldöd, heterogena cell beteende eller cell öde beslut, liksom många andra kritiska händelser identifieras som annars skulle passera obemärkt. Dessa egenskaper hos celler monitoreras helst bäst vid den enda cell nivå in vivo där båda inneboende (cell autonoma) och yttre (cell nisch) signaler beaktas.
Dock även om in vitro- situationen händelser inträffar i en miljö som inte reproducera den naturliga miljön, de låg densitet odlingsbetingelser som normalt används i dessa protokoll är mer lämpade att avslöja inneboende egenskaper hos de celler. Dessutom kan en mer förenklad kontroll av den omgivande miljön, genom att helt enkelt ändra odlingsmedium, utgöra ett värdefullt verktyg för att undersöka individuella roll varje exogena faktor som definierar den neurala nischen, samt miljöfaktorer som kan induceras i patologiska scenarier7,8,9,10,11,12,13. Därför, när korrekt konfigurerade, som i protokollet föreslås här, levande imaging ger en genomförbar in vitro- lösning för att hantera de flesta av de frågor som tidigare räknats upp.
Det här protokollet beskriver i korthet, maskinvara, programvara, odlingsbetingelser och de viktigaste stegen som krävs för att framgångsrikt utföra ett levande imaging experiment följt av enstaka cell tracking. Detta tillvägagångssätt ger värdefull information som hjälper till att avslöja grundläggande aspekter av biologi och härstamning progressionstakt, av flera neurala populationer.
Protocol
I följande avsnitt beskrivs de steg som krävs för att utföra live imaging följt av enstaka cell spårning av flera neurala populationer (figur 1). Alla förfaranden som involverar djur som beskrivs i detta protokoll måste vara utförs i enlighet med riktlinjerna i internationella rådet för Laboratory Animal Science (ICLAS).
Figur 1. Systemet som illustrerar de viktigaste experimentella steg av förfarandet, dvs.: cell kultur, levande imaging, PICC och datainsamling, enda cell spårning och det slutliga resultatet. Stegen är numrerade enligt arbete-flödet av protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. cell kultur: Isolering och plätering av den valda neurala befolkningen eller Cell härstamning
Obs: I samband med detta protokoll ges exempel på dess tillämpning på olika cellpopulationer att validera sin verktyg för att analysera biologiska neurala celler. Dessa inkluderar: neurala stamceller (aNSCs) härrör från musen subependymalt zon (SEZ) (för en detaljerad isolering protokoll se14); Postnatal kortikala astrocyterna att studera neuronala omprogrammering (för en detaljerad isolering protokoll se15); Postnatal cerebellär astrocyter (för en detaljerad isolering metod se16); och mus Neuro-2a neuroblastom cellinje (N2a).
- Utsäde cellerna direkt belagd på poly-D-lysin 24 brunnar. Använd 1 mL odlingsmedium per brunn. Inkubera plattorna vid 37 ° C och 8% CO2 för aNSCs, eller vid 37 ° C och 5% CO2 för astrocyter deponicell raden för 2 h före levande imaging. Undvika användning av coverslips att förhindra oönskad rörelse som motoriserade Mikroskop scenen är fördrivna vilket gör enstaka cell tracking ogenomförbara.
Obs: Cell tätheter och kultur media företagare i experiment är: 30-40.000 celler per brunn för aNSCs i Dulbecco ändrade örnens medium (DMEM:F12 näringsämne blandning medium); 20 000 celler per brunn för N2a celler DMEM hög glukos medellång, 80 000 celler per brunn för cerebellär astrocyter i DMEM hög glukos medium; och 55-65 000 celler per brunn för postnatal astrocyter i DMEM:F12 näringsämne blandning medium. - Standardisera protokollet kultur genom att justera cell densiteten av kultur till lägsta antalet celler som möjligt. Ändå måste cell densiteten vara tillräckligt hög för att upprätthålla livskraften i kulturen.
Obs: Om cell densiteten är för hög, den överflödigt skräp eller dålig dissociation (klumpar) kan hindra spårning av enstaka celler.
2. leva Imaging av Time-lapse Video-mikroskopi
- Slå på Mikroskop, kamera, hårdvara och inkubation systemen. Ställa in temperatur och lufttryck till 37 ° C och 8% CO2 för aNSCs eller till 37 ° C och 5% CO2 för astrocyter/cell-linjen. Låt temperaturen och CO2 nivåer för att stabilisera för 1-2 h.
Obs: Särskild utrustning krävs för att utföra time-lapse video analys, inklusive: ljusa fält/fas kontrast/fluorescens Mikroskop med motordrivna komponenter; inkubation enheter som styr temperatur, CO2 och luftfuktighet; och slutligen pålitlig och tillräckligt kraftfull hårdvara och mjukvara kan förvärva och hantering av bilder som erhållits under levande imaging experiment (Vänligen kontrollera Tabellen för material). - När cellerna är ordentligt fastsatt på plattan (2 h efter plätering), använda en permanent tuschpenna för att göra ett litet märke på botten av en brunn som inte kommer att användas för att spåra, dvs en brunn som inte innehåller celler.
Obs: Denna mark kommer att användas som en referens till noll i xyz-koordinater, och det kan användas när som helst under eller efter experimentet eller mellan ändringarna av medium, att återvända till nollpunkt. - Placera plattan inuti mikroskopets inkubation kammare och sätt fast plattan till scenen för att undvika oönskad rörelse under förskjutningen av mikroskopets motoriserad scenen.
- Låt temperaturen på den cellodlingsmedium temperera i kammaren för ca 20 min. Detta steg kommer att undvika en förlust av fokus under inspelningen på grund av dilatation av komponenter.
- Starta live-imaging programvaran och välj time-lapse modulen för att ställa in experimentet.
- Ställa in varaktigheten för experimentet och bild förvärv cykler på flikmenyn ”tidsplan”. På grund av den inneboende fototoxicitet av den överförda eller fluorescens ljus används, definiera ett adekvat intervall att balansera mellan den temporal upplösningen av analysen och den potentiella celldöd.
Obs: till exempel 120 h totalt valdes för aNSC kulturer, förvärva brightfield bilder varje 5 min. överväga att förvärvet 120 h av en enda film i den här konfigurationen kräver 120-150 gigabyte gratis lagringsutrymme i datorn enheten. - Välj bild befattningarna som definieras av x och y koordinater och brännvidd (z koordinaten) i den ”xyz punkter tab menyn”. Inkludera referenspunkten (xyz noll koordinat) som inledande position för att hämta koordinaterna helst.
- Välj typ av förvärv i ”våglängd fliken Urvalsmenyn”, brightfield bara eller i kombination med epifluorescence magnetisering när det behövs. Välj exponeringstiden. Ha i åtanke att överexponering för överförs, och särskilt fluorescerande ljus, kan äventyra cellernas viabilitet (enligt ovan).
- För aNSCs, cerebellär astrocyter och N2a celler, markera brightfield (10-50 ms exponeringstiden).
- För sensorik kortikala astrocyter väljer brightfield (10-50 ms exponeringstid) i kombination med röd/grön fluorescens, beroende av reporter används för experimentet (röda excitation våglängd: 550 nm och 400 ms exponeringstid; grön magnetisering våglängd: 460-500 nm och 100 ms exponeringstid).
- Definiera namnet på experimentet och mappen där bilderna ska sparas. Spara listan över positioner att ladda experimentet när som helst, och när alla villkor har ställts in, köra experimentet genom att klicka på knappen ”Kör nu”.
- Pausa experimentet och justera fokus villkoren att klicka på ”Skriv över z-knappen” en gång per dag tills experimentet är slutförd. Om ändringar i mediet krävs under den levande imaging, pausa experimentet och hämta plattan från time lapse kammaren.
Obs: Ändringar i mediets på grund av celldöd eller överdriven proliferation pH, samt variationer i rumstemperatur, kan påverka den rätt fokusering av mikroskopet på cellerna. För känsliga kulturer (såsom aNSCs) rekommenderar vi användning av medium kompletteras med 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) (slutlig koncentration: 1 mM).
3. efter imaging immuncytokemi (PICC), datainsamling och bearbetning
- När experimentet slutförts, pausa programmet och hämta plattan för fixering och PICC, som beskrivs i nästa steg.
- Utföra cell fixering: tvätta cellerna en gång med 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 500 µL av PARAFORMALDEHYD (PFA) (4% i PBS), ruvning och 10 min i rumstemperatur (RT).
FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är en stark fixativ och bör behandlas varsamt för att undvika kontakt med hud eller ögon. Det måste manipuleras endast inuti ett dragskåp. - Tvätta cellerna tre gånger med 1 mL PBS och tillsätt 500 µL blockerande lösningen (PBS som innehåller 2% (wt/vol) av bovint serumalbumin (BSA) och 0,2% (vol/vol) av en icke-jonisk tensid). Inkubera i 1 h på RT.
- Ta bort blockering lösningen och tillsätt 250-400 µL av den primära antikroppar lösningen. Inkubera 2 h på RT. Den primära antikroppar lösningen innehåller primära antikroppar utspätt i PBS som innehåller 2% (wt/vol) av BSA och 0,2% (vol/vol) av en icke-jonisk tensid. Antikroppar som används i de experiment som beskrivs här: Fredsgenomförande (1: 500), βIII-tubulin (1:1, 000) och α-tubulin (1:1, 000). Större volymer av lösningarna som krävs i detta utförs direkt i brunnen, (250-400 µL) att täcka alla celler.
- Tvätta tre gånger med 1 mL PBS och tillsätt 250-400 µL av den sekundära antikroppar lösning (utspädd enligt steg 3,4). Sekundära antikroppar används i de experiment som beskrivs här: antimus Fluorescein (FITC) (1:800), anti-kanin Cy3 (1: 500). Inkubera i 1 h på RT i mörkret.
- Tvätta tre gånger i 1 mL PBS. Hålla cellerna i 1 mL PBS för de efterföljande stegen i protokollet.
- Placera plattan tillbaka på Mikroskop scenen och sätt fast det scenen för att undvika oönskad rörelse under förskjutningen av motoriserad Mikroskop scenen.
- Hämta xyz nolläge med hjälp av märket i steg 2.2 och åter-ställa ståndpunkterna som denna referenspunkt genom att trycka på knappen ”Offset alla X, Y, Z”. Åter-ställa brännvidd för varje position.
- Förvärva en sista omgång bilder, konfigurera de nödvändiga villkoren för fluorescens utsläpp ”våglängd fliken valmenyn” för att upptäcka de antigener som tidigare riktade i PICC.
- Kort, förutom brightfield, aktivera FITC (Excitation: 495 nm) och Cy3 (Excitation: 550 nm) förvärv alternativ i programvaran. Använd 10-50 ms för brightfield 400 ms exponering för att upptäcka fluorophores och tryck på knappen ”1 tid loop”, att förvärva en sista omgång bilder.
Obs: Intensiteten av fluorescensen kan skilja sig beroende på PICC resultatet. Justera exposition för att erhålla optimal bildkvalitet.
- Kort, förutom brightfield, aktivera FITC (Excitation: 495 nm) och Cy3 (Excitation: 550 nm) förvärv alternativ i programvaran. Använd 10-50 ms för brightfield 400 ms exponering för att upptäcka fluorophores och tryck på knappen ”1 tid loop”, att förvärva en sista omgång bilder.
- Välj programvarans Arkiv/Exportera och exportera bilderna i Tagged Image File Format (Tiff) eller Joint Photographic Experts Group (JPEG-) format till en fördefinierad destination broschyren.
- Konvertera bilder exporteras till det format som krävs av mjukvara: med Tracking Tool17 (tTt). För att uppnå detta, definiera input och output mapp i den ”tTt Converter verktyg” löpande fönster, liksom de markörer som används för positioner (xy), kanaler (c) och tidpunkter (t), och tryck på knappen ”konvertera bilder”.
Obs: Bilderna måste döpas i enlighet med specifika inställningar och de måste lagras i enskilda mappar för varje position som används i experimentet. Instruktioner för installation, krav, byta namn på positioner/bilder och användning av verktyget spårning finns att hämta på: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html.
4. enda Cell Tracking
- Efter namnbytet data, kör programvaran tTt. Välj ett namn och tTt arbete användarmapp.
Obs: Spårning verktyg arbetsmapp kommer att hålla alla de analyserade data och exporterade resultaten. Mappen arbete måste ha namnet tTtexport, som innehåller undermappar som heter ”AVIexport”, ”Configs”, ”TreeExport” och ”tTtfiles”. - Välj experimentet som ska läsas in i ”Välj experiment mappfönstret”, som anger sökvägen till mapp där experimentet lagras, och klicka sedan på knappen ”Ladda experiment”.
- Kör log fil converter för att omvandla de inlästa bilderna till ett format som kan läsas av mjukvara (för experiment laddad för första gången, detta kommer att begäras automatiskt av programvara).
- Välj en position för spårning genom att klicka på dess symbol (efter konvertering, en översikt av de positioner som noterats under experimenten kommer att visas i fönstret' position layout'). Varje position kommer att representeras av en symbol som består av en bild av positionen och dess motsvarande nummer (se figur 1).
- När positionen har valts och en lista över tillgängliga bilder visas till höger om fönstret' position layout', markera dem och klicka på knappen ”Hämta bilder”.
- När inläsningen är klar och fönstret' Cell Editor' visas, Välj våglängder och bild intervall spåras i fönstret' Cell Editor'. Våglängd 0 motsvarar till brightfield, 1 motsvarar FITC, 2 till Cy3, och 3 att DAPI. I de experiment som beskrivs här, intervall 1 användes, dvsalla bilder laddas. För att förtydliga, innebär intervall 2 lastning av varje andra bilden.
- När bilderna har laddats, gå tillbaka till fönstret ”position layout” och dubbelklicka på ikonen som representerar den tidigare inlästa ståndpunkten. Fönstret' film' visas som gör den enda cell spåra ska utföras.
- Efter spårning verktyg instruktionerna, gå vidare till spårning. Välj 0 kanal (motsvarande brightfield) och justera ljusstyrka och kontrast (”justera gamma knappen”). Starta spårning genom att trycka på F2.
Obs: Under spårning, spårade cellen kommer att följas genom att placera muspekaren på den och trycka på ”0”. De celldelning, cell apoptos och förlorade cell knappar finns att övervaka händelserna viss cell.
5. slutresultatet
- När enstaka cell tracking har slutförts och avkomman identifieras, spara experimentet (fliken Cell redaktör fönster/Arkiv / Spara nuvarande träd som) och fortsätt att exportera resultaten.
- Exportera härstamning träd och celldata i ”menyn exportera” ligger i fönstret' Cell Editor'. Jämväl, exportera cell bilder och filmer via menyn ”Export” nås via fönstret' film'. Bilder, härstamning träd, data och filmer kommer att exporteras till mappen tTt arbete.
Representative Results
Den beskrivna metoden kan kritiska frågor om cellbiologi av flera neurala populationer som måste lösas. Exempelvis har det varit möjligt att övervaka utvecklingen av neurogen och oligodendrogliogenic härstamning aNSCs7,8,14,18. Genom att spåra enda aNSCs och deras avkomma (figur 2A, B), det var möjligt att påvisa att aNSCs isolerade i vitro upprätthålla deras neurogen karaktär, mestadels genererar neuroblasts, och att de följer en sekvens som föreslås i vivo19 men inte tidigare visat på enstaka cellnivå. Dessutom detta kultur system tillät asymmetrisk celldelningar till visualiseras för första gången i aNSC härstamning från SEZ (figur 2B), som tillhandahåller en unik modell för att studera NSC självförnyelse8,14. Jämväl, och oavsett härstamning analyseras, var det möjligt att få värdefulla data angående celltillväxt, rundor av division, cellernas viabilitet eller cellcykelns längd.
Figur 2. Exempel på aNSCs isolerade från SEZ, och analyseras av levande imaging och enda cell tracking. Fas kontrast bilderna skildrar utvecklingen av klonen vid olika tidpunkter (dag-h: min). Den slutliga bilden motsvarar den efter imaging immuncytokemi (PICC) för Glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande, röd), βIII-tubulin (grön) och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, blå). (A) analys av symmetriska neurogen träd igenom olika rundor av förstärkande divisioner att generera efter mitotiska neuroblasts. Röda pilarna pekar på de celler som ingår i symmetriska träden. Till höger visas härstamning träden motsvarar klonerna och genereras av tTt programvaran. (B) exempel på en stamfader som genererar en asymmetrisk neurogen träd, med en gren som genomgår ljudförstärkande divisioner för att producera neuroblasts medan den andra ger upphov till quiescent Fredsgenomförande positiva celler genom en potentiell självförnyelse händelse. Till höger visas härstamning trädet genereras av tTt programvaran. I alla härstamning träd: ”N” skildrar efter mitotiska neuroblasts; ”G”, quiescent Fredsgenomförande-positiva celler. ”X”, celldöd; och ””? en förlorad cell. Skalstapeln representerar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Bor imaging och enda cell tracking analys också ger en exakt avläsning av en neurala befolkning flyttande kapacitet. Sådan information erhölls från postnatal cerebellär astrocyter in till en scratch såret assay20, generera information om den genomsnittliga sträcka av astrocyterna när stängningsen såret (figur 3). Dessutom var det möjligt att se att några av astrocyterna uppdelad under läkningsprocessen, medan andra förblir oförändrat under hela försöket. Påfallande, verkar de som delat uppvisar mer produktiv flyttande beteende än sina icke-dividera motsvarigheter (resor dubbelt så långt i genomsnitt). Detta fenomen tyder på en mycket intressant heterogenitet i astrocyterna kapacitet att bilda ett ärr vid skada, som skulle har spätts ut i avläsning av ett klassiskt slutpunkten analys experiment.
Figur 3. Analys av flyttande uppförandet av postnatal cerebellär astrocyter i en repa såret assay. Fas kontrast bilderna skildrar såret vid olika tidpunkter (dag-h: min). Lineage träd, genereras av tTt programvara, illustrera den representativa beteenden, i form av celldelning, av astrocyterna samtidigt stänga såret. Histogrammet visar den genomsnittliga avståndet reste av astrocyterna analyseras av enstaka cell tracking (medelvärde ± S.E.M.). Skalstapeln representerar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
En annan intressant funktion av time-lapse video-mikroskopi experimenten är förmågan att jämföra proliferation och differentiering i en cell befolkningen. Vi testade N2a celler pläterade villkor som främjar spridning (i närvaro av 10% fetalt bovint serum (FBS)) eller differentiering (i närvaro av 0.5% FBS + 10 µM arakidonsyra). Det var möjligt att följa härstamning utvecklingen av dessa celler under proliferativa förhållanden (figur 4A), medan särskiljande cellerna inte föröka sig och bildar de neuriter (figur 4B). Anmärkningsvärt, enda cell tracking tillåtna kolonier med olika spridning kapacitet skiljer sig och neurite töjning (och retraktion) utvärderas, som tillhandahåller exakta och kvantitativa data som sedan kan exporteras.
Figur 4. Övervakning av N2a cellbiologi inom spridning (A) eller differentiering villkor (B). Fas kontrast bilder skildrar utvecklingen av klonen vid olika tidpunkter (dag-h: min). Den slutliga bilden motsvarar den efter imaging immuncytokemi (PICC) för α-tubulin (grön). (A) enda cell tracking gör rundor av division övervakas, liksom heterogenitet i proliferativ svaret av olika celler. Till höger illustrerar härstamning trädet genereras av tTt programvaran proliferativ beteendet för N2a celler. (B) celler differentiering villkor avsluta cellcykeln och generera neuriter, en process som effektivt kan mätas efter imaging analys. Single cell tracking, företrädd av härstamning trädet till höger, illustrerar hur N2a celler avsluta cellcykeln och stoppa celldelning differentiering villkor. Skalstapeln representerar 50 µm.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Slutligen, live imaging och enda cell tracking är mycket användbart att övervaka morfologiska och molekylära förändringar när celler utsätts för omprogrammering. Levande avbildning av postnatal astrocyter sensorik med Achaete-fjäll homolog 1 (Ascl1) ger värdefulla data angående de morfologiska förändringar som sker under omprogrammering eller blockering av celldelning när astrocyter omprogrammerade (se Figur 5). Dessutom när Ascl1 transduktion kombineras med transduktion av en konstruktion kodning för grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av promotorn dubbel Cortin (DCX), är det möjligt att fastställa den exakta tidpunkten när neuronala specifika markörer börja uttryckas i Omstyrda celler (figur 5). Time-lapse video-mikroskopi kan också antalet celler som framgångsrikt Slutför omprogrammering för att kvantifieras och jämfört med de celler som dör under denna process. Övervaka sådana händelser ledde till identifiering av kritiska ”kontrollstationer” i celler som var framgångsrikt omprogrammerade9.
Figur 5. Analys av postnatal kortikala astrocyter utsätts neuronala omprogrammering. Omprogrammering förmåddes genom transduktion med pro-neurogen Ascl1-röd fluorescens protein (RFP) vektorer. Neuronala konvertering övervakades av samtidig transduktion med en vektor som kodning GFP under kontroll av en DCX promotor. Fas kontrast bilderna visar utvecklingen av omprogrammering vid olika tidpunkter (dag-h: min). Fluorescens bilder av RFP och god Jordbrukarsed uttryck, respektive. Leva imaging och enda cell tracking får avgörande händelser som ska följas, såsom morfologiska förändringar, avsaknad av celldelning under omprogrammering, celldöd, och den exakta tidpunkten när Omstyrda celler börjar uttrycka neuronala markörer kan definieras . Skalstapeln representerar 80 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
En av de viktigaste värdena för levande imaging är möjligheten att utföra korrekta lineage tracing, belysa kritiska aspekter av härstamning progression i en neurala befolkning. Lineage tracing definieras som identifiering och övervakning av alla avkomman av en enda progenitor, från grundaren av klonen till efterföljande klonen bildade21. Anmärkningsvärt, alternativa metoder som används för lineage tracing (t.ex., viral transduktion eller multicolor reporter konstruktioner21) har en kritisk nackdel, whereby det slutliga resultatet bygger på stillbilder och det inte nödvändigtvis utgör hela sekvensen. Detta innebär att celldöd, heterogenitet i beteendet hos cell befolkningen, utspädning, sprida eller dålig effektivitet av markörer, tillsammans med andra viktiga nackdelar, leda till ofullständig eller felaktig Läs-outs av resultat2. Dessutom live imaging gör det möjligt för forskaren att analysera viktiga funktioner i biologin av neurala populationer, till exempel mode och tidpunkten för cell division, celltillväxt, migration, proliferation kontra differentiering, cellcykelns längd, neurite bildning, komplexitet och längd, cell öde urval (differentiering) eller konvertering (omprogrammering).
Dessutom live imaging enkelt kan kompletteras med andra analys avsedda att få uppgifter från enstaka celler såsom exempelvis RNA-sekvensering. För att uppnå kombinerade nytta både levande imaging och andra tekniker kräver dock att de celler som tidigare övervakas i filmer senare åter identifieras och individuellt samlat för sekundär analys. Detta kan uppnås med hjälp av Mikroskop som inkluderar positionella koordinater, genom att tillämpa fluorescerande reportrar för specifika celler eller analysera fördelningen av grupper av celler som referenser. Faktiskt, kombinationen av transkriptom profilen och uppförande av enskilda celler kan utgöra en kraftfull rutt att belysa nya molekylära signaler inblandade i biologin av celler.
En av de huvudsakliga problem som kan äventyra ett levande imaging experiment är en otillräcklig celldensitet kultur. Som nämnts tidigare, på hög densitet kan överskottet av skräp eller dålig dissociation (dunge bildande) påverka kvalitet och rumslig upplösning på bilderna, vilket gör enstaka cell tracking omöjligt. Villkoren för de olika cellpopulationer under utredning bör därför, justeras till lägsta antalet celler som möjligt utan att äventyra lönsamheten för cellkulturen.
Frekvensen av bild förvärv är också avgörande och bör justeras noggrant, särskilt när fluorescens belysning används. Överexponering för överförda och särskilt fluorescens ljus kan äventyra cellernas viabilitet. Alternativt kan en överdriven fördröjning mellan att fånga bilder störa den temporal upplösningen av analysen.
En annan avgörande steg under levande imaging experimentet är periodiska justering av fokus. Fel i den rätta inställningen/re-setting av av brännvidd kan hindra enda cell tracking. Dessutom är det nödvändigt att noggrant kontrollera att inkubation kammaren bevarar tillräcklig temperatur, luftfuktighet och CO2 nivåer, om ändring av oönskade variationer som kan inducera celldöd.
Slutligen, när PICC har utförts, är det viktigt att korrekt Hämta xyz noll positionen före den sista omgången av bild förvärv. Felaktiga vittjning av xyz utgångsläget blir det svårt att matcha faskontrast och immunofluorescens bilderna, hindrar identifieringen av cell avkomman.
Även om detta tillvägagångssätt har många positiva aspekter, kvarstår vissa begränsningar för den levande imaging av neurala populationer. Exempelvis gör låg cell densiteten krävs för att utföra framgångsrika enda cell spårning av aNSCs det omöjligt att anställa biokemiska analyser, såsom Western blotting14. Dessutom övervaka att snabbt dela populationer som cerebellär astrocyterna eller N2a celler är temporally begränsad eftersom det är ofta svårt att spåra celler som kulturerna nära sammanflödet. Dessutom kompromissa många kultur metoder, liksom de inneboende biologiska begränsningar som är associerad med isolering av celler, ofta cellviabilitet över långa perioder, begränsning av de levande imaging experiment. Slutligen, isolera cellerna från deras naturliga miljö har både positiva och negativa effekter. Celler som isolerats från sin fysiologiska nisch kan misslyckas att ta emot viktiga signaler som modulera deras beteende, medan på samma gång, det utgör ett kraftfullt medel för att testa effekten av dessa signaler individuellt i härstamning förloppet av specifika neurala populationer.
Begränsningarna ovan är, det klart att den perfekta metodologiska scenariot skulle vara att utföra live imaging och enda cell tracking experiment under normala fysiologiska förhållanden i vivo. Aktuella tekniker är dock oförmögen att följa enstaka celler för långa perioder i djupa regioner av hjärnan2. Framtiden för levande imaging bör därför fokusera på att övervinna denna begränsning, som syftar till att fullt ut analysera cellbiologi enstaka celler i vivo med mest mindre störningar möjliga av fysiologisk miljö3.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Beatriz Gascon för hennes hjälp och konst arbete i figur 1. Vi tackar också Dr C. Norris för hans hjälp. Arbetet presenteras här stöddes av forskningsanslag, ”röda de excelencia Consolider-Ingenio spanska jonkanal initiativet” (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/ICE-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) och Fundación Ramon Areces Grant program (PR2018/16-02). Felipe Ortega bekräftar Ramon y Cajal Program av spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (MEC: RYC-2013-13290).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
| 24 wells plate | Falcon | 352047 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
| DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
| Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
| Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
| Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
| Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
| Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
| Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
| Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
| CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
| CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
| pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
| 310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
| Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
| High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
| Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
| OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
| Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
| HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |
References
- Conklin, E. G. The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology. Science. 21 (536), 525-529 (1905).
- Ortega, F., Costa, M. R. Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents. Front Neurosci. 10, 78 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Schroeder, T. Tracking hematopoiesis at the single cell level. Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. Quantitative single-cell approaches to stem cell research. Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).
- Ortega, F., et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling. Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Gascon, S., et al. Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).
- Kleiderman, S., et al. Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma. Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).
- Bunk, E. C., et al. Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone. Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).
- Aravantinou-Fatorou, K., et al. CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons. Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).
- Jimenez, A. I., et al. Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes. Glia. 26 (2), 119-128 (1999).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
