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Neuroscience

लाइव इमेजिंग सेल जीव विज्ञान की निगरानी और एकाधिक तंत्रिका आबादी के वंश प्रगति पर नज़र रखने के लिए एक सेल के बाद

Published: December 16, 2017 doi: 10.3791/56291
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *4,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 6, 7, 1,2,3, 1,2,3
1Biochemistry and Molecular Biology Department, Faculty of Veterinary medicine, Complutense University, 2University Institute for Neurochemistry Research (IUIN), 3Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos (IdISSC), 4Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Center Munich, Neuherberg/Munich, Germany Physiological Genomics, Biomedical Center, Ludwig-Maximilians University Munich, 5Toxicology and Pharmacology Department, Faculty of Veterinary medicine, Complutense University, 6Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 7Department of Biosystems Science and Engineering, Eidgenössische Technische Hochschule (ETH) Zurich
* These authors contributed equally

Summary

एक मजबूत प्रोटोकॉल समय के द्वारा तंत्रिका आबादी पर नजर रखने के लिए चूक वीडियो-सूक्ष्म सॉफ्टवेयर के बाद आधारित प्रसंस्करण के बाद वर्णित है । यह विधि लाइव इमेजिंग प्रयोगों के दौरान एक चयनित जनसंख्या में जैविक घटनाओं की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

Abstract

तंत्र है कि नियंत्रण महत्वपूर्ण तंत्रिका कोशिका आबादी के जैविक घटनाओं, जैसे प्रसार, भेदभाव, या सेल भाग्य निर्णयों को समझना, कई तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने के लिए चिकित्सकीय रणनीतियों डिजाइन महत्वपूर्ण हो जाएगा । वर्तमान तरीके सेल आबादी ट्रैक करने के लिए अभी भी छवियों में अपने अंतिम परिणाम पर भरोसा करते है और वे आम तौर पर पर्याप्त लौकिक संकल्प प्रदान करने के लिए एकल कोशिकाओं में व्यवहार सुविधाओं की पहचान करने में विफल । इसके अलावा, कोशिका मृत्यु में बदलाव, एक सेल जनसंख्या के भीतर व्यवहार विविधता, कमजोर पड़ने, प्रसार, या कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया मार्करों की कम दक्षता सभी महत्वपूर्ण बाधाओं कि परिणाम के अधूरे या गलत पढ़ें-बहिष्कार करने के लिए नेतृत्व करेंगे कर रहे हैं. इसके विपरीत, उपयुक्त परिस्थितियों के तहत लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग प्रदर्शन एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है इन घटनाओं में से प्रत्येक की निगरानी । यहां, एक समय चूक वीडियो-माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल, बाद प्रसंस्करण के बाद, एक सेल संकल्प के साथ तंत्रिका आबादी को ट्रैक करने के लिए वर्णित है, विशिष्ट सॉफ्टवेयर को रोजगार । तरीके वर्णित करने के लिए आवश्यक प्रश्नों के बारे में पता करने के लिए शोधकर्ताओं ने कोशिका जीवविज्ञान और विशिष्ट तंत्रिका आबादी के वंश प्रगति.

Introduction

आदेश में नए और अधिक प्रभावी चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने के लिए तंत्रिका आबादी पुनर्जंम, हम पहले बुनियादी तंत्र है कि एक अपक्षयी तंत्रिका क्षमता के साथ कोशिकाओं को बनाए रखने समझना चाहिए । इस लक्ष्य को आगे बढ़ाने के कारकों की एक व्यापक ज्ञान की आवश्यकता है कि weak, प्रसार/विभेद, मोड और विभाजन के समय के बीच संतुलन को विनियमित, सेल चक्र की लंबाई, प्रवासी क्षमताओं, व्यवहार्यता, आदि हालांकि यह एक तकनीकी दृष्टिकोण है कि कई वर्षों के लिए नियोजित किया गया है1, लाइव इमेजिंग और प्रत्यक्ष अवलोकन अभी भी सबसे अच्छा करने के लिए ऊपर सूचीबद्ध घटनाओं की निगरानी का विकल्प रहेगा । के रूप में कई अंय अंत बिंदु readouts पर केंद्रित दृष्टिकोण का विरोध किया, लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग एक प्रयोग की लंबाई भर में जानकारी प्रदान करते है2,3,4,5, 6. इस प्रकार, लौकिक संकल्प के अलावा सेल मौत, विषम सेल व्यवहार, या सेल भाग्य निर्णय की अनुमति देता है, साथ ही साथ कई अंय महत्वपूर्ण घटनाओं की पहचान की है कि अंयथा किसी का ध्यान नहीं पारित हो सकता है । आदर्श रूप में, कोशिकाओं की इन सुविधाओं को सबसे अच्छा vivo में सिंगल सेल स्तर पर नजर रखी जानी चाहिए, जहां दोनों आंतरिक (कोशिका स्वायत्त) और बाह्य (सेल आला) cues खाते में ले रहे हैं ।

हालांकि, हालांकि इन विट्रो में स्थिति की घटनाओं एक वातावरण है कि प्राकृतिक वातावरण प्रतिलिपि नहीं है में होते हैं, कम घनत्व संस्कृति आमतौर पर इन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की स्थिति के आंतरिक विशेषताओं को प्रकट करने के लिए उपयुक्त है कोशिकाओं. इसके अलावा, आसपास के वातावरण का एक और अधिक सरलीकृत नियंत्रण, बस विकास माध्यम को संशोधित करके, एक महत्वपूर्ण उपकरण का गठन कर सकते है प्रत्येक बाह्य कारक है कि तंत्रिका आला परिभाषित करता है, साथ ही साथ पर्यावरणीय कारकों की व्यक्तिगत भूमिका की जांच कर सकते है कि रोग परिदृश्य में प्रेरित किया जा7,8,9,10,11,12,13। इसलिए, जब सही ढंग से कॉंफ़िगर, यहां प्रस्तावित प्रोटोकॉल के रूप में, लाइव इमेजिंग इन विट्रो समाधान में एक संभव प्रदान करता है पहले से ज्यादातर प्रश्नों का पता है ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल हार्डवेयर, सॉफ्टवेयर, संस्कृति शर्तों, और एक सेल ट्रैकिंग के बाद सफलतापूर्वक एक लाइव इमेजिंग प्रयोग करने के लिए आवश्यक मुख्य कदम का वर्णन करता है । इस दृष्टिकोण बहुमूल्य जानकारी है कि जीव विज्ञान के मौलिक पहलुओं को प्रकट करने में मदद करता है, और वंश प्रगति के, एकाधिक तंत्रिका आबादी की पेशकश ।

Protocol

निंन अनुभागों के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन live इमेजिंग एकाधिक तंत्रिका आबादी का एक सेल ट्रैकिंग द्वारा पीछा किया (चित्रा 1) । इस प्रोटोकॉल में वर्णित पशुओं को शामिल करने वाली सभी प्रक्रियाएं प्रयोगशाला जंतु विज्ञान (ICLAS) के लिए अंतर्राष्ट्रीय परिषद के दिशानिर्देशों के अनुसार की जानी चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1. योजना, अर्थात्: सेल संस्कृति, लाइव इमेजिंग, PICC और डेटा संग्रह, एकल सेल ट्रैकिंग, और अंतिम परिणाम के प्रमुख प्रयोगात्मक कदम illustrating । चरण प्रोटोकॉल के कार्य-प्रवाह के अनुसार क्रमांकित किए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

1. सेल संस्कृति: अलगाव और चयनित तंत्रिका आबादी या कोशिका वंश की चढ़ाना

नोट: इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में, अलग सेल आबादी के लिए अपने आवेदन के उदाहरण के लिए अपनी उपयोगिता को मांय करने के लिए तंत्रिका कोशिकाओं के जीवविज्ञान का विश्लेषण दिया जाता है । ये शामिल हैं: वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल (aNSCs) माउस SubEpendymal जोन (एसईजेड) से व्युत्पंन (एक विस्तृत अलगाव प्रोटोकॉल के लिए देखें14); प्रसव cortical astrocytes का अध्ययन करने के लिए (एक विस्तृत अलगाव प्रोटोकॉल के लिए ंयूरॉन reprogramming देखें15); प्रसव अनुमस्तिष्क astrocytes (एक विस्तृत आइसोलेशन पद्धति के लिए16देखें); और माउस न्यूरो-2a Neuroblastoma सेल लाइन (N2a) ।

  1. पाली-डी-lysine लेपित 24-well प्लेट्स पर सीधे कोशिकाओं बीज । अच्छी तरह से प्रति संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें । ३७ ° c और 8% co2 पर aNSCs, या ३७ ° c पर प्लेट्स और 5% co2 के लिए 2 h के लिए astrocytes/ coverslips के उपयोग से बचने के लिए मोटर चालित माइक्रोस्कोप चरण के रूप में अवांछित आंदोलन को रोकने के लिए विस्थापित है जो एकल कोशिका पर नज़र रखने के लिए संभव बनाता है ।
    नोट: सेल घनत्व और संस्कृति मीडिया प्रयोगों में कार्यरत हैं: Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में aNSCs के लिए 30-40000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से (DMEM: F12 पोषक मिश्रण मध्यम); २०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से DMEM उच्च ग्लूकोज मध्यम में N2a कोशिकाओं के लिए, DMEM उच्च ग्लूकोज माध्यम में अनुमस्तिष्क astrocytes के लिए ८०,००० कोशिकाओं/ और 55-65000 कोशिकाओं/प्रसव astrocytes के लिए DMEM में: F12 पोषक मिश्रण मध्यम ।
  2. संभव कोशिकाओं की सबसे कम संख्या के लिए संस्कृति के सेल घनत्व का समायोजन करके संस्कृति प्रोटोकॉल का मानकीकरण । फिर भी, कोशिका घनत्व पर्याप्त रूप से संस्कृति की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए उच्च होना चाहिए ।
    नोट: यदि कोशिका घनत्व बहुत अधिक है, अतिरिक्त मलबे या गरीब पृथक्करण (झुरमुट) एकल कोशिकाओं की ट्रैकिंग बाधा हो सकती है ।

2. समय चूक वीडियो-माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप, कैमरा, हार्डवेयर, और मशीन सिस्टम को चालू करें । ३७ ° c और 8% कं2 aNSCs के लिए तापमान और हवा का दबाव सेट करें, या ३७ ° c और 5% co2 के लिए astrocytes/ तापमान और सह2 स्तर 1-2 ज के लिए स्थिर करने की अनुमति दें ।
    नोट: विशिष्ट उपकरण सहित समय चूक वीडियो विश्लेषण, प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है: मोटर चालित घटकों के साथ ब्राइट फील्ड/चरण कंट्रास्ट/प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप्स; तापमान, सह2 और आर्द्रता नियंत्रण है कि मशीन उपकरणों; और अंत में, विश्वसनीय और पर्याप्त रूप से शक्तिशाली हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर प्राप्त करने और लाइव इमेजिंग प्रयोगों के दौरान प्राप्त चित्रों की मात्रा को संभालने में सक्षम ( सामग्री की तालिका कीजांच करें) ।
  2. एक बार कोशिकाओं को मजबूती से प्लेट (2 ज चढ़ाना के बाद) से जुड़ी हैं, एक अच्छी तरह से एक है कि ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाएगा के तल पर एक छोटे से निशान बनाने के लिए एक स्थाई मार्कर पेन का उपयोग करें, यानी, एक अच्छी तरह से है कि कोशिकाओं को शामिल नहीं है ।
    नोट: यह चिह्न xyz निर्देशांक शूंय करने के लिए एक संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाएगा, और यह प्रयोग के दौरान या बाद में किसी भी समय या मध्यम के परिवर्तनों के बीच, शूंय स्थिति में लौटने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
  3. माइक्रोस्कोप की मशीन कक्ष के अंदर थाली प्लेस और दृढ़ता से चरण के लिए थाली संलग्न करने के लिए माइक्रोस्कोप की मोटरी मंच के विस्थापन के दौरान किसी भी अवांछित आंदोलन से बचने के लिए ।
  4. कक्ष संस्कृति माध्यम के तापमान को लगभग 20 मिनट के लिए चैंबर में equilibrate करने की अनुमति दें । इस कदम के घटकों के फैलाव के कारण रिकॉर्डिंग के दौरान ध्यान की हानि से बचना होगा ।
  5. लाइव इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करने और प्रयोग स्थापित करने के लिए समय चूक मॉड्यूल का चयन करें ।
  6. "समय-अनुसूची टैब मेनू" में प्रयोग की कुल अवधि और छवि अधिग्रहण चक्र सेट करें । कारण संचरित या प्रतिदीप्ति प्रकाश के अंतर्निहित phototoxicity के लिए इस्तेमाल किया, विश्लेषण और संभावित कोशिका मृत्यु के लौकिक संकल्प के बीच संतुलन के लिए एक पर्याप्त अंतराल को परिभाषित ।
    नोट: उदाहरण के लिए, aNSC संस्कृतियों के लिए कुल १२० ज का चयन किया गया था, हर 5 मिनट में brightfield चित्र प्राप्त करना । विचार करें कि इस कॉंफ़िगरेशन में किसी एकल चलचित्र के १२० h का प्राप्ति 120-150 गीगाबाइट्स कंप्यूटर डिवाइस में मुक्त संग्रहण स्थान की आवश्यकता होगी ।
  7. "xyz अंक टैब मेनू" में x और y निर्देशांक, और फोकल दूरी (z समंवय) द्वारा परिभाषित छवि पदों का चयन करें । संदर्भ बिंदु (xyz शूंय समंवय) प्रारंभिक स्थिति के रूप में शामिल करने के लिए किसी भी समय निर्देशांक प्राप्त करने के लिए ।
  8. "तरंग दैर्ध्य चयन टैब मेनू" में अधिग्रहण के प्रकार का चयन करें, brightfield केवल या epifluorescence उत्तेजना के साथ संयोजन में जब आवश्यक. एक्सपोज़र समय का चयन करें । ध्यान में रखिए कि अधिक संचारित करने के लिए जोखिम, और विशेष रूप से फ्लोरोसेंट रोशनी, सेल व्यवहार्यता समझौता कर सकते है (जैसा कि ऊपर संकेत) ।
    1. aNSCs, अनुमस्तिष्क astrocytes और N2a कक्षों के लिए, brightfield (10-50 ms एक्सपोज़र समय) का चयन करें ।
    2. के लिए transduced cortical astrocytes का चयन brightfield (10-50 ms जोखिम समय) लाल/हरी प्रतिदीप्ति के साथ संयोजन में, प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया रिपोर्टर के आधार पर (लाल उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: ५५० एनएम और ४०० ms जोखिम समय; ग्रीन उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 460-500 एनएम और १०० एमएस जोखिम समय) ।
  9. प्रयोग और फ़ोल्डर जहां छवियों को संग्रहीत किया जाएगा के नाम को परिभाषित करें । किसी भी समय प्रयोग को पुनः लोड करने के लिए पदों की सूची सहेजें, और एक बार सभी शर्तों को सेट किया गया है, "अब चलाएं" बटन पर क्लिक करके प्रयोग चलाएं ।
  10. प्रयोग को रोकें और प्रयोग पूरा होने तक प्रति दिन एक बार "अधिलेखित z बटन" क्लिक करके फ़ोकस शर्तों को पुन: समायोजित करें । यदि माध्यम में परिवर्तन लाइव इमेजिंग के दौरान आवश्यक हैं, प्रयोग को थामने और समय चूक कक्ष से प्लेट निकालते हैं ।
अगले, बाँझ शर्तों के तहत माध्यम बदलने के लिए और थाली वापस मंच के लिए जगह (२.३ कदम देखें) । फ़ोकस शर्तों को पुन: समायोजित करें और प्रयोग फिर से शुरू करे ।
नोट: कोशिका मृत्यु या अधिक प्रसार के कारण माध्यम के पीएच में परिवर्तन, साथ ही कमरे के तापमान में बदलाव, कोशिकाओं पर माइक्रोस्कोप का ध्यान केंद्रित सही प्रभावित हो सकता है. संवेदनशील संस्कृतियों (जैसे aNSCs) के लिए हम 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) (अंतिम एकाग्रता: 1 मिमी) के साथ पूरक माध्यम के उपयोग की सलाह देते हैं ।

3. पोस्ट-इमेजिंग Immunocytochemistry (PICC), डेटा संग्रह, और प्रसंस्करण

  1. एक बार प्रयोग पूरा हो गया है, सॉफ्टवेयर को थामने और निर्धारण और PICC के लिए प्लेट पुनः प्राप्त, के रूप में अगले चरणों में वर्णित है ।
  2. कक्ष निर्धारण करें: 1 मिलीलीटर फॉस्फेट के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें खारा (पंजाब) और paraformaldehyde (पीएफए) (पंजाब में 4%) के ५०० µ एल जोड़ने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट की मशीनिंग (आरटी) ।
    चेतावनी: Paraformaldehyde एक मजबूत निर्धारण है और ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए त्वचा या आंखों के साथ संपर्क से बचने के लिए । यह केवल एक धुएं के हुड के अंदर हेरफेर किया जाना चाहिए ।
  3. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो और अवरुद्ध समाधान के ५०० µ एल जोड़ने (2% (wt/) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और ०.२% (vol/एक गैर ईओण surfactant) के (vol/ आर टी पर 1 ज.
  4. ब्लॉकिंग समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 250-400 µ एल जोड़ें । आर टी पर 2 ज । प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान प्राथमिक BSA और ०.२% (wt/vol) के 2% युक्त पंजाब में पतला एंटीबॉडी शामिल है (vol/एक गैर ईओण surfactant । यहां वर्णित प्रयोगों में एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया: GFAP (1:500), βIII-tubulin (1:1000) और α-tubulin (1:1000) । के रूप में इस बाहर किया जाता है सीधे अच्छी तरह से, समाधान की बड़ी मात्रा में आवश्यक है (250-400 µ एल) सभी कोशिकाओं को कवर करने के लिए ।
  5. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धो और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 250-400 µ एल जोड़ने (३.४ कदम में वर्णित के रूप में पतला) । माध्यमिक एंटीबॉडी प्रयोगों में इस्तेमाल किया यहां वर्णित: विरोधी माउस Fluorescein (FITC) (1:800), विरोधी खरगोश Cy3 (1:500) । गर्मी अंधेरे में आर टी में 1 एच ।
  6. पंजाब के 1 मिलीलीटर में तीन बार धो लें । प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं रखें ।
  7. प्लेट को माइक्रोस्कोप स्टेज पर वापस रखें और मोटर चालित माइक्रोस्कोप स्टेज के विस्थापन के दौरान अवांछित आंदोलन से बचने के लिए इसे मंच पर मजबूती से लगायें ।
  8. २.२ चरण में किए गए चिह्न का उपयोग कर xyz शून्य स्थिति पुनः प्राप्त करें और "ऑफ़सेट सभी X, Y, Z" बटन दबा कर इस संदर्भ बिंदु पर स्थिति पुन: सेट करें । फिर से प्रत्येक स्थिति के लिए फोकल दूरी निर्धारित किया है ।
  9. छवियों के अंतिम दौर प्राप्त, "तरंग दैर्ध्य चयन टैब मेनू" में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के लिए आवश्यक शर्तों को विंयस्त करने के क्रम में पहले PICC में लक्षित एंटीजन का पता लगाने के लिए ।
    1. संक्षेप में, brightfield के अलावा, FITC (उत्तेजना: ४९५ एनएम) और Cy3 (उत्तेजना: ५५० एनएम) सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण विकल्प सक्रिय करें । brightfield ४०० एमएस एक्सपोजर के लिए 10-50 ms का उपयोग करने के लिए fluorophores का पता लगाने और "1 समय पाश" बटन दबाएँ, चित्रों का एक अंतिम दौर प्राप्त करने के लिए.
      नोट: प्रतिदीप्ति की तीव्रता PICC परिणाम के आधार पर अलग हो सकता है । प्रदर्शनी समय समायोजित करने के लिए इष्टतम छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए ।
  10. का चयन करें सॉफ़्टवेयर फ़ाइल/निर्यात विकल्प और चित्र में निर्यात छवि फ़ाइल स्वरूप (Tiff) या संयुक्त फ़ोटोग्राफ़िक विशेषज्ञ समूह स्वरूप (Jpeg) एक पूर्व-निर्धारित गंतव्य फ़ोल्डर के लिए चिह्नित ।
  11. ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर द्वारा आवश्यक प्रारूप को निर्यात छवियों को परिवर्तित: ट्रैकिंग उपकरण17 (tTt) । इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, "tTt कनवर्टर उपकरण" ऑपरेटिंग विंडो में इनपुट और आउटपुट फ़ोल्डर, साथ ही पदों के लिए इस्तेमाल मार्करों (xy), चैनल (सी), और समय अंक (टी) को परिभाषित, और प्रेस "कंवर्ट छवियां" बटन ।
    नोट: विशिष्ट सेटिंग्स के अनुसार छवियों का नाम बदला जाना चाहिए और वे प्रयोग में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक स्थिति के लिए व्यक्तिगत फ़ोल्डरों में संग्रहीत की जानी चाहिए । स्थापना के लिए निर्देश, आवश्यकताओं, पदों का नाम बदलने/छवियों, और ट्रैकिंग उपकरण के उपयोग पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध हैं: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html ।

4. एकल सेल ट्रैकिंग

  1. डेटा का नाम बदलने के बाद, tTt सॉफ़्टवेयर चलाएं । कोई उपयोगकर्ता नाम और tTt कार्य फ़ोल्डर का चयन करें ।
    नोट: ट्रैकिंग टूल कार्य फ़ोल्डर सभी विश्लेषित डेटा और निर्यात किए गए परिणामों को होल्ड करेगा. कार्य फ़ोल्डर का नाम tTtexport होना चाहिए, जिसमें "AVIexport", "configs", "TreeExport", और "tTtfiles" नामक सबफ़ोल्डर होते हैं ।
  2. "प्रयोग फ़ोल्डर का चयन करें विंडो में लोड किया जा करने के लिए प्रयोग का चयन करें", फ़ोल्डर पथ का संकेत है जहां प्रयोग संग्रहीत है, और फिर क्लिक करें "प्रयोग लोड" बटन ।
  3. लोड की गई छवियों को ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा पढ़ा जा सकने वाले फ़ॉर्मेट में रूपांतरित करने के लिए लॉग फ़ाइल कनवर्टर चलाएं (पहली बार लोड किए गए प्रयोगों के लिए, यह सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से अनुरोध किया जाएगा) ।
  4. इसके प्रतीक पर क्लिक करके ट्रैकिंग के लिए एक स्थिति का चयन करें (रूपांतरण के बाद, प्रयोगों के दौरान दर्ज की स्थितियों का एक सिंहावलोकन "स्थिति लेआउट विंडो" में प्रदर्शित किया जाएगा । प्रत्येक स्थिति की स्थिति और उसकी इसी संख्या के एक चित्र में शामिल एक प्रतीक द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाएगा ( चित्र 1देखें) ।
  5. एक बार स्थिति का चयन किया गया है और उपलब्ध छवियों की एक सूची "स्थिति लेआउट विंडो" के दाईं ओर प्रदर्शित होता है, उन्हें चुनें और "लोड छवियाँ" बटन पर क्लिक करें.
  6. एक बार लोड हो रहा है और पूरा हो गया है "सेल संपादक विंडो" प्रकट होता है, तरंग दैर्ध्य और छवि अंतराल का चयन करने के लिए "सेल संपादक विंडो" में ट्रैक किया जाएगा । तरंग दैर्ध्य 0 से मेल खाती है brightfield, 1 से मेल खाती है FITC, 2 करने के लिए Cy3, और 3 करने के लिए DAPI । यहाँ वर्णित प्रयोगों में, अंतराल 1 का उपयोग किया गया था, यानी, सभी छवियों भरी हुई. स्पष्ट करने के लिए, अंतराल 2 हर दूसरी छवि की लोडिंग का मतलब है ।
  7. छवियों को लोड किया गया है एक बार, "स्थिति लेआउट विंडो" पर वापस जाने के लिए और पहले भरी हुई स्थिति का प्रतिनिधित्व आइकन पर डबल क्लिक करें. "चलचित्र विंडो" दिखाई देगा जो एकल कक्ष ट्रैकिंग को निष्पादित करने की अनुमति देता है ।
  8. ट्रैकिंग टूल निर्देशों का पालन करते हुए, ट्रैकिंग पर आगे बढ़ें. चुनें 0 चैनल (brightfield के लिए इसी), और चमक और कंट्रास्ट समायोजित ("गामा बटन समायोजित करें") । F2 कुंजी दबाकर ट्रैकिंग प्रारंभ करें ।
    नोट: ट्रैकिंग के दौरान, ट्रैक किए गए कक्ष पर माउस सूचक रखकर और "0" कुंजी दबाने के बाद किया जाएगा । सेल डिवीजन, सेल apoptosis और खो सेल बटन इन विशिष्ट सेल घटनाओं की निगरानी के लिए उपलब्ध हैं ।
प्रयोग के रूप में नज़र रखी है, इन विकल्पों में से प्रत्येक स्वचालित रूप से प्रयोग ट्रैक किया जा रहा है के रूप में "सेल संपादक विंडो" में तैयार वंश पेड़ में प्रदर्शित किया जाएगा ।
  • एक बार क्लोन ट्रैक किया जाता है, PICC द्वारा प्राप्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के साथ brightfield चित्रों मैच के लिए कोशिका संतति की प्रकृति की पहचान । प्रत्येक epifluorescence चैनल "मूवी विंडो" (चैनल 1, 2, आदि) में प्रतिनिधित्व किया जाएगा ।

    • 5. अंतिम परिणाम

    1. एक बार एक सेल ट्रैकिंग पूरा कर लिया गया है और संतान की पहचान की, प्रयोग सहेजें (सेल संपादक विंडो/फ़ाइल टैब/के रूप में वर्तमान पेड़ को बचाने के लिए) और परिणाम निर्यात करने के लिए आगे बढ़ना ।
    2. "निर्यात मेनू" सेल संपादक विंडो में स्थित में वंश के पेड़ और सेल डेटा निर्यात करें । इसी तरह, "फिल्म विंडो" के माध्यम से सुलभ "निर्यात मेनू" के माध्यम से सेल छवियों और फिल्मों निर्यात. छवियों, वंश के पेड़, डेटा, और फिल्मों tTt काम फ़ोल्डर में निर्यात किया जाएगा ।

    Representative Results

    विधि वर्णित महत्वपूर्ण कई तंत्रिका आबादी के सेल जीवविज्ञान के बारे में सवाल हल हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह aNSCs7,8,14,18की तंत्रिकाजन्य और oligodendrogliogenic वंश की प्रगति पर नजर रखने के लिए संभव हो गया है । एकल aNSCs और उनकी संतान (चित्रा 2a, बी) पर नज़र रखने से, यह है कि इन विट्रो में अलग aNSCs अपने तंत्रिकाजन्य प्रकृति को बनाए रखने, ज्यादातर neuroblasts पैदा करने, और है कि वे एक अनुक्रम में प्रस्तावित का पालन करने के लिए संभव था वीवो19 लेकिन पहले सिंगल सेल लेवल पर नहीं प्रदर्शन किया । इसके अलावा, इस संस्कृति प्रणाली असममित सेल विभाजन की अनुमति दी एसईजेड (चित्रा 2 बी) से aNSC वंश में पहली बार के लिए visualized हो, एक अनूठा मॉडल के लिए एनएससी स्व-नवीकरण8,14का अध्ययन प्रदान । इसी तरह, और चाहे वंश का विश्लेषण, यह मूल्यवान सेल विकास के बारे में डेटा प्राप्त करने के लिए संभव था, विभाजन के दौर, सेल व्यवहार्यता, या सेल चक्र लंबाई ।

    Figure 2
    चित्र 2. एसईजेड से पृथक aNSCs का उदाहरण है, और लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग द्वारा विश्लेषण किया । चरण कंट्रास्ट छवियां अलग समय अंक (दिन-ज: min) में क्लोन की प्रगति दर्शाती हैं । अंतिम छवि Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP, लाल), βIII-tubulin (हरा) और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, नीला) के लिए पोस्ट-इमेजिंग immunocytochemistry (PICC) से मेल खाती है । (एक) विभाजन बढ़ाना के विभिंन दौर के माध्यम से सममित तंत्रिकाजन्य पेड़ों के विश्लेषण के बाद उत्पंन करने के लिए mitotic neuroblasts । लाल तीर सममित पेड़ों में शामिल कोशिकाओं को इंगित करते हैं । सही पर, वंश पेड़ों क्लोन करने के लिए इसी और tTt सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पंन प्रदर्शित कर रहे हैं । (ख) एक जनक एक असममित तंत्रिकाजन्य पेड़ पैदा करने का उदाहरण है, एक शाखा को बढ़ाना प्रभागों के दौर से गुजर neuroblasts उत्पादन के साथ, जबकि अंय एक संभावित आत्म नवीकरण घटना के माध्यम से quiescent GFAP सकारात्मक कोशिकाओं को जंम देता है । सही पर, वंश वृक्ष tTt सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पंन प्रदर्शित होता है । सभी वंश वृक्षों में: "N" पोस्ट-mitotic neuroblasts का चित्रण; "जी", quiescent GFAP-positive cells; "×", कोशिका मृत्यु; और "?" एक खो सेल । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग विश्लेषण भी तंत्रिका आबादी की प्रवासी क्षमताओं का एक सटीक readout प्रदान करता है । इस तरह की जानकारी प्रसव अनुमस्तिष्क astrocytes से प्राप्त एक खरोंच घाव परख20के लिए प्रस्तुत किया गया था, औसत दूरी के बारे में जानकारी पैदा astrocytes जब घाव बंद (चित्रा 3) द्वारा कूच । इसके अलावा, यह देखना है कि astrocytes के कुछ उपचार प्रक्रिया के दौरान विभाजित संभव था, जबकि अंय प्रयोग भर में अनछुए रहते हैं । स्पष्ट रूप से, उन है कि विभाजित करने के लिए अपने गैर से अधिक विपुल प्रवासी व्यवहार प्रदर्शन लग समकक्षों विभाजन (दो बार के रूप में औसत पर अब तक यात्रा) । इस घटना को astrocytes क्षमता में एक बहुत ही दिलचस्प विविधता को चोट लगी है, जो एक शास्त्रीय अंत बिंदु विश्लेषण प्रयोग के बाहर पढ़ने में पतला होता है पर निशान फार्म का पता चलता है ।

    Figure 3
    चित्र 3. एक खरोंच घाव परख में प्रसव अनुमस्तिष्क astrocytes के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण । चरण कंट्रास्ट छवियां भिंन समय बिंदुओं (दिन-h: min) में घाव दर्शाती हैं । वंश के पेड़, tTt सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पंन, प्रतिनिधि व्यवहार का वर्णन, कोशिका विभाजन के संदर्भ में, astrocytes के घाव बंद करते समय । हिस्टोग्राम एक सेल ट्रैकिंग (मतलब ± S.E.M.) द्वारा विश्लेषण astrocytes द्वारा कूच औसत दूरी से पता चलता है । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    समय चूक वीडियो की एक और दिलचस्प विशेषता-सूक्ष्म प्रयोगों के लिए एक कोशिका की आबादी में प्रसार और भेदभाव की तुलना क्षमता है । हम शर्तों के तहत मढ़वाया N2a कोशिकाओं का परीक्षण किया है कि या तो प्रसार को बढ़ावा देने (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) की उपस्थिति में) या भेदभाव (०.५% FBS की उपस्थिति में + 10 µ एम arachidonic एसिड) । यह प्रफलन शर्तों (चित्र 4a) के तहत इन कोशिकाओं की वंश प्रगति का पालन करना संभव था, जबकि अंतर कोशिकाओं पैदा नहीं है और वे neurites (चित्रा 4B) के रूप में । उल्लेखनीय है, एकल सेल ट्रैकिंग विभिंन प्रसार क्षमता के साथ कालोनियों की अनुमति के लिए विशिष्ट और neurite बढ़ाव (और कर्षण) के लिए मूल्यांकन किया जाएगा, सटीक और मात्रात्मक डेटा है कि बाद में निर्यात किया जा सकता है प्रदान करते हैं ।

    Figure 4
    चित्र 4. प्रसार (A) या विभेदन शर्तों (B) में N2a कोशिका जीवविज्ञान की निगरानी । चरण कंट्रास्ट अलग समय अंक (दिन-ज: मिनट) में क्लोन की प्रगति का चित्रण छवियां । अंतिम छवि α-tubulin (green) के लिए पोस्ट-इमेजिंग immunocytochemistry (PICC) से मेल खाती है । (A) एकल सेल ट्रैकिंग विभाजन के दौर पर नजर रखी जा करने के लिए अनुमति देता है, साथ ही विभिन्न कोशिकाओं के प्रफलन प्रतिक्रिया में विविधता. दाईं ओर, वंश वृक्ष tTt सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पंन N2a कोशिकाओं के प्रफलन व्यवहार को दर्शाता है । (B) भिंनता शर्तों के अंतर्गत कक्ष कोशिका चक्र से बाहर निकलते है और neurites उत्पंन करते हैं, एक प्रक्रिया जिसे प्रभावी रूप से पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण द्वारा मापा जा सकता है । एकल सेल ट्रैकिंग, सही पर वंश वृक्ष द्वारा प्रतिनिधित्व किया, कि कैसे N2a कोशिकाओं कोशिका चक्र से बाहर निकलें और भेदभाव की स्थिति के तहत सेल डिवीजन बंद दिखाता है । स्केल बार ५० µm का प्रतिनिधित्व करता है ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    अंत में, लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग अत्यंत रूपात्मक और आणविक परिवर्तन की निगरानी जब कोशिकाओं reprogramming को प्रस्तुत कर रहे है उपयोगी है । Achaete के साथ प्रसव astrocytes transduced के लाइव इमेजिंग-scute homolog 1 (Ascl1) रूपात्मक reprogrammed किया जा रहा है जब astrocytes परिवर्तन या सेल विभाजन की रुकावट के दौरान होने वाले के बारे में मूल्यवान डेटा प्रदान करता है (देखें चित्रा 5) । इसके अलावा, जब Ascl1 transduction एक का निर्माण transduction के साथ संयुक्त है ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग (GFP) डबल कोर्थिन (DCX) प्रवर्तक के नियंत्रण में, यह सटीक समय बिंदु को परिभाषित करने के लिए संभव है जब ंयूरॉंस विशिष्ट मार्करों पुनर्चित्रित कक्षों (चित्रा 5) में व्यक्त होने लगते हैं । समय चूक वीडियो-माइक्रोस्कोपी भी कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक reprogramming पूरा करने के लिए मात्रा और कोशिकाओं है कि इस प्रक्रिया के दौरान मरने की तुलना में की संख्या की अनुमति देता है । ऐसे ईवेंट्स की पहचान करने में महत्वपूर्ण "चेकपॉइंट्स" का नेतृत्व किया गया है, जिन कक्षों का सफलतापूर्वक पुनर्-निरीक्षण9हुआ था ।

    Figure 5
    चित्र 5. प्रसव cortical astrocytes का विश्लेषण ंयूरॉन reprogramming के अधीन । reprogramming के साथ transduction द्वारा प्रेरित किया गया था प्रो-तंत्रिकाजन्य Ascl1-Red प्रतिदीप्ति प्रोटीन (आरएफपी) वैक्टर । न्यूरॉन रूपांतरण एक DCX प्रमोटर के नियंत्रण के तहत एक वेक्टर एन्कोडिंग GFP के साथ सह-transduction द्वारा निगरानी की गई थी. चरण कंट्रास्ट छवियां भिंन समय बिंदुओं (दिन-h: min) में पुनः प्रोग्रामिंग की प्रगति दिखाती हैं । क्रमशः आरएफपी और GFP अभिव्यक्ति की प्रतिदीप्ति छवियां । लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग की अनुमति दी महत्वपूर्ण घटनाओं का पालन किया जाना है, जैसे रूपात्मक परिवर्तन, reprogramming, कोशिका मृत्यु के दौरान कक्ष विभाजन की अनुपस्थिति, और सटीक समय के लिए जब reprogrammed कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए शुरू करने के लिए ंयूरॉंस मार्करों परिभाषित किया जा सकता है . स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ८० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Discussion

    लाइव इमेजिंग का सबसे महत्वपूर्ण मूल्यों में से एक संभावना को सटीक वंश अनुरेखण प्रदर्शन, elucidating वंश प्रगति के एक तंत्रिका आबादी में महत्वपूर्ण पहलुओं है । वंश अनुरेखण पहचान और एक एकल जनक के सभी संतान की निगरानी के रूप में परिभाषित किया गया है, क्लोन के संस्थापक से बाद में क्लोन21का गठन किया । उल्लेखनीय है, वैकल्पिक वंश अनुरेखण के लिए कार्यरत तरीके (जैसे, वायरल transduction या बहुरंगा रिपोर्टर का निर्माण21) एक महत्वपूर्ण खामी है, जिससे अंतिम परिणाम अभी भी चित्रों पर आधारित है और यह जरूरी नहीं है पूरे अनुक्रम का गठन । इसका मतलब यह है कि कोशिका मृत्यु, कोशिका की आबादी के व्यवहार में विविधता, कमजोर पड़ने, प्रसार या मार्करों की खराब दक्षता, अन्य महत्वपूर्ण बाधाओं के साथ-साथ परिणाम2के अपूर्ण या गलत पठन-बहिष्कार का कारण बन जाते हैं । इसके अलावा, लाइव इमेजिंग शोधकर्ता तंत्रिका आबादी के जीव विज्ञान की महत्वपूर्ण सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है, इस तरह के मोड और सेल प्रभाग, सेल विकास, प्रवास, प्रसार बनाम भेदभाव, कोशिका चक्र लंबाई, neurite के समय के रूप में गठन, जटिलता और लंबाई, सेल भाग्य चयन (भेदभाव), या रूपांतरण (reprogramming) ।

    इसके अलावा, लाइव इमेजिंग आसानी से अन्य विश्लेषण जैसे एकल कोशिकाओं से डेटा प्राप्त करने के लिए इरादा के साथ पूरित किया जा सकता, उदाहरण के लिए, आरएनए अनुक्रमण. हालांकि, दोनों लाइव इमेजिंग और अंय तकनीकों से संयुक्त लाभ प्राप्त करने की आवश्यकता है कि उन कोशिकाओं को पहले फिल्मों में नजर रखी बाद में फिर से पहचान की और व्यक्तिगत रूप से माध्यमिक विश्लेषण के लिए एकत्र कर रहे हैं । इस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है कि स्थानीय निर्देशांक शामिल, विशिष्ट कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट पत्रकारों को लागू करने या संदर्भ के रूप में कोशिकाओं के समूहों के वितरण का विश्लेषण करके. दरअसल, transcriptome प्रोफ़ाइल और व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार का संयोजन नई आणविक कोशिकाओं के जीव विज्ञान में शामिल cues स्पष्ट के लिए एक शक्तिशाली मार्ग का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।

    मुख्य समस्याओं में से एक है कि एक जीवित इमेजिंग प्रयोग समझौता कर सकते है एक अपर्याप्त कोशिका संस्कृति घनत्व है । के रूप में पहले से संकेत दिया, उच्च घनत्व पर मलबे या गरीब पृथक्करण (झुरमुट गठन) की अधिक गुणवत्ता और छवियों के स्थानिक संकल्प को प्रभावित कर सकते हैं, एक सेल व्यवहार्य ट्रैकिंग बना । इसलिए, अध्ययन के तहत विशिष्ट कोशिका आबादी की शर्तों सेल संस्कृति की व्यवहार्यता समझौता किए बिना संभव कोशिकाओं की सबसे कम संख्या के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।

    छवि अधिग्रहण की आवृत्ति भी महत्वपूर्ण है और ध्यान से समायोजित किया जाना चाहिए, खासकर जब प्रतिदीप्ति रोशनी का प्रयोग किया जाता है । पर अधिक जोखिम संचारित और विशेष रूप से प्रतिदीप्ति प्रकाश सेल व्यवहार्यता समझौता हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, छवियों का कब्जा के बीच एक अत्यधिक देरी विश्लेषण के लौकिक समाधान के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।

    लाइव इमेजिंग प्रयोग के दौरान एक और महत्वपूर्ण कदम ध्यान केंद्रित की आवधिक समायोजन है । सही सेटिंग/पुन: केंद्र दूरी की सेटिंग में विफलता एकल सेल ट्रैकिंग बाधा हो सकती है । इसके अलावा, यह ध्यान से जांच करने के लिए आवश्यक है कि मशीन चैंबर पर्याप्त तापमान, आर्द्रता, और सह2 स्तरों को बरकरार रखता है, अवांछित विविधताओं है कि कोशिका मौत पैदा कर सकता है में संशोधन ।

    अंत में, एक बार PICC प्रदर्शन किया गया है, यह महत्वपूर्ण है के लिए ठीक से xyz शूंय स्थिति छवि अधिग्रहण के अंतिम दौर से पहले पुनः प्राप्त । गलत पुन: स्थापित xyz शूंय स्थिति के चरण-कंट्रास्ट और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से मेल करने के लिए मुश्किल कर देगा, कोशिका संतति की पहचान में बाधा ।

    हालांकि इस दृष्टिकोण कई सकारात्मक पहलुओं है, तंत्रिका आबादी का जीना इमेजिंग करने के लिए कुछ सीमाएं अभी भी जारी रहती है । उदाहरण के लिए, कम कोशिका aNSCs के सफल एकल सेल ट्रैकिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक घनत्व यह असंभव पश्चिमी सोख्ता14के रूप में इस तरह के जैव रासायनिक परख, रोजगार बनाता है । इसके अतिरिक्त, अनुमस्तिष्क astrocytes या N2a कोशिकाओं की तरह तेजी से विभाजित आबादी की निगरानी अस्थाई रूप में यह अक्सर भी संगम के पास संस्कृतियों के रूप में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मुश्किल है प्रतिबंधित है । इसके अलावा, कई संस्कृति तरीके, साथ ही अंतर्निहित जैविक कोशिकाओं के अलगाव के साथ जुड़े प्रतिबंध, अक्सर लंबी अवधि में सेल व्यवहार्यता समझौता, लाइव इमेजिंग प्रयोगों की अवधि सीमित । अंत में, उनके प्राकृतिक वातावरण से अलग कोशिकाओं दोनों सकारात्मक और नकारात्मक प्रभाव है । अपने शारीरिक जगह से अलग कोशिकाओं को महत्वपूर्ण संकेत है कि उनके व्यवहार मिलाना विफल हो सकता है, जबकि एक ही समय में, यह एक शक्तिशाली का प्रतिनिधित्व करता है उन संकेतों के प्रभाव का परीक्षण व्यक्तिगत रूप से विशिष्ट तंत्रिका की वंश प्रगति में आबादी.

    उपर्युक्त सीमाओं को देखते हुए, यह स्पष्ट है कि सही methodological परिदृश्य को vivo मेंसामांय शारीरिक स्थितियों के तहत लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग प्रयोग करने होंगे । हालांकि, वर्तमान तकनीक मस्तिष्क के गहरे क्षेत्रों में समय की लंबी अवधि के लिए एकल कोशिकाओं का पालन करने में असमर्थ हैं2. इसलिए, लाइव इमेजिंग के भविष्य इस सीमा पर काबू पाने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए, पूरी तरह से शारीरिक पर्यावरण3के सबसे मामूली हस्तक्षेप संभव के साथ vivo में एकल कोशिकाओं के सेल जीव विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम चित्रा 1में उसकी सहायता और कला के काम के लिए Beatriz Gascon धंयवाद । हम उनकी सहायता के लिए डॉ॰ सी. Norris का भी धन्यवाद करते हैं । यहां प्रस्तुत काम अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, "रेड डे excelencia-Ingenio स्पेनिश आयन चैनल पहल" (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), ब्रैड-सेमी (S2013/ICE-2958), यूसीएम-Santander (PR26/16-18B-3) और Fundación रेमन Areces अनुदान कार्यक्रम (PR2018 १६-०२). फेलिप ओर्टेगा स्पेनिश अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धात्मकता मंत्रालय के रेमन y Cajal कार्यक्रम स्वीकार करता है (MEC: RYC-2013-13290) ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Poly-D-lysine Sigma P0899 Working solution 0.02 mg mL-1
    24 wells plate Falcon 352047
    Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) Invitrogen 21331-020
    DMEM High Glucose medium Sigma D6546
    Bovine Serum Albumin Sigma A6003
    Triton X-100 Merck 11869 non-ionic surfactant
    Mouse anti-β III Tubulin Sigma T8660
    Rabbit anti-GFAP DakoCytomation Z0334
    Mouse anti-α Tubulin Sigma T5168
    Anti-Mouse FITC Jackson Laboratories 715-095-150
    Anti-Rabbit Cy3 Jackson Laboratories 711-165-152
    Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope Nikon TE-2000-E
    CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives Nikon Ref 280MRH10101
    CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives Nikon Ref 280MRH48230
    pE-300 LED fluorescence Cool LED Ref Number 1981
    310M-201 Incubation system (temperature) OKO-Lab Serial Nº VOF007307
    Pro-ScanII  Motorized stage system Prior Serial Nº 60018
    High precision microscope camera version 4.2 ANDOR Zyla VSC-03650
    Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 Nikon NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E
    OKO touch Incubation system (CO2) OKO-lab Serial number 1716
    Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line ATCC ATCCCCL131
    HEPES buffer solution 1 M Invitrogen 15630-056

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Conklin, E. G. The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology. Science. 21 (536), 525-529 (1905).
    2. Ortega, F., Costa, M. R. Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents. Front Neurosci. 10, 78 (2016).
    3. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
    4. Schroeder, T. Tracking hematopoiesis at the single cell level. Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).
    5. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
    6. Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. Quantitative single-cell approaches to stem cell research. Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).
    7. Ortega, F., et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling. Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).
    8. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
    9. Gascon, S., et al. Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
    10. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).
    11. Kleiderman, S., et al. Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma. Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).
    12. Bunk, E. C., et al. Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone. Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).
    13. Aravantinou-Fatorou, K., et al. CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons. Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).
    14. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
    15. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).
    16. Jimenez, A. I., et al. Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes. Glia. 26 (2), 119-128 (1999).
    17. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
    18. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
    19. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
    20. Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).
    21. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).

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    Gómez-Villafuertes, R., Paniagua-Herranz, L., Gascon, S., de Agustín-Durán, D., Ferreras, M. d. l. O., Gil-Redondo, J. C., Queipo, M. J., Menendez-Mendez, A., Pérez-Sen, R., Delicado, E. G., Gualix, J., Costa, M. R., Schroeder, T., Miras-Portugal, M. T., Ortega, F. Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations. J. Vis. Exp. (130), e56291, doi:10.3791/56291 (2017).

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