Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Målretting cystein Thiols for in Vitro områdespesifikke glykosylering rekombinante proteiner

Published: October 4, 2017 doi: 10.3791/56302
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario
* These authors contributed equally

Summary

Biokjemiske og strukturelle analyser av glycosylated proteiner krever relativt store mengder homogen prøver. Her presenterer vi en effektiv kjemisk metode for områdespesifikke glykosylering rekombinante proteiner renset fra bakterier av målretting reaktive Cys thiols.

Abstract

Stromal samhandling molekyl-1 (STIM1) er en type-jeg transmembrane protein ligger på endoplasmatiske retikulum (ER) og plasma membraner (PM). ER-resident STIM1 regulerer aktiviteten til PM Orai1 kanaler i en prosess kjent som lagre styres kalsium (Ca2 +) oppføring som er viktigste Ca2 + signalnettverk prosessen som driver immunrespons. STIM1 gjennomgår post-translasjonell N- glykosylering på to luminal Asn steder på Ca2 + sensing domenet for molekylet. Men den biokjemiske, Biofysiske, og strukturen biologiske effekter av N- glycosylated STIM1 var dårlig forstått til nylig på grunn av en manglende evne til å lett få høye nivåer av homogen N- glycosylated protein. Her beskriver vi gjennomføringen av i vitro kjemiske tilnærming som festes glukose moieties bestemt protein områder for forstå underliggende effekten av N- glykosylering på proteinstruktur og mekanisme. Bruke løsning kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi vurdere vi både effektiviteten av endring og strukturelle konsekvensene av glukose vedlegget med et enkelt utvalg. Denne tilnærmingen kan lett tilpasses for å studere utallige glycosylated proteiner som finnes i naturen.

Introduction

Lagre styres kalsium (Ca2 +) oppføringen (SOCE) er den store sti som immunceller tar opp Ca2 + fra ekstracellulære plass i stoffer. I T-lymfocytter binde T celle reseptorer på plasma membranen (PM) antigener som aktiverer protein tyrosin kinaser (omtalt i 1,2,3). En fosforylering cascade fører til aktivering av fosfolipase-γ (PLCγ) som senere formidler hydrolyse av membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) i diacylglycerol og inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 er en liten diffusible budbringer som binder til IP3 reseptorer (IP3R) på det endoplasmatiske retikulum (ER) og dermed åpne denne reseptoren kanal og tillater Ca2 + å strømme ned konsentrasjon gradient fra ER lumen til stoffer (omtalt i 4). Reseptor signalering fra G protein kombinert og tyrosin kinase reseptorer i en rekke andre nervøs og ikke-nervøs cellen typer føre til samme produksjon av IP3 og aktivering av IP3Rs.

På grunn av begrenset Ca2 + lagringskapasiteten er, IP3-mediert utgivelsen og resulterende økning i cytosolic Ca2 + er bare forbigående; men denne uttømming av ER luminal Ca2 + dypt effekter stromal samhandling molekyl-1 (STIM1), en type-jeg transmembrane (TM) protein hovedsakelig funnet på ER membran 5,6,7. STIM1 inneholder et lumen orienterte Ca2 + sensing domene en EF-hånd par og sterile α-motiv (EFSAM). Tre cytosolic orienterte kveilet-coil domener er atskilt fra EFSAM av enkelt TM domenet (omtalt i 8). På ER luminal Ca2 + utarming gjennomgår EFSAM en destabilisering-kombinert oligomerization 7,9 som forårsaker strukturelle rearrangements TM og kveilet-coil domener 10. Disse strukturelle endringer kulminerte i en overlapping av STIM1 ER-PM veikryss 11,12,13,14 gjennom interaksjoner med PM phosphoinositides 15, 16 og Orai1 underenheter 17,18. Orai1 proteiner er PM underenheter som monterer skjemaet Ca2 + kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 vekselsvirkningene på ER-PM veikryss lette en åpen Ca2 + utgivelsen aktivert Ca2 + (CRAC) kanal konformasjon som gjør denne bevegelsen av Ca2 + stoffer fra de høye konsentrasjonene av den ekstracellulære plass. I immunceller, den vedvarende cytosolic Ca2 + høyder via CRAC kanaler indusere av Ca2 +- calmodulin/calcineurin avhengige dephosphorylation av den kjernefysiske faktoren av aktivert T-celler som senere går inn i kjernen og begynner transcriptional regulering av gener fremme T-celle aktivering 1,3. Prosessen med CRAC kanal aktivering av STIM1 23,24 via agonist-indusert ER luminal Ca2 + uttømming og den resulterende vedvarende cytosolic Ca2 + høyden kalles samlet SOCE 25. Den viktige rollen SOCE i T-celler er tydelig ved studier viser at arvelige mutasjoner i både STIM1 og Orai1 kan forårsake alvorlig kombinert immunsvikt syndromer 3,19,26, 27. EFSAM starter SOCE etter sensing ER luminal Ca2 + uttømming via tapet av Ca2 + koordinering på kanonisk EF-hånd, til slutt fører til destabilisering-kombinert selv association 7, 28,29.

Glykosylering er kovalente vedlegg og behandling av oligosaccharide strukturer, også kjent som glykaner, gjennom biosyntetiske trinnene i ER og Golgi (omtalt i 30,32,33). Det er to dominerende typer glykosylering i eukaryoter: N-koblede og O-koblet, avhengig av spesifikke aminosyre og atom bygge bro sammenhengen. I N- glykosylering, legges glykaner side kjede amid av Asn, og i de fleste tilfeller oppstår innledes trinn i ER som polypeptid kjeden flytter inn lumen 34. Det første trinnet i N- glykosylering er overføring av en fjorten-sukker kjernen struktur består av glukose (Glc), mannose (mann) og N- acetylglucosamine (GlcNAc) (dvs. Glc3Man9GlcNAc2) fra en ER membran lipid av en oligosaccharyltransferase 35,36. Ytterligere skritt, for eksempel spalting eller overføring av glukose rester, er katalysert på Akutten av spesifikke glycosidases og glycosyltransferases. Noen proteiner som la ER og flytte til Golgi kan bli ytterligere behandlet 37. O- glykosylering refererer til tillegg av glykaner, vanligvis til side kjede hydroksyl gruppe Ser eller Thr rester, og denne endringen oppstår helt i Golgi komplekset 33,34. Det er flere O- glycan strukturer som kan bestå av N- acetylglucosamine, fucose, galaktose, og sialic syre med hver enkle sukkerarter lagt sekvensielt 33.

Mens ingen bestemt sekvens har blitt identifisert som forutsetning for mange typer O- glykosylering, en felles konsensus-sekvens har blitt assosiert med N-koblet endring: Asn-X-Ser/Thr/Cys, hvor X kan alle aminosyre unntatt Pro 33. STIM1 EFSAM inneholder to av disse konsensus N- glykosylering: Asn131-Trp132-Thr133 og Asn171-Thr172-Thr173. Faktisk har tidligere studier vist at EFSAM kan være N- glycosylated i pattedyrceller på Asn131 og Asn171 38,39,40,41. Men tidligere studier av konsekvensene av N- glykosylering på SOCE er incongruent, tyder undertrykt, kraftig eller ingen effekt av denne post-translasjonell modifikasjon på SOCE aktivisering 38,= "xref" > 39,40,41. Dermed er forskning på de underliggende Biofysiske biokjemiske og strukturelle konsekvensene av EFSAM N- glykosylering viktig å forstå de regulatoriske effektene av denne endringen. På behovet for høye nivåer av homogen proteiner i disse i vitro eksperimenter, ble en område-selektiv tilnærming til covalently fest glukose moieties til EFSAM brukt. Interessant, forårsaket Asn131 og Asn171 glykosylering strukturelle endringer som samles i EFSAM kjernen og forbedre egenskapene Biofysiske som fremmer STIM1-mediert SOCE 42.

Kjemisk vedlegget glycosyl grupper på Cys thiols er blitt godt etablert av banebrytende arbeid som første gang påvist nytten av dette enzymet-fri tilnærming til å forstå det stedsspesifikke effekten av glykosylering på protein funksjonen 43 , 44. nylig og med hensyn til STIM1, Asn131 og Asn171 rester ble mutert til Cys og glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] ble brukt covalently koble glukose til gratis thiols 42. Her beskriver vi denne tilnærmingen som ikke bare bruker mutagenese for å innlemme området bestemte Cys rester for endring, men også gjelder løsning kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi å raskt vurdere endring effektivitet og strukturelle forstyrrelser som følge av glykosylering. Spesielt denne generelle metodikk er lett tilpasses studere virkningene av enten O- eller N- glykosylering av recombinantly produsert protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. polymerasekjedereaksjons (PCR)-mediert området-rettet mutagenese for inkorporering av Cys en bakteriell pET-28a uttrykk vektor.

  1. Bestemme konsentrasjonen av pET-28a vektor (dvs. dobbel strandet DNA) ved hjelp av en ultrafiolett (UV) utryddelse koeffisient av 0.020 (μg/mL) cm -1 på 260 nm.
  2. Syntetisere et par komplementære mutagene primere for hver Cys mutasjon som jeg) det er minst 15 nukleotider komplementære til malen før første base misforholdet og 15 nukleotider utfyllende til malen etter den siste base mismatch, ii) totalt primer lengden ikke overstiger 45 nukleotider og iii) en guanine eller cytosine ligger ved første og siste nukleotid hver primer (tabell 1). Sikre primer syntese utføres ved hjelp av en 0.025 μmol skala og patron renselse.
  3. Bruker en Hi-Fi DNA polymerase, sette opp to 20 µL PCR reaksjon blandinger: en som inneholder frem primer og andre som inneholder omvendt primer. Forbered hver blanding inneholder siste konsentrasjoner av 1 x PCR buffer med 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs, 0,5 μM primer, 0.4 μL DMSO 1,25 ng/μL mal DNA, 0.02 U/μL Hi-Fi DNA polymerase.
  4. Termisk syklus egne blandinger bruker en tre-trinns protokoll: 98 ° C for 30 s (denaturing), 53-56 ° C for 30 s (annealing), 72 ° C i 30 s kilobase(kb) -1 (utvidelse) av malen DNA. Gjenta programmet temperatur for 5 sykluser og legge til et siste 72 ° C forlengelsen trinn i 7,5 min.
  5. Etter den første PCR med revers primere i separate rør, kombinere produkter inn i et enkelt rør (dvs. 40 μL totalt) og fortsette PCR reaksjonen for en ekstra 20 sykluser med de samme parameterne for sykling som beskrevet i trinn 1.4.
  6. Electrophorese 15 μL PCR reaksjonsblandingen på en 1% (w/v) agarose gel med 0,5 x Tris, eddiksyre, etylen diamine tetra eddiksyre (EDTA) kjører buffer (TAE). Kontroller, electrophorese tilsvarende beløp av DNA som ikke har blitt forsterket av PCR og en aliquot av referanse DNA stige som inneholder markøren band både større og mindre enn den forventede PCR-produktstørelse.
  7. Etter geleelektroforese på 120 V for 40 min, senke gel i vann med 0,5 μg/mL ethidium bromide og riste for 30 min ved romtemperatur. Bekrefte full lengde malen har blitt forsterket av mutagene primerne som en økning i relativ ethidium bromide fluorescerende intensiteten av forsterket bandet sammenlignet med kontrollen mal bandet under UV-lys (302 nm).
    1. Hvis ingen utvidelse er tydelig, gjenta PCR etter justering annealing temperatur i 0,5 ° C intervaller mellom 53-56 ° C temperaturområdet.
  8. Idet forsterkning av malen ved mutagene primerne, behandle de resterende ~ 25 μL PCR reaksjonsblandingen med DpnI begrensning enzymet å fordøye malen methylated DNA. Bruke DpnI 0,5 µL (10 enheter) per 25 μL PCR reaksjonsblandingen og en siste konsentrasjon av 1 × DpnI reaksjon buffer. Inkuber 2,5 h på 37 ° C.
  9. Etter mal fordøyelsen, legge ~ 5-10 μL fordøyd blandingen til 100 µL av varme sjokk kompetent DH5α Esherichia coli celler i en 1,75 mL microcentrifuge tube. Inkuber celle-DNA blandingen på is 60 min.
  10. Varme sjokk celle-DNA blandingen i microcentrifuge røret på 42 ° C i 45 s på en tørr blokk. Etter rugende blandingen på is 3 minutter, tilsett 900 μL av romtemperatur Luria-Bertani kjøttkraft (LB) til cellene og overføre total-celle suspensjon i et sterilt 14 mL runde bunn rør.
  11. Ruge celle suspensjon på 37 ° C i 90 minutter med konstant rister på 190 rpm.
  12. Deretter overføre celle suspensjon tilbake til en 1,75 mL microcentrifuge rør og sentrifuge 10.000 x g for 5 min ved romtemperatur.
  13. Etter sentrifugering, fjerne 900 μL nedbryting og resuspend bakterieceller av mild pipettering i de resterende 100 μL pund
  14. Overføre resulterende konsentrert celle suspensjon på en LB-agar plate inneholder antibiotika som er selektive for uttrykket vektor (dvs. 60 μg/mLKanamycin). Tas aseptisk spre suspensjon jevnt på agar plate og ruge ~ 16 h på 37 ° C.
  15. Dagen vaksinere en enkelt koloni fra platen i 5 mL av flytende LB inneholder antiobiotic utvalg Press (dvs. 60 μg/mL Kanamycin). Vokse flytende kulturen overnatting på 37 ° C med konstant rister på 37 ° C.
  16. Isolere og rense den overførte plasmider fra E. coli celler ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit basert på alkaliske lysis prosedyren 45.
  17. Bekrefter mutasjon av interesse er tilstede og i riktig lesing rammen av Sanger DNA sekvensering av plasmider 46.

2. Uniform 15 N-merket protein uttrykk i BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Merk: ulike rekombinante proteiner krever ulike uttrykk forhold. Følgende er optimalisert prosedyren for uttrykk for menneskelige STIM1 EFSAM proteinet.

  1. Transformere uttrykk vektoren skjuler Cys mutasjoner (i.e. pET-28a-EFSAM) i BL21 ΔE3 codon (+) varme sjokk kompetent celler og plate på LB-agar plater som inneholder antibiotikumet utvalg trykket som beskrevet i trinnene 1,9-1.14) med den følgende endringer: direkte plate en 150 μL aliquot av ~ 1000 μL total-celle suspensjon på LB-agar plate uten behov for konsentrere cellene i et microcentrifuge rør med sentrifugering.
  2. Dagen tas aseptisk overfører en enkelt koloni til en 200 mL Erlenmeyer kolbe som inneholder 20 mL LB supplert med det passende antibiotikumet (dvs. 60 μg/mL kanamycin for pET-28a-EFSAM). Vokse væske startpakke kultur over natten (dvs. ~ 16 h) på 37 ° C med konstant rister på ~ 190 rpm.
  3. På samme dag som skritt 2.2, forberede M9 medium for 15 N-merket protein uttrykk av autoklavering 1 L M9 bufre salter (dvs. 42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH 2 PO 4 8.6 mM NaCl, pH 7.4) i en 4 L Erlenmeyer kolbe. Når kule, filtrere en blanding av 20% (w/v) D-glukose, 1 M CaCl 2, 1 M Thiamin, 1 M MgSO 4, 1 mg/mL biotin og 0.2 g/mL 15 N-NH 4 Cl gjennom et 0,2 μm sterile sprøyter filter i 1 L sterilt M9 salt løsning slik at den siste konsentrasjoner av disse komponentene er 0,2% (w/v) D-glukose, 100 μM CaCl 2, 50 μM Thiamin, 1 mM MgSO 4, 1 μg/mL biotin og 1 mg/mL 15 N-NH 4 klasse
  4. Neste dag, tas aseptisk overføre 20 mL overnatting væske startpakke kulturen til en 50 mL steril konisk rør og sentrifuger 2400 × g i 15 min til pellets cellene.
  5. Etter dekantere vin LB mediet, resuspend den resulterende celle pellet i 10 mL av M9 minimal medium og Overfør urinprøven blandingen til 1 L M9 minimal medium med antibiotika (dvs. 60 μg/mL kanamycin).
  6. Vokse 1 L av M9 minimal medium som inneholder av bakteriell startkulturer på 37 ° C og ~ 190 rpm konstant risting til optisk densitet ved 600 nm (OD600) når ~0.6 0,8.
  7. Når specfified OD600 området er nådd, legge til 200 μM av isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) å indusere protein uttrykk.
  8. Etter IPTG tillegg fortsette rugende celler for protein uttrykk ved omgivelsestemperatur med konstant skjelvende ~ 190 RPM ~ 16 h (i.e. over natten).
  9. Neste dag, høste bakterier med sentrifugering ~ 10.000 × g, 4 ° C i 30 min.
  10. Dekanter LB og overføre celle pellet i en 50 mL konisk rør. Lagre pellet ved-80 ° C til rensing.

3. Rensing av rekombinant protein fra E. coli.

Merk: ulike rekombinante proteiner krever forskjellige rensing prosedyrer. Følgende er protokollen for 6 & #215; Hans-merket EFSAM rensing fra inkludering organer uttrykt fra pET-28a konstruksjon.

  1. Homogenize manuelt frosne bakteriell celle pellet i 6 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) og 5 mM β-mercaptoethanol bruker en motorisert 10 mL overføring pipette. Legge til ca 40 mL av guanidine-HCl per 5 mL av våt celle pellet for dette trinnet.
  2. Følgende et 90 min incubation ved omgivelsestemperatur med konstant rotasjon i hybridisering ovn, sentrifuge blandingen ~ 15.000 × g, 8 ° C i 40 min skille uløselig celle rusk (i.e. pellet) fra løselig protein blanding (dvs. supernatant).
  3. Legge til 750 µL av 50% (v/v) Ni 2 +-nitrilotriacetic syre agarose perle slurry til den avklart lysate og Inkuber for en annen 90 min ved romtemperatur med inversjon i hybridisering ovn.
  4. Deretter fange 6 × hans-merket protein bundet til Ni 2 + ved å samle agarose perler i en gravitasjon flow protein rensing kolonne. Tillate lysate å strømme gjennom kolonnen helt før du går til trinn 3.5.
  5. Vask samlet perlene tre ganger med 10 mL 6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 8 og 5 mM β-mercaptoethanol. Sikre at hele 10 mL går gjennom kolonnen før hver etterfølgende 10 mL Wash
  6. Elute proteiner i en rekke 2 mL brøker med 6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM imidazole og 5 mM β-mercaptoethanol med 90 s inkubasjon tid mellom fraksjoner. Sikre at hele 2 mL går gjennom kolonnen før hvert etterfølgende elueringsrør trinn.
  7. På dette stadiet, bekrefte protein rundt finnes i eluted fraksjoner av Coomassie blå-farget natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) bruke metoden for Laemmli 47. Vurdere protein størrelse, mengde og renhet sammenligning mot standard molekylvekt markør band som begge mindre enn og større enn forventet molekylvekt av proteinet interessepunkter.
  8. Pool elut protein fraksjoner i en dialyse membran med en 3500 Da molekylvekt cutoff og Inkuber 1 L refolding buffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM CaCl 2, pH 8) på 4 ° C over natten mens bufferen er blir rørt av en magneti c rørestang.
  9. Etter ~ 16 h refolding tid, Legg ~ 1 U av trombin per mg protein direkte dialyse posen og ruge ved 4 ° C i en ekstra ~ 24-h.
  10. Kontrollere omfanget av 6 × sin tag spalting av Coomassie-blå flekker av ~ 15 μL protein dele tatt fra dialyse posen før og etter inkubasjon med trombin som er electrophoresed på denaturing polyakrylamid gels (SDS-side) bruker metoden Laemmli 47. Hvis en ~ 2 kDa endring i overføringen er observert tilsvarer molekylvekt av cleaved 6 × sin tag, fortsette til trinn 3.11; Hvis en brøkdel av ufordøyd protein som oppdages av Coomassie-blå flekker, legger ~0.2 U av trombin per mg protein direkte til dialyse posen og ruge på 4 ° C for en ekstra ~ 24 h.
  11. Bruk størrelse utelukkelse eller ionebytte kromatografi ytterligere rense protein. For anion exchange kromatografi av EFSAM, fjerne den protein løsningen fra dialyse pose og konsentrere ~ 10 ganger bruker en sentrifugal konsentrator ultrafiltrasjon med en 10.000 Da molekylvekt cutoff. Deretter å fortynne løsningen ~ 20-fold i en NaCl-fri buffer (20 mM Tris, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8).
  12. Equilibrate en ferdigpakkede anion exchange kolonne med 10 kolonnen mengder NaCl-fri bufferen som beskrevet i trinn 3.11. Equilibrate bruker buffer lastet inn en luer-lock sprøyte som inneholder ingen luftbobler ved å trykke løsningen gjennom kolonnen i en dropwise måte og unngå sprøyte presset som forårsaker jevn strømmer av løsning avslutter kolonnen. Bruke en sterk anion exchanger (f.eks krysskoblet agarose med kvartær ammonium funksjonelle grupper).
  13. Laste protein løsningen fortynnet i NaCl-fri buffer (trinn 3.11) på kolonnen som beskrevet i trinn 3.12.
  14. Elute proteiner i en gradient [dvs. 0 - 60% (v/v)] for å øke NaCl buffer (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8) med en to-pumpe rask protein flytende kromatografi (FPLC) system. Definere FPLC å samle ~1-1.5 mL fraksjoner og overvåke protein elueringsrør profilen benytter UV 280 nm absorbansen og en flyt rangere 0,5 mL/min.
  15. Identifisere elueringsrør topper og brøker som inneholder proteinet rundt samt protein renhet av Coomassie blå-farget SDS-side gels med metoden av Laemmli 47.
  16. Pool fraksjoner viser > 95% (dvs. tatt som brøker som viser bare et enkelt protein band på Coomassie-blå farget gels) i en dialyse pose og utveksling i eksperimentell buffer på interesse dialyse som beskrevet i trinn 3.8.

4. Kjemisk vedlegg av glukose-5-MTS protein av dialyse.

  1. Forberede en 55 mM lagerløsning N-(β-D-glucopyranosyl)-n '-[2-methanethiosulfonyl) ethyl] urea (glukose-5-MTS) ved å løse opp 10 mg av sammensatt i 500 µL 100% (v/v) DMSO. Lagre ubrukte glukose-5-MTS solubilized i DMSO på -20 ° C.
  2. Forberede protein utvalget for endring av dialyzing 1,5 mL ~ 60 μM protein i 1 L endring buffer består av 20 mM MOPPER, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 og 0,1 mM TCEP, pH 8.3. Bruke en dialyse membran molekylvekt cutoff som er mindre enn størrelsen på protein endres (f.eks bruker en 3500 Da cutoff for ~ 17,500 Da EFSAM).
  3. Etter 24 h på 4 ° C, overføre prøven fra dialyse posen inn i et microcentrifuge rør. Legg DMSO-solubilized glukose-5-MTS til en siste konsentrasjon av 2 mM.
  4. Ruge prøven i mørket 1t ved omgivelsestemperatur. Under 1t inkubasjonstiden, blande løsningen av milde tappe av røret hvert 10 min.
  5. Deretter nytt exchange protein i siste eksperimentelle bufferen som inneholder ingen reduksjonsmiddel ved dialyse på 4 ° C som beskrevet i trinn 4.2 eller av sentrifugal ultrafiltrasjon. Fremgangsmåten for ultrafiltrasjon, konsentrere ~1.5 mL protein prøve å < 0,5 mL og senere fortynne i samme presisjonstørking med eksperimentelle bufferen. Gjenta dette konsentrasjon-fortynning trinnet to ganger slik at det totalt er minst 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. Bruk 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7.5 som eksperimentelle bufferen for EFSAM,.
  6. Forberede prøven electrospray ionization massespektrometri ved dialyse eller ultrafiltrasjon exchange som beskrevet i trinn 4.2 og 4.5, henholdsvis i 25 mM ammonium bikarbonat eller 25 mM ammonium acetate. Hvis bruker dialyse, kontrollerer du utveksle minst tre ganger for å fjerne eventuelle gjenværende NaCl og CaCl 2 salter.
  7. Finne ut nøyaktig massen (dvs. ± 1 Da) av proteinet rundt med electrospray ionization masse massespektrometri 48 , 49. Forventer hver kovalente glukose tillegg til en Cys thiol via methanethiosulfonate kjemiske legge 281.3 Da til protein masse (dvs. legge til 360.4 Da for glukose-5-MTS og trekke 79,1 Da for lm 3 så 2 forlate gruppen under kovalente vedlegg).

5. Løsning NMR vurdering av modification effektivitet og strukturelle forstyrrelser.

  1. Sikre konsentrasjonen av endret protein er > 100 μM etter glukose vedlegg og endelig buffer exchange. For EFSAM, beregne protein konsentrasjon bruke en UV utryddelse koeffisient på 280 nm 1,54 (mg mL - 1) cm - 1.
  2. Supplement protein løsningen med 60 μM 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syre (DSS) for shimming og puls kalibrering og 10% (v/v) D 2 O for signalet låsen. For høy signal-til-støy-bruk 600 μL prøver i frekvens-matchet 5 mm NMR rør, settes inn i et minimum 600 MHz spectrometer utstyrt med en trippel resonans Blåsyre kryogene sonde.
  3. Samle standard 1 H - 15 N HSQC spectra som tidligere detaljert 50 , 51 temperatur, 1 H og 15 N feie bredder, forbigående og tilvekst * som passer for bestemt prøven. For EFSAM spectra, bruk 20 ° C, 256 1 H transienter, 64 15 N dimensjon intervaller og 1 H og 15 N feie bredder satt til 8000 og 1800 Hz, henholdsvis.
  4. Etter oppkjøpet av glycosylated protein spekteret, legge til dithiothreitol (DTT) til NMR prøven fra en 1 M aksje til en siste konsentrasjon av 15 mM. DTT fjerner glukose moiety fra protein ved reduksjon av disulfide-mediert vedlegget.
  5. Kjøpe en andre 1 H - 15 N HSQC under disse redusert/uendret forhold, gir en referanse spektrum for å vurdere endring effektivitet og strukturelle forstyrrelser forårsaket av at glukose.
  6. Behandle NMR dataene med NMRPipe som detaljert tidligere 52. Sikre at behandling minimal inkluderer datakonvertering, innfasing, løsemiddel undertrykkelse, Fourier transform og første visualisering av til spectra.
  7. Vurdere endring effektiviteten ved å måle amid peak intensitet og kjemiske Skift verdier i de endrede og redusert spectra med NEASY plugin på CARA 53. Sørg for å evaluere peak intensiteten av Cys amid både glukose knyttet og redusert spectra. Hvis Cys amid pålitelig ikke finnes i begge spectra, bruke intensiteten av rester ved siden av Cys som en avlesning.
  8. Beregn effektiviteten som intensiteten av amid fra Cys endret spekteret delt intensiteten av amid fra Cys-redusert (i.e. DTT-behandlet) spekteret, multiplisert med 100:
    Equation 1, der im er intensiteten av amid i Cys endret spektrum og R er intensiteten av amid i Cys-redusert spektrum. Eventuelt vurdere mener effektivitet over flere amid topper:
    Equation 2, der effektivitet i er separat bestemt effektiviteten beregnes for hvert rester, jeg, og n er antall rester brukes i beregningen.
  9. Beregner kjemiske Skift forstyrrelser (CSP) fra kjemiske Skift forskjellene mellom de to spectra observert i 15 N og 1 H dimensjoner av hver topp og normalisere for større 15 N kjemiske Skift området ved hjelp av følgende formel:
    Equation 3, der ΔH er ppm endringen i proton dimensjon og ΔN er ppm endringen i nitrogen dimensjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første trinnet i denne fremgangsmåten krever mutagenese av kandidaten glykosylering rester til Cys rester som kan endres ved hjelp av glukose-5-meter EFSAM har ingen endogene Cys rester, så ingen spesielle hensyn må gjøres før den mutagenese. Imidlertid må innfødt Cys rester være mutert til ikke kan endres rester før du utfører beskrevet kjemi. Minimal effekten den opprinnelige strukturen, foreslår vi at du utfører en global orden justering av protein av interesse og bestemme hvilke andre rester er funnet mest ofte på den endogene Cys stillingen(e). Cys mutasjonen til disse andre rester som finnes naturlig i andre organismer kan ha minst virkningen på proteinstruktur. Hvis endogene Cys rester er strengt bevart, anbefaler vi mutere til Ser som er den mest strukturelt ligner Cys. Figur 1 viser en typisk PCR mutagenese gel vurdere hvor vellykket PCR reaksjonen, med forsterket DNA eksemplet demonstrerer several-fold høyere intensitet enn en kontroll unamplified mal pET-28a DNA som ble brukt for PCR. De neste trinnene inkluderer mal DNA fordøyelsen og transformasjon til E. coli plasmider reparasjon. Etter plasmider forplantning i flytende kultur, plasmider isolasjon og bekreftelsen av mutation(s) av sekvensering, kan muterte vektoren brukes til protein uttrykk. Figur 2A viser en typisk elueringsrør profil av EFSAM fra kolonnen anion exchange i forhold til økende NaCl konsentrasjoner. Figur 2B viser renheten av EFSAM på Coomassie blå-farget SDS side gels.

Etter ervervelsen ren protein, brukes en rekke dialyse trinn å knytte glukose moiety via MTS reaksjon med gratis thiol. Figur 3A viser et bilde av typiske oppsettet av et lite protein volum forseglet i dialyse membran av membran klipp og inneholdt i en stor 1 liters kanne som inneholder bufferen rundt. En innledende kontroll av suksessen av modifikasjonen kan utføres av massespektrometri. Figur 3B viser et representativ electrospray masse EFSAM endret på et enkelt Cys thiol. Etter etableringen av protokollen for et bestemt protein, modifikasjon effektivitet og strukturelle forstyrrelser kan vurderes fra en enkelt jevnt 15N-merket prøven. 1H -15N-HSQC spekteret er kjøpt før og etter tillegg av reduksjonsmiddel DTT (figur 4A). Beregninger av endring effektiviteten kan gjøres via en sammenligning av amid peak intensiteten i de modifisert og redusert spectra som beskrevet i protokollen trinn 5,8 (figur 4B). Til slutt, når kjemiske Skift tildelinger er kjent for en protein, CSP som relatere til strukturelle endringer kan beregnes som beskrevet i trinn 5.9 (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: DNA agarose gel viser forsterkning sjekk av malen vektor med mutagene primere.
Bildet viser en 1,0% (w/v) agarose gel med DNA markør (M), vektor kontroll (VC) og PCR-forsterket mal (PCR). DNA ble skilt ved geleelektroforese på 120 V for 45 min i 0,5 x TAE buffer. Totalt 0,5 ng av VC ble lastet inn, tilsvarer mengden mal lastet inn PCR kjørefelt. Gel var farget med ethidium bromide (~0.5 μg/mL) for 20 min før visualisering under UV-lys (302 nm). Gel viser høy forsterket DNA nær forventede størrelsen på vektoren (svart pilspiss). Andre bandet i PCR kjørefelt kjører mellom 1000 og 1500 bp markør bandene sannsynlig representerer et nonspecifically forsterket PCR-produkt. Intensitetsnivået forsterket DNA må være høyere enn VC intensitetsnivået anses som vellykket. Flere andre DNA fargestoffer kan brukes som mindre mutagent, tryggere alternativer for ethidium bromide flekker (se for eksempel 57). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Typisk brukt kromatografiske rensing og renheten sjekk for STIM1 EF-SAM.
(A) Anion exchange kromatografi elueringsrør profil av STIM1 EF-SAM. Etter manuell binding brukes EF-SAM anion exchange kolonnen (Q FF) på grunnleggende pH og lav NaCl konsentrasjon med en sprøyte og AKTA FPLC (GE Healthcare) til å elute protein med NaCl gradering. Tilsettes overvåkes av AKTA ved hjelp av UV 280 nm signalet over en 0-60% (v/v) gradient 1 M NaCl. (B) Coomassie blå-farget SDS side gel av elueringsrør fraksjoner (A). Denaturing protein gel avslører at EF-SAM elutes i to store topper på ~ 250 mM og ~ 450 mM NaCl. Rensing protokollen gir > 95% ren EF-SAM som gjenspeiles av mangel på noen miljøgifter bandet vises i Coomassie blå-farget gel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Dialyse oppsett og bekreftelse av i vitro protein glykosylering.
(A) typisk dialyse installasjonen brukes for i vitro tilknytning av glukose til Cys thiol via MTS reaktivitet. Bildet viser ~1.5 mL protein i dialyse rør bufret mot ~ 1 L eksperimentelle buffer. Det er viktig at bufferen er stadig rørt for å sikre fullstendig utveksling. Bildet viser et microcentrifuge rør festet til overmål dialyse slangen å hindre senkingen av dialyse posen og skade av roterende rør bar. (B) Electrospray ionization mass spekteret av modifisert Asn171Cys EF-SAM protein. Massespektrometri er en praktisk og nøyaktig tilnærming å vurdere om endring prosedyren var vellykket. En typisk masse chromatogram vises med teoretisk og målt massene av uforandret og modifisert Asn171Cys EF-SAM angitt. Fleste av utvalget masse tilsvarer en Makromolekyl som i ~1.3 Da av forventet teoretisk massen av glukose-konjugerte Asn171Cys EF-SAM. Dataene i (B) er replotted og endret fra 42. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Løsning NMR vurdering av endring effektivitet og strukturelle forstyrrelser fra en enkelt NMR prøve.
(A) 1 H -15N-HSQC spectral overlapping av glukose-konjugerte Asn131Cys EFSAM før (rød crosspeaks) og etter (svart crosspeaks) tillegg av 15 mM DTT. Overlegg viser tydelig flere rester-spesifikke amid kjemiske Skift endringer indikativ både endring av protein og strukturelle forstyrrelser. Den røde boksen viser Asn131Cys amid. (B) bratt stigning visning av 1H -15N-HSQC regionen Asn131Cys amid. Intensiteten av Asn131Cys amid toppen i endret spektrum (im) deles intensiteten i redusert (uendret) spektrum (jegR) for beregning av effektivitet (vist). En beregning av mener effektiviteten av flere tegnet rester gir et bedre estimat effektivitet, inkludert estimert feil. Mener effektiviteten vises for Asn131Cys EFSAM basert på 5 rester (i.e. 129-133). (C) Normalized kjemiske Skift forstyrrelser forårsaket av glukose Bøyning Asn131Cys EFSAM protein. Settet med HSQC eksperimenter samlet på en enkelt prøve før og etter supplere med reduksjonsmiddel ikke bare gir en praktisk anslå endring effektivitet av topp intensitet analyse [vises i (B)], men gir også data evaluering av strukturelle endringer forbundet med endringen. Glukose Bøyning forårsaker de største forstyrrelser lokalisert nær posisjon 131; men avdekker denne analysen forstyrrelser som er uventet utelukkende basert på sekvens nærhet, angir verdien i denne analysen. Dataene i (C) er replotted og endret fra 42. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

STIM1 mutasjonen retningb DNA sekvensc
Asn131Cys fremover 5'-GTCATCAGAAGTATACTGTTGGACCGTGGATGAGG-3 "
Asn131Cys omvendt 5'-CCTCATCCACGGTCCAACAGTATACTTCTGATGAC-3 "
Asn171Cys fremover 5'-CCAAGGCTGGCTGTCACCTGCACCACCATGACAGGG-3 "
Asn171Cys omvendt 5-CCCTGTCATGGTGGTGCAGGTGACAGCCAGCCTTGG-3 "
en STIM1 aminosyre nummerering basert på NCBI tiltredelse AFZ76986.1.
b "Omvendt" primer tilsvarer omvendt supplement sekvensen av "frem" primer.
c Understreket codon trilling tilsvarer Cys mutasjon.

Tabell 1. Eksempel oligonucleotide (primer) sekvenser for Asn til Cys mutagenese innen pET-28a STIM1 EFSAM konstruere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein glykosylering er en post-translasjonell modifikasjon der sukker covalently knyttet til polypeptides primært gjennom sammenhengene til aminosyre siden kjeder. Så mange som 50% av pattedyr proteiner er glycosylated 54, der glycosylated proteinene kan senere har et variert utvalg av effekter fra endre biomolecular forpliktende tilhørighet, påvirke protein folding, endre kanal aktivitet, målretting molekyler for fornedrelse og cellular handel, for å nevne noen (omtalt i33). Den viktige rollen glykosylering i pattedyrceller fysiologi er tydelig av de flere hundre proteiner utviklet seg til å bygge hele mangfoldet av pattedyr glycan strukturer 33. Endret N- og O- glykosylering mønstre har vært forbundet med mange sykdommer sier inkludert prostata (økt og redusert), bryst (økt og redusert), leveren (økt), eggstokkene (økt), bukspyttkjertelen (økt) og mage kreft (økt) 55. Videre glykosylering av Tau, huntingtin, α-synuclein har blitt funnet for å regulere giftigheten av disse proteinene forbundet med Alzheimers og Parkinsons, Huntingtons sykdommer 56, og en gruppe av medfødt lidelser av glykosylering har vært identifisert som følge av arvelige defekter i enzymer som megle glykosylering 54. Dermed har forstå nøyaktig Biofysiske, biokjemiske og strukturelle effekten av glykosylering potensial til å påvirke enormt vår forståelse av protein regulering og funksjon i helse og sykdom.

Ti sukker byggesteinene som fører til mangfoldet av glycan strukturer i pattedyr glycome inkluderer fucose, galaktose, glukose, N- acetylgalactosamine, N- acetylglucosamine, glucuronic acid, iduronic syre, mannose, Sialic syre og xylose 33. Mens N- glykosylering linker alltid en N- acetylglucosamine sukker direkte til protein, kan O- glykosylering resultere fra noen av N- acetylgalacotose, N- acetylglucosamine, xylose, fucose, glukose eller galaktose covalently knyttet til polypeptid. For å begynne å forstå hvordan disse sukker umiddelbart ved siden av protein overflaten påvirke egenskapene Biofysiske og strukturelle, beskriver vi her en tilnærming for å knytte nettstedet-selektivt sukker til Cys rester via thiols utviklet i protein sekvens. Her rester som er endogenously glycosylated erstattes av Cys og endret i vitro via en enkel kjemiske tilnærming. På denne måten kan én eller flere glykosylering nettsteder vurderes for å tease ut bidrag av hver bestemt område, samt de kumulative endringene den folding stabilitet samt den generelle strukturen og funksjonen av protein.

Nylig ble denne tilnærmingen brukt med EFSAM å individuelt og kumulativt vurdere rollen som Asn131 og Asn171 N- glykosylering nettsteder 42. Mutasjonen til Cys og kovalente vedlegg av glukose til webområdene Asn131 eller Asn171 avslørte en redusert Ca2 + forpliktende tilhørighet og undertrykt stabilitet. Når de to områdene ble samtidig endret med glukose vedlegg fellingene i forpliktende tilhørighet og stabilitet ble kraftig fører til forbedret oligomerization tilbøyelighet i vitro. Strukturelt, viste fremgangsmåten beskrevet her at Asn131 eller Asn171 endringene gjensidig forurolige kjernen α8 helix seg i SAM domene, umiddelbart ved EF-hånd paret. Dette strukturelle analysen forklarer hvordan glukose endringer på overflaten av proteinet føre til en konvergerende og kraftig strukturelle endringer i EF-hånd: SAM grensesnitt som til slutt destabilizes protein og forbedrer SOCE 42.

Mens anvendelsen av dette området-selektive tilnærming hjalp kaste lys over hvordan en enkle sukkerarter nær overflaten av EFSAM effekter folding, stabilitet og struktur, denne prosedyren kan enkelt endres for å knytte lengre karbohydrater gjelder for ER, Golgi og PM lokalisering (i.e. glykosylering stater med forskjellig modenhet), forutsatt at det er en pålitelig kilde for disse karbohydrater som inneholder funksjonelle grupper som kan koble til thiols som MTS. MTS er å foretrekke siden thiol endringen er reversibel bruker en reduksjonsmiddel og en referanse spectrum kan lett skaffes. Denne tilnærmingen kan også tilpasses koble andre post-translasjonell moieties til protein som lipider. Samtidig er det flere begrensninger på denne tilnærmingen som bør vurderes. Første metoden er avhengig av mutasjon av glykosylering områder Cys som kan påvirke struktur, stabilitet og folding selv i fravær av endringer glukose. Tilsvarende må innfødt Cys rester i protein også være muterte for å hindre glukose vedlegg på ikke-glycosylated nettsteder. I tillegg fremmer tillegg av Cys rester ofte inkludering kroppen formasjon i bakterier Cys crosslinking og misfolding, gjør rensing mer utfordrende. Likevel gir denne område-selektiv Cys-crosslinking fremgangsmåten beskrevet her en kontrollert betyr å tease ut strukturelle, biokjemiske og Biofysiske effekten av spesifikke glykosylering eksperimenter som krever høy homogen protein. Effektene av ikke-innfødte Cys rester på strukturen, stabilitet og folding kan bare konstatert i fravær av endringer i forhold til vill-type protein attributter 42. Tatt sammen med funksjonelle data innhentet i eukaryote celler som uttrykker endring-blokkerende mutant versjoner av protein (f.eks Asn-til-Ala), vil den tiden beskrevet tilnærmingen gi ny innsikt i strukturelle mekanismer protein regulering av post-translasjonell modifikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (05239 til P.B.S.), kanadiske fundament for innovasjon/Ontario Research Fund (til P.B.S.), prostata kreft bekjempe Foundation - Telus Ride for far (til P.B.S.) og Ontario Graduate Scholarship (til Y.J.C. og født).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), Epub 2005 May 2002 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L. Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. Agostinis, P., Afshin, S. , Bristol-Myers Squibb. Syracuse, NY. 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Immunologi problemet 128 glykosylering methanethiosulfonate cystein thiol endring stromal samhandling molekyl-1 EFSAM løsning kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi massespektrometri
Målretting cystein Thiols for <em>in Vitro</em> områdespesifikke glykosylering rekombinante proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S.,… More

Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter