Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Målretning cystein dithioler for in Vitro lokationsspecifikke glykosylering af rekombinante proteiner

Published: October 4, 2017 doi: 10.3791/56302
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario
* These authors contributed equally

Summary

Biokemiske og strukturelle analyser af glykosyleret proteiner kræver relativt store mængder af homogene prøver. Her præsenterer vi en effektiv kemisk metode for lokationsspecifikke glykosylering af rekombinante proteiner renset fra bakterier ved at målrette reaktive Cys dithioler.

Abstract

Stromale interaktion molekyle-1 (STIM1) er en type-jeg transmembrane protein beliggende på endoplasmatiske reticulum (ER) og plasma membraner (PM). ER hjemmehørende STIM1 regulerer aktiviteten af PM Orai1 kanaler i en proces kendt som lagre drives calcium (Ca2 +) post, som er den vigtigste Ca2 + signaling proces, der drev immunresponset. STIM1 gennemgår posttranslationelle N- glykosylering på to luminale Asn websteder inden for Ca2 + sensing domæne af molekylet. Men de biokemiske, Biofysisk, og struktur biologiske virkninger af N- glykosyleret STIM1 var dårligt forstået indtil for nylig på grund af manglende evne til at let opnå høje niveauer af homogene N- glykosyleret protein. Her, beskriver vi gennemførelsen af en in vitro- kemiske tilgang, som lægger glukose fraspaltning til specifikke protein websteder gælder for forståelsen af de underliggende effekter af N- glykosylering på protein struktur og mekanisme. Ved hjælp af løsning Kernemagnetisk resonans-spektroskopi vurdere vi både effektiviteten af ændringen og de strukturelle konsekvenser af glucose vedhæftet fil med en enkelt prøve. Denne tilgang kan let tilpasses for at studere de utallige glykosyleret proteiner findes i naturen.

Introduction

Gemme drives calcium (Ca2 +) post (SOCE) er den store vej som immunceller tage op Ca2 + fra det ekstracellulære rum i cytosol. I T-lymfocytter binder T-cellereceptorer placeret på plasma membran (PM) antigener, der aktiverer protein tyrosin kinaser (gennemgik i 1,2,3). En fosforylering kaskade fører til aktivering af fosfolipase-γ (PLCγ), som efterfølgende medierer hydrolyse af membran phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) til diacylglycerol og inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 er en små diffusible messenger, som binder til IP3 receptorer (IP3R) på det endoplasmatiske reticulum (ER) dermed åbne denne receptor kanal og tillader Ca2 + til at flyde ned koncentration gradient fra Skadestuen lumen til cytosol (gennemgik i 4). Receptor signalering fra G-protein koblet og tyrosin kinase receptorer i en lang række andre overgearet og ikke-overgearet celle typer bly til den samme produktion af IP3 og aktivering af IP3Rs.

På grund af finite Ca2 + lagerkapacitet på Skadestuen, IP3-medieret frigivelse og deraf følgende stigning i cytosole Ca2 + er kun forbigående; men denne udtynding ER luminale Ca2 + dybt effekter stromale interaktion molekyle-1 (STIM1), en type-jeg transmembrane (TM) protein for det meste findes på ER membran 5,6,7. STIM1 indeholder en lumen-orienterede Ca2 + sensing domæne der består af en EF-hand par og sterile α-motiv (EFSAM). Tre cytosole-orienterede rullet coil domæner er adskilt fra EFSAM af domænet enkelt TM (gennemgik i 8). Efter ER luminale Ca2 + udtynding gennemgår EFSAM en destabilisering-kombineret oligomerisering 7,9 , som medfører strukturelle rearrangementer af TM og rullet coil domæner 10. Disse strukturelle ændringer kulminerer i en diffusering af STIM1 på ER-PM vejkryds 11,12,13,14 gennem interaktioner med PM phosphoinositides 15, 16 og Orai1 subunits 17,18. Orai1 proteiner er PM underenheder, som samles til form Ca2 + -kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 interaktioner i ER-PM vejkryds lette en åben Ca2 + release aktiveret Ca2 + (CRAC) kanal kropsbygning som muliggør bevægelse af Ca2 + i cytosol fra de høje koncentrationer af den ekstracellulære rum. I immunceller, de vedvarende cytosole Ca2 + højder via CRAC kanaler fremkalde den Ca2 +- calmodulin/calcineurin afhængige dephosphorylation af den nukleare faktor af aktiverede T-celler, der efterfølgende ind kernen og begynder transkriptionel regulering af gener fremme T-celle aktivering 1,3. Processen med CRAC kanal aktivering af STIM1 23,24 via agonist-induceret ER luminale Ca2 + udtynding og den deraf følgende vedvarende cytosole Ca2 + højde kaldes kollektivt SOCE 25. SOCE i T-celler afgørende rolle fremgår af undersøgelser viser, at arvelige mutationer i både STIM1 og Orai1 kan forårsage svær kombineret immundefekt syndromer 3,19,26, 27. EFSAM indleder SOCE efter sensing ER-luminale Ca2 + nedbrydning via tabet af Ca2 + koordinering på den kanoniske EF-side, i sidste ende fører til destabilisering-kombineret selvstændig forening 7, 28,29.

Glykosylering er kovalent udlæg og forarbejdning af oligosaccharid strukturer, også kendt som glycans, gennem forskellige biosyntetiske trin i ER og Golgi (gennemgik i 30,32,33). Der er to fremherskende typer af glykosylering i eukaryoter: N-sammenkædet og O-linket, afhængigt af den specifikke aminosyre og atom bridging koblingen. I N- glykosylering, glycans er knyttet til side kæde AMID af Asn, og i de fleste tilfælde opstår trinnet indledning på Skadestuen som polypeptid kæde flytter ind i lumen 34. Det første trin i N- glykosylering er overførsel af en fjorten-sukker core struktur bestående af glukose (Mona), mannose (mand) og N- acetylglukosamin (GlcNAc) (dvs. Ole3mand9GlcNAc2) fra en ER membran lipid af en oligosaccharyltransferase 35,36. Yderligere skridt, såsom kavalergang eller overførsel af glucose restkoncentrationer, er katalyseret på Skadestuen af specifikke glykosidaser og glycosyltransferases. Nogle proteiner, der forlader på Skadestuen og flytte ind i Golgi kan være yderligere forarbejdede 37. O- glykosylering refererer til tilsætning af glycans, normalt til side kæde hydroxylgruppe Ser eller Thr restkoncentrationer, og denne ændring forekommer udelukkende i Golgi kompleks 33,34. Der er flere O- glycan strukturer, som kan bestå af N- acetylglukosamin, fucose, galactose, og sialic syre med hver monosakkarid tilføjet sekventielt 33.

Mens ingen bestemt sekvens er blevet identificeret som forudsætning for mange typer af O- glykosylering, en fælles konsensus sekvens har været forbundet med N-forbundet ændring: Asn-X-Ser/Thr/Cys, hvor X kan være enhver aminosyre undtagen Pro 33. STIM1 EFSAM indeholder to af disse konsensus N- glykosylering sites: Asn131-Trp132-Thr133 og Asn171-Thr172-Thr173. Tidligere undersøgelser har vist, at EFSAM kan være N- glykosyleret i pattedyrceller ved Asn131 og Asn171 38,39,40,41. Men tidligere undersøgelser af konsekvenserne af N- glykosylering på SOCE har været inkongruente, foreslår undertrykt, forstærkede eller ingen effekt af denne posttranslationel modifikation på SOCE aktivering 38,= "xref" > 39,40,41. Forskning på de underliggende biofysiske, biokemiske og strukturelle konsekvenser af EFSAM N- glykosylering er således afgørende at begribe de regulerende virkninger af denne ændring. På grund af kravet om, at høje niveauer af ensartede proteiner i disse in vitro- eksperimenter, blev en site-selektiv tilgang til kovalent tillægger EFSAM glukose fraspaltning anvendt. Det er interessant, forårsaget Asn131 og Asn171 glykosylering strukturelle ændringer, der konvergerer inden for EFSAM kernen og forbedre de biofysiske egenskaber, som fremmer STIM1-medieret SOCE 42.

Glycosyl grupper kemiske tillægger Cys dithioler har været veletablerede af en skelsættende arbejde, som første gang demonstreret nytte af dette enzym-fri tilgang til forståelsen af de lokationsspecifikke effekter af glykosylering på protein funktion 43 , 44. for nylig og med hensyn til STIM1, Asn131 og Asn171 rester var muteret til Cys og glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] blev brugt kovalent linke glukose til gratis dithioler 42. Her, beskriver vi denne tilgang, som ikke kun bruger mutagenese for at indarbejde site specifikke Cys restkoncentrationer for ændring, men gælder også løsning Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi til at hurtigt at vurdere både ændring effektivitet og struktur forstyrrelser som følge af glykosylering. Især denne generelle metode er let at tilpasse til at studere virkningerne af enten O- eller N- glykosylering af nogen recombinantly produceret protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Polymerasekædereaktionen (PCR)-medieret site-directed mutagenese til indbygning af Cys i en bakteriel pET-28a udtryk vektor.

  1. Bestemmes koncentrationen af pET-28a vektor (dvs. dobbelt strandede DNA) ved hjælp af en ultraviolet (UV) udryddelse koefficient af 0,020 (μg/mL) cm -1 på 260 nm.
  2. Syntetisere et par supplerende mutagene primere for hver Cys mutation sådan at jeg) der er et minimum af 15 nukleotider supplement til skabelonen før første base uoverensstemmelse og 15 nukleotider supplement til skabelonen efter den endelige base uoverensstemmelse, ii) samlede primer længde ikke overstiger 45 nukleotider, og iii) en guanin eller cytosin er placeret på første og sidste nukleotid placeringen af hver primer (tabel 1). Sikre primer syntese udføres ved hjælp af en 0,025 μmol skala og patron rensning.
  3. Ved hjælp af en high fidelity DNA polymerase, oprettet to 20 µL PCR reaktion blandinger: én, der indeholder den fremskudte primer og andet som indeholder den omvendte primer. Forbered hver blanding indeholder endelige koncentration af 1 x PCR buffer med 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP'er, 0,5 μM primer, 0,4 μL DMSO, 1,25 ng/μl skabelon DNA, 0,02 U/μL high fidelity DNA polymerase.
  4. Termisk cyklus de særskilte blandinger ved hjælp af en tre-trins protokol: 98 ° C til 30 s (denatureringen), 53-56 ° C i 30 s (glødning), 72 ° C i 30 s kilobase(kb) -1 (udvidelse) af DNA-template. Gentag programmet temperatur for 5 cyklusser og tilføje en sidste 72 ° C udvidelse trin i 7,5 min.
  5. Efter den første PCR med frem og bak primere i separate rør, kombinere produkter ind i et enkelt rør (dvs. 40 μL samlede) og fortsætte PCR reaktion til en yderligere 20 cykler bruge de samme cykel parametre som beskrevet i trin 1.4.
  6. Electrophorese 15 μl PCR reaktionsblandingen på en 1% (w/v) Agarosen gel ved hjælp af 0,5 x Tris, eddikesyre, ethylen diamin tetra eddikesyre (EDTA) kører buffer (TAE). Som kontrol, electrophorese et tilsvarende beløb af DNA, som ikke er blevet forstærket af PCR-template og en alikvot af reference DNA ladder, som indeholder markør bands både større og mindre end de forventede PCR produktstørrelse.
  7. Efter elektroforese på 120 V på 40 min, dykke gel i vand, der indeholder 0,5 μg/mL ethidiumbromid og omrystes i 30 min. ved stuetemperatur. Bekræfte skabelonen fuld længde er blevet forstærket af de mutagene primere som en stigning i den relative ethidium bromid fluorescerende intensiteten af forstærkede bandet i forhold til kontrol skabelon band under UV-lys (302 nm).
    1. Hvis ingen forstærkning er tilsyneladende, Gentag PCR efter justering udgloedning temperatur i 0,5 ° C intervaller mellem 53-56 ° C temperaturområde.
  8. Efter bekræftelse af forstærkning af skabelonen af de mutagene primere, behandle de resterende ~ 25 μl PCR reaktionsblanding med DpnI begrænsning enzym til at fordøje de methylerede DNA-template. Bruge DpnI på 0,5 µL (10 enheder) pr. 25 μl PCR reaktionsblanding og en endelig koncentration på 1 × DpnI reaktion buffer. Inkuber i 2,5 timer ved 37 ° C.
  9. Efter skabelon fordøjelse, tilføje ~ 5-10 μl af fordøjet blandingen til 100 µL af heat shock kompetente DH5α Esherichia coli celler i en 1,75 mL microcentrifuge tube. Inkuber celle-DNA blandingen på isen for 60 min.
  10. Heat shock celle-DNA blandingen i microcentrifuge røret på 42 ° C til 45 s på en tør varme blok. Efter inkubation blanding på is i 3 min, tilsættes 900 μl stuetemperatur Luria-Bertani bouillon (LB) til cellerne og overføre den samlede cellesuspension til en steril 14 mL runde-bunden tube.
  11. Ruger cellesuspension ved 37 ° C i 90 minutter med konstant ryster på 190 rpm.
  12. Efterfølgende overføre cellesuspension tilbage i en 1,75 mL microcentrifuge rør og centrifuger på 10.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  13. Efter centrifugering, fjerne 900 μl af supernatanten og resuspend bakterieceller af blid pipettering i de resterende 100 μL af LB.
  14. Overføre den resulterende koncentreret cellesuspension på en LB-agar plade der indeholder antibiotika, som er selektiv for udtryk vektor (dvs. 60 μg/mLKanamycin). Aseptisk sprede suspension jævnt på agar plade, og der inkuberes i ~ 16 timer ved 37 ° C.
  15. Den følgende dag, podes en enkelt koloni fra pladen til 5 mL flydende LB indeholdende antiobiotic udvælgelse pres (dvs. 60 μg/mL Kanamycin). Vokser den flydende kultur natten over ved 37 ° C med konstant ryster på 37 ° C.
  16. Isolerer og rense den opformerede plasmid fra E. coli celler ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit baseret på alkalisk lysis procedure 45.
  17. Bekræfte mutation af interesse er til stede og i rammen korrekt læsning af Sanger DNA-sekventering af plasmid 46.

2. Ensartet 15 N-mærket protein udtryk i BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Bemærk: forskellige rekombinante proteiner kræver forskellige udtryk betingelser. Følgende er optimeret proceduren for udtryk af det menneskelige protein, STIM1 EFSAM.

  1. Omdanne udtryk vektor husly Cys mutationer (dvs. pET-28a-EFSAM) i BL21 ΔE3 codon (+) heat shock kompetente celler og plade på LB-agar plader der indeholder antibiotiske udvælgelse pres, som beskrevet i trin 1.9-1.14) med den følgende ændringer: direkte plade en 150 μl alikvot af ~ 1000 μL samlede cellesuspension på LB-agar plade uden behov for at koncentrere cellerne i et microcentrifuge rør ved centrifugering.
  2. Den følgende dag, aseptisk overføre en enkelt koloni i en 200 mL Erlenmeyer-kolbe indeholdende 20 mL af LB suppleres med passende antibiotika (dvs. 60 af μg/mL kanamycin for pET-28a-EFSAM). Vokse denne flydende starter kultur natten (dvs. ~ 16 h) ved 37 ° C med konstant ryster på ~ 190 rpm.
  3. Samme dag som trin 2.2, forberede M9 medium for 15 N-mærket protein udtryk ved autoklavering 1 L af M9 buffer salte (dvs. 42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH 2 PO 4, 8,6 mM NaCl, pH 7,4) i en 4 L erlenmeyerkolben. Når den er afkølet, filtrere en blanding af 20% (w/v) D-glucose, 1 M CaCl 2, 1 M thiamin, 1 M MgSO 4, 1 mg/mL biotin og 0,2 g/mL 15 N-NH 4 Cl gennem en 0,2 μm steril sprøjte filter i 1 L sterile M9 salt løsning så den endelige koncentrationen af disse komponenter er 0,2% (w/v) D-glucose, 100 μM CaCl 2, 50 μM thiamin, 1 mM MgSO 4, 1 μg/mL biotin og 1 mg/mL 15 N-NH 4 Cl.
  4. Den næste dag, aseptisk overføre 20 mL overnight flydende starter kultur i en 50 mL sterilt koniske rør og centrifugeres ved 2.400 × g i 15 min. at sammenpresse cellerne.
  5. Efter klaring LB medium, resuspenderes resulterende celle i 10 mL af M9 minimal medium og overføre resuspenderet pellet blandingen i 1 L af M9 minimal medium med antibiotika (dvs. 60 μg/mL kanamycin).
  6. Vokse M9 minimal medium indeholdende bakteriel starter kultur ved 37 ° C og ~ 190 rpm konstant ryster indtil den optisk tæthed på 600 nm (OD600) rækker 1 liter ~0.6-0,8.
  7. Når rækken specfified OD600 er nået, tilføje 200 μM af isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til at fremkalde protein udtryk.
  8. Efter IPTG tilsætning, fortsætte inkubere celler for protein udtryk ved stuetemperatur med konstant ryster på ~ 190 rpm for ~ 16 h (dvs. natten).
  9. Den næste dag, høste bakterier ved centrifugering ved ~ 10.000 × g, 4 ° C i 30 min.
  10. Dekanteres LB og overføre celle pellet i en 50 mL konisk slange. Gemme pellet ved-80 ° C indtil rensning.

3. Oprensning af rekombinante protein fra E. coli.

Bemærk: forskellige rekombinante proteiner kræver særskilt rensning procedurer. Følgende er protokol til 6 & #215; Hans-mærket EFSAM rensning fra inklusion organer udtrykt fra pET-28a konstruere.

  1. Manuelt homogeniseres frosne bakteriel celle pellet i 6 M guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) og 5 mM β-mercaptoethanol ved hjælp af en motoriseret 10 mL overførsel pipette. Tilsættes ca 40 mL guanidin-HCl pr 5 mL våd celle pellet for dette trin.
  2. Følgende et 90 min inkubation ved omgivende temperatur med konstant rotation i et hybridisering ovn, centrifugeres blandingen på ~ 15.000 × g, 8 ° C i 40 min at adskille uopløselige celle debris (dvs. pellet) fra opløseligt protein blanding (dvs. supernatanten).
  3. Tilføje 750 µL af en 50% (v/v) Ni 2 +-nitrilotrieddikesyre syre Agarosen perle gylle til den klarede lysate og inkuberes i en anden 90 min ved stuetemperatur med inversion i en hybridisering ovn.
  4. Efterfølgende, fange 6 × hans-mærkede protein bundet til Ni 2 + ved at indsamle Agarosen perlerne i en tyngdekraft flow protein oprensning kolonne. Tillade lysate at flyde gennem kolonnen helt før flytter til trin 3.5.
  5. Vaske de indsamlede perler tre gange med 10 mL 6 M urinstof, 20 mM Tris-HCl pH 8 og 5 mM β-mercaptoethanol. Sikre, at den hele 10 mL passerer gennem kolonnen før hver efterfølgende 10 mL Wash
  6. Elueres proteiner i en serie af 2 mL fraktioner ved hjælp af 6 M urinstof, 20 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM imidazol og 5 mM β-mercaptoethanol med en 90 s inkubationstiden mellem fraktioner. Sikre at de hele 2 mL passerer gennem kolonnen før hver efterfølgende eluering trin.
  7. På nuværende tidspunkt bekræfte protein af interesse er til stede i de eluted fraktioner af Coomassie blå-farvede sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ved hjælp af metoden Laemmli 47. Vurdere protein størrelse, antal og renhed ved sammenligning mod standard molekylvægt markør bands, som begge er mindre end og større end den forventede molekylvægt af protein interesse.
  8. Pool elueret protein fraktioner i en dialyse membran med en 3.500 Da Molekylær vægt cutoff og inkuberes i 1 L hvorved man genfolder buffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM CaCl 2, pH 8) ved 4 ° C natten mens bufferen er der rørte ved en magneti c omrører.
  9. Efter ~ 16 h hvorved man genfolder tid, tilføje ~ 1 U af thrombin pr. mg protein direkte til dialyse taske og inkuberes ved 4 ° C for en ekstra ~ 24 h.
  10. Kontrollere omfanget af de 6 × hans tag spaltning af Coomassie-blå farvning af ~ 15 μl protein delprøver taget fra dialyse posen, før og efter inkubation med thrombin som er electrophoresed på denatureringen polyacrylamidgeler (SDS-PAGE) ved hjælp af metoden Laemmli 47. Hvis en ~ 2 kDa skift i migration er observeret, svarende til de kløvet 6 × molekylvægt hans tag, fortsætte til trin 3.11; Hvis en brøkdel af ufordøjet protein rester, der kan påvises ved Coomassie-blå farvning, tilføje ~0.2 U af thrombin pr. mg protein direkte til dialyse taske og inkuberes ved 4 ° C for en ekstra ~ 24 h.
  11. Brug størrelse udstødelse eller ionbytning kromatografi yderligere rense protein. For anion exchange kromatografi af EFSAM, fjerne protein løsning fra dialyse taske og koncentrat ~ 10-fold ved hjælp af en centrifugal koncentrator ultrafiltrering med en 10.000 Da Molekylær vægt cutoff. Efterfølgende re fortyndes løsningen ~ 20-fold i et NaCl-fri buffer (20 mM Tris, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8).
  12. Reagensglasset en færdigpakkede anion Ionbytterkolonnen med 10 kolonne mængder af NaCl-fri bufferen beskrevet taktfast 3.11. Reagensglasset ved hjælp af buffer indlæses i en luer-lock sprøjte indeholdende ingen luftbobler ved at skubbe løsningen gennem kolonnen i en dråbevis måde og undgå sprøjte pres, som forårsager støt streams af løsning forlader kolonnen. Brug en stærk anionbytter (f.eks. crosslinked Agarosen med kvaternære ammonium funktionelle grupper).
  13. Indlæses protein opløsningen fortyndes i NaCl-fri buffer (trin 3.11) kolonne, som beskrevet i trin 3.12.
  14. Elueres proteiner i en gradient [dvs. 0 - 60% (v/v)] for at øge NaCl buffer (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8) ved hjælp af en to-pumpe hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system. Angive FPLC systemet til at indsamle ~1-1.5 mL fraktioner og overvåge protein eluering profil ved hjælp af UV-280 nm absorbans og en hastighed 0,5 mL/min.
  15. Identificere eluering toppe og fraktioner indeholder protein af interesse såvel som protein renhed Coomassie blå-farvede SDS-PAGE geler ved hjælp af metoden Laemmli 47.
  16. Pool fraktioner viser > 95% (dvs. taget som brøker, der viser kun et enkelt protein band på Coomassie-blå farvede geler) i en dialyse sæk og udveksling i eksperimentel buffer af interesse ved dialyse som beskrevet i trin 3.8.

4. Kemiske fastgørelse af glukose-5-MTS til protein af dialyse.

  1. Forbered en 55 mM stamopløsning af Nielsen-(β-D-glucopyranosyl) '-[2-methanethiosulfonyl) ethyl] urinstof (glukose-5-MTS) ved at opløse 10 mg af sammensat i 500 μl 100% (v/v) DMSO. Gemme ubrugte glukose-5-MTS oploeses i DMSO på -20 ° C.
  2. Forbered protein prøven for ændring af dialyzing 1,5 mL ~ 60 μM protein i 1 L ændring buffer består af 20 mM MOPPER, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 og 0,1 mM TCEP, pH 8.3. Bruge en dialyse membran molekylvægt cutoff, som er mindre end størrelsen på protein ændres (f.eks. bruge en 3.500 Da cutoff til ~ 17,500 Da EFSAM).
  3. Efter 24 timer ved 4 ° C, overføre prøven fra dialyse posen ind i et microcentrifuge rør. Tilføje den DMSO-solubilized glukose-5-MTS til en slutkoncentration på 2 mM.
  4. Ruger prøven i mørke i 1 time ved stuetemperatur. Under inkubationstiden 1 h Bland løsningen af blid aflytning af røret hver 10 min.
  5. Efterfølgende re udveksle proteinet i endelige eksperimentelle bufferen indeholder ingen reduktionsmiddel af dialyse ved 4 ° C, som beskrevet i trin 4.2 eller af centrifugal ultrafiltrering. For proceduren ultrafiltrering koncentrere ~1.5 mL protein prøve at < 0,5 mL og derefter fortyndes i den samme koncentrator med den eksperimentelle buffer. Gentag trinnet koncentration-fortynding to ekstra gange, således at den samlede udveksling er mindst 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. For EFSAM, bruge 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7,5 som eksperimentelle bufferen.
  6. Forberede prøven for electrospray Ionisation massespektrometri af dialyse eller ultrafiltrering exchange som beskrevet i trin 4.2 og 4.5, henholdsvis i 25 mM ammoniumbicarbonat eller 25 mM ammoniumacetat. Hvis du bruger dialyse, sikre du udveksle mindst tre gange til at fjerne enhver resterende NaCl og CaCl 2 salte.
  7. Bestemmer den nøjagtige masse (dvs. ± 1 Da) protein af interesse ved hjælp af electrospray Ionisation masse massespektrometri 48 , 49. Forventer hver kovalente glukose tilsætning til en Cys thiol via methanethiosulfonate kemiske at tilføje 281.3 Da at proteinet masse (dvs. tilføje 360.4 Da for glucose-5-MTS og fratræk 79.1 Da til CH 3, så 2 forlader gruppen under kovalente vedhæftet fil).

5. Løsning NMR vurdering af modifiication effektivitet og strukturelle perturbationer.

  1. Sikre koncentrationen af det ændrede protein er > 100 μM efter glukose udlæg og endelige buffer exchange. For EFSAM, skøn proteinkoncentration ved hjælp af en UV extinction koefficient på 280 nm 1,54 (mg mL - 1) cm - 1.
  2. Tillæg protein løsning med 60 μM af 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syre (DSS) til shims og puls kalibrering og 10% (v/v) D 2 O for signal lås. For højt signal-støj brug 600 μl prøver i frekvens-matchede 5 mm NMR rør, indsat i en minimum 600 MHz-spektrometer udstyret med en tredobbelt resonans HCN kryogene sonde.
  3. Indsamle standard 1 H - 15 N HSQC spektre som tidligere detaljerede 50 , 51 ved temperatur, 1 H og 15 N feje bredder, forbigående og tilvækst indstillinger for passende for den særlig prøve. For EFSAM spektre, brug 20 ° C, 256 1 H transienter, 64 15 N dimension ad gangen og 1 H og 15 N feje bredder sæt til 8.000 og 1.800 Hz, hhv.
  4. Efter erhvervelse af glykosyleret protein spektrum, tilføje dithiothreitol (DTT) til NMR-prøve fra en 1 M lager til en endelig koncentration på 15 mM. DTT fjerner glukose gruppe fra protein ved reduktion af disulfid-medieret udlæg.
  5. Erhverve en anden 1 H - 15 N HSQC under disse reduceret/uændrede betingelser, giver referencespektrum for at vurdere ændring effektivitet og strukturelle perturbationer forårsaget af glucose attachment.
  6. Proces i NMR data ved hjælp af NMRPipe som beskrevet tidligere 52. Sikre, at behandling af minimalt omfatter datakonvertering, afvikling, opløsningsmiddel undertrykkelse, Fouriertransformation og indledende visualisering af spektrene.
  7. Vurdere ændring effektivitet ved at måle akrylamid peak Støtteintensiteter og kemiske Skift værdier i de modificerede og reduceret spectra bruger NEASY plugin på CARA 53. Sørge for at evaluere peak intensiteten af Cys akrylamid både i glukose knyttet og reduceret spektre. Hvis Cys akrylamid ikke kan pålideligt beliggende i begge spektre, bruge intensiteter af restkoncentrationer støder op til Cys som en udlæsning.
  8. Beregn effektivitet som intensiteten af akrylamid fra Cys-modificerede spektret divideret med intensiteten af akrylamid fra Cys-reduceret (dvs. DTT-behandlet) spektrum, ganget med 100:
    Equation 1, hvor jeg M er intensiteten af akrylamid i Cys-modificerede spektrum og jeg R er intensiteten af akrylamid i Cys-reduceret spektrum. Alternativt, vurdere den gennemsnitlige effektivitet over adskillige akrylamid toppe:
    Equation 2, hvor effektivitet, jeg er separat målrettet effektivitet beregnet for hver rester, jeg, og n er det samlede antal restkoncentrationer bruges i beregningen af.
  9. Beregne kemiske Skift perturbationer (CSP) fra kemiske Skift forskellene mellem de to spektre observeret i 15 N og 1 H dimensioner af hver top og normalisering for en større 15 N kemiske Skift vifte med den følgende ligning:
    Equation 3, hvor ΔH er ppm ændringen i dimensionen proton og ΔN er ppm ændringen i dimensionen kvælstof.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første trin i denne fremgangsmåde kræver mutagenese af kandidat glykosylering restkoncentrationer Cys restprodukter, som kan ændres ved hjælp af glukose-5-MTS. EFSAM har ingen endogene Cys rester, så ingen særlige overvejelser skal foretages forud for den mutagenese. Dog skal indfødte Cys restkoncentrationer være muteret til ikke-modificerbare rester inden du udfører de beskrevne kemi. For at minimalt påvirke den oprindelige struktur, foreslår vi, at udføre en global sekvens justering af protein af interesse og afgøre, hvilken andre rester fundet de fleste ofte på den endogene Cys stilling(er). Cys mutation til disse andre restprodukter, som forekommer naturligt i andre organismer kan have den mindste indvirkning på protein struktur. Hvis den endogene Cys rest er strengt bevares, foreslår vi muterer til Ser, som er den mest strukturelt ligner Cys. Figur 1 viser en typisk PCR mutagenese gel evaluere succesen af PCR reaktion, med det amplificerede DNA prøve demonstrere several-fold højere intensitet end en kontrol af unamplified skabelon pET-28a DNA, som blev brugt til PCR. De næste skridt omfatter skabelon DNA fordøjelse og omdannelsen til E. coli for plasmid reparation. Efter plasmid formering i flydende kultur, plasmid isolation og bekræftelse af mutation(s) af sekventering anvendes de muterede vektor for protein udtryk. Figur 2A viser en typisk eluering profil af EFSAM fra kolonnen anion exchange i forhold til stigende NaCl koncentrationer. Figur 2B viser renheden af EFSAM på Coomassie blå-farvede SDS-PAGE geler.

Efter at erhverve ren protein, er en serie af dialyse trin anvendes til at fastgøre glukose gruppe via MTS reaktion med den gratis thiol. Figur 3A viser et billede af den typiske opsætning af en lille protein volumen forseglet i dialyse membran af membran klip og indeholdt i en stor 1 L bæger indeholder buffer af interesse. En indledende kontrol af succesen med modifikation kan udføres af massespektrometri. Figur 3B viser massespektrum repræsentative electrospray af EFSAM ændres på en enkelt Cys thiol. Efter etableringen af protokollen for et bestemt protein, modifikation effektivitet og strukturelle perturbationer kan vurderes ud fra en enkelt ensartet 15N-mærket prøve. 1H -15N-HSQC spektrum er erhvervet før og efter tilsætning af reduktionsmiddel DTT (figur 4A). Beregninger af ændring effektivitet kan foretages via en sammenligning af akrylamid peak intensiteter i de modificerede og reduceret spektre som beskrevet i protokollen trin 5.8 (figur 4B). Endelig, da kemiske Skift tildelinger er kendt for et protein, LSP som korrelat med de strukturelle ændringer kan beregnes som beskrevet i trin 5.9 (figur 4 c).

Figure 1
Figur 1: DNA agarosegel viser forstærkning check af skabelon vektor med mutagene primere.
Billedet viser en 1,0% (w/v) agarosegel med DNA markør (M), vektor kontrol (VC) og PCR-forstærket skabelon (PCR). DNA var adskilt af elektroforese på 120 V for 45 min i 0,5 x TAE buffer. I alt 0,5 ng af VC blev indlæst, svarer til mængden af skabelon indlæses i PCR lane. Gel var plettet brug af ethidiumbromid (~0.5 μg/mL) i 20 min. før visualisering under UV-lys (302 nm). Gelen viser en høj grad af amplificerede DNA tæt på den forventede størrelse af vektor (sort pilespids). Den anden band i PCR lane kører mellem 1.000 og 1.500 bp markør bands sandsynligvis repræsenterer et ikke-specifikt amplificerede PCR produkt. Intensitetsniveauet i amplificerede DNA skal være højere end VC intensitetsniveau anses for at være vellykket. Flere andre DNA farvestoffer kan bruges som mindre mutagene, sikrere alternativer til ethidium bromid farvning (Se for eksempel 57). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Typisk kromatografiske rensning og renhed check for STIM1 EF-SAM.
(A) Anion exchange kromatografi eluering profil af STIM1 EF-SAM. Efter manuel bindende bruges EF-SAM til kolonnen anion exchange (Q FF) på grundlæggende pH og lav NaCl-koncentration med en sprøjte, og AKTA FPLC (GE Healthcare) til elueres protein med en NaCl gradient. Eluering overvåges af AKTA med UV-280 nm signal via en 0-60% (v/v) graduering af 1 M NaCl. (B) Coomassie blå-farvede SDS-PAGE gel af eluering fraktioner fra (A). Denaturering protein gelen afslører, at EF-SAM eluerer i to store toppe på ~ 250 mM og ~ 450 mM NaCl. Rensning-protokollen giver > 95% ren EF-SAM som det fremgår af manglen på enhver forurenende band viser oppe i Coomassie blå-farvede gel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dialyse setup og bekræftelse af in vitro- protein glykosylering.
(A) typisk dialyse setup anvendes til in vitro- fastgørelse af glucose til Cys thiol via MTS reaktivitet. Billedet viser ~1.5 mL af protein indeholdt i dialyse slanger buffered mod ~ 1 L af eksperimentelle buffer. Det er vigtigt, at bufferen konstant omrøres for at sikre fuldstændig udveksling. Billedet viser en microcentrifuge tube klippet til overskydende dialyse slangen til at forhindre forlis dialyse taske og skade af den roterende røre bar. (B) Electrospray Ionisation masse spektrum af den modificerede Asn171Cys EF-SAM protein. Massespektrometri er en praktisk og præcis tilgang til at vurdere, om proceduren for ændring var vellykket. En typisk masse kromatogrammet er vist med de teoretiske og målte masser af uforandret og modificerede Asn171Cys EF-SAM angivet. Fleste af prøvens masse svarer til et makromolekyle, som ligger inden for ~1.3 Da de forventede teoretiske masse af glukose-konjugeret Asn171Cys EF-SAM. Dataene i (B) er replotted og ændret fra 42. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Løsning NMR vurdering af ændring effektivitet og strukturelle perturbationer fra en enkelt NMR prøve.
(A) 1 H -15N-HSQC spektrale overlejring af glukose-konjugeret Asn131Cys EFSAM før (rødt crosspeaks) og efter (sort crosspeaks) tilsætning af 15 mM DTT. Overlejringen viser klart flere rester-specifikke akrylamid kemiske Skift ændringer vejledende begge ændring af protein og strukturelle perturbationer. Det røde felt viser placeringen af Asn131Cys akrylamid. (B) zoome visning af regionen 1H -15N-HSQC indeholdende Asn131Cys akrylamid. Intensiteten af Asn131Cys akrylamid peak i den modificerede spektrum (IM) er divideret med intensitet i de reduceret (uændrede) spektrum, (jegR) til beregning af effektivitet (vist). En beregning af den gennemsnitlige effektiviteten ved flere udføres restkoncentrationer giver et bedre estimat af effektivitet, herunder en fejl skøn. Den gennemsnitlige effektivitet er vist for Asn131Cys EFSAM baseret på 5 restkoncentrationer (dvs. 129-133). (C) normaliseret kemiske Skift perturbationer forårsaget af glucose konjugation til Asn131Cys EFSAM protein. Sæt af HSQC eksperimenter indsamlet på en enkelt prøve før og efter supplering med reduktionsmiddel ikke kun giver en bekvem skøn ændring effektivitet af peak intensitet analyse [vist i (B)], men giver også data for evaluering af de strukturændringer, der er forbundet med modifikation. Glukose konjugation forårsager de største perturbationer lokaliseret nær holdning 131; denne analyse viser imidlertid perturbationer, der er uventet udelukkende baseret på sekvensen nærhed, der angiver værdien i denne analyse. Dataene i (C) er replotted og ændret fra 42. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

STIM1 mutationen retningb DNA sekvensc
Asn131Cys frem 5'-GTCATCAGAAGTATACTGTTGGACCGTGGATGAGG-3'
Asn131Cys omvendt 5'-CCTCATCCACGGTCCAACAGTATACTTCTGATGAC-3'
Asn171Cys frem 5'-CCAAGGCTGGCTGTCACCTGCACCACCATGACAGGG-3'
Asn171Cys omvendt 5'-CCCTGTCATGGTGGTGCAGGTGACAGCCAGCCTTGG-3'
en STIM1 aminosyre nummerering baseret på NCBI tiltrædelse AFZ76986.1.
b Den 'omvendte' primer svarer til den omvendte supplement sekvens af 'frem' primer.
c Understregede codon triplet svarer til Cys mutation.

Tabel 1. Eksempel oligonukleotid (primer) sekvenser til Asn til Cys mutagenese inden for pET-28a STIM1 EFSAM konstruere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein glykosylering er en posttranslationel modifikation hvor sukker er kovalent knyttet til polypeptider primært gennem forbindelser til aminosyre sidekæder. Så mange som 50% af pattedyr proteiner er glykosyleret 54, hvor glykosyleret proteiner kan efterfølgende har en bred vifte af effekter fra at ændre Biomolekylær bindende affinitet, påvirke protein foldning, ændre kanal aktivitet, målretning molekyler nedbrydning og cellulære handel, for at nævne et par stykker (gennemgik i33). Glykosylering i pattedyr fysiologi spiller en vigtig rolle fremgår af de flere hundrede af proteiner udviklet sig til at bygge det fulde mangfoldighed af pattedyr glycan strukturer 33. Ændret N- og O- glykosylering mønstre har været forbundet med talrige sygdom hedder herunder prostata (øget og faldt), bryst (steg og faldt), lever (øget), æggestokkene (øget), pancreas (øget) og gastrisk kræft (øget) 55. Derudover glykosylering af Tau, huntingtin, α-synuclein er blevet fundet for at regulere toksicitet af disse proteiner, der er forbundet med Alzheimers, Huntingtons og Parkinsons sygdomme 56, og en gruppe af medfødte lidelser i glykosylering har været identificeret som følge af arvelige defekter i enzymer, der mægle glykosylering 54. Dermed, forståelse de præcise biofysiske, biokemiske og strukturelle virkninger af glykosylering har potentiale til at uhyre betydning vores forståelse af protein regulering og funktion inden for sundhed og sygdom.

De ti sukker byggesten, som fører til mangfoldighed glycan fundet i pattedyr glykomet omfatter fucose, galactose, glukose, N- acetylgalactosamine, N- acetylglukosamin, glucuronsyre, iduronic syre, mannose, sialic syre og xylose 33. Mens N- glykosylering links uvægerligt en N- acetylglukosamin sukker direkte til protein, kan O- glykosylering skyldes nogen af N- acetylgalacotose, N- acetylglukosamin, xylose, fucose, glukose eller galactose kovalent knyttet til polypeptid. For at begynde at forstå, hvordan disse sukkerarter umiddelbart støder op til protein overfladen påvirker de biofysiske og strukturelle egenskaber, beskrive vi heri en tilgang til site-selektivt tillægger Cys restkoncentrationer via dithioler manipuleret i proteinet sukker sekvens. Her er de rester, der er endogent glykosyleret erstattes af Cys og ændret i vitro via en enkel kemiske tilgang. På denne måde, kan enkelt og flere glykosylering websteder vurderes for at drille bidrag til hver bestemt websted samt de kumulative ændringer at folde og stabilitet samt den overordnede struktur og funktion af proteinet.

For nylig, denne tilgang blev med held brugt med EFSAM individuelt og kumulativt vurdere rollen som Asn131 og Asn171 N- glykosylering websteder 42. Mutation til Cys og kovalente fastgørelse af glucose til Asn131 eller Asn171 websteder viste en nedsat Ca-2 + bindende affinitet og undertrykt stabilitet. Når de to sites blev samtidig ændret med glucose vedhæftet fil, falder i bindende affinitet og stabilitet blev forstærkede fører til forbedret oligomerisering tilbøjelighed in vitro. Strukturelt, viste den metode beskrevet heri, at Asn131 eller Asn171 ændringerne gensidigt forurolige core α8 helix beliggende på domænet SAM umiddelbart støder op til EF-hånd parret. Denne strukturelle analyse udlægger, hvordan glukose ændringer på overfladen af protein føre til en konvergerende og forstærket strukturændringer inden for EF-hånd: SAM-grænseflade, som i sidste ende destabiliserer proteinet og øger SOCE 42.

Mens anvendelse af dette websted-selektiv tilgang hjalp kaste lys over hvordan en monosakkarid tæt på overfladen af EFSAM effekter folde, stabilitet og opbygning, denne procedure kan let ændres til at vedhæfte længere kulhydrater specifikke skadestuen, Golgi og PM lokalisering (dvs. glykosylering stater af forskellige modenhed), der er en pålidelig kilde til disse kulhydrater, der indeholder funktionelle grupper, som kan linke til dithioler såsom MTS. MTS er at foretrække, da thiol modifikation er reversible ved hjælp af en reduktionsmiddel og referencespektrum kan erhverves let. Denne tilgang kan også tilpasses link andre posttranslationelle fraspaltning til protein som lipider. På samme tid er der flere begrænsninger for denne tilgang, som bør overvejes. For det første bygger metoden på mutation af glykosylering websteder til Cys, som kan påvirke struktur, stabilitet og folde selv i mangel af enhver ændring af glukose. På samme måde, native Cys restkoncentrationer i protein skal også være muteret for at forhindre glukose vedhæftet fil på ikke-glykosyleret websteder. Derudover fremmer tilsætning af Cys rester ofte inklusion krop dannelse i bakterier på grund af Cys crosslinking og misfoldning, hvilket gør rensning mere udfordrende. Ikke desto mindre, denne site-selektiv Cys-crosslinking metode beskrevet heri giver en kontrolleret betyder at drille ud strukturelle, biokemiske og biofysiske virkningerne af specifikke glykosylering websteder i eksperimenter, som kræver en høj grad af homogen protein. Virkningerne af ikke-hjemmehørende Cys rester på strukturen, stabilitet og foldning kan blot konstateres i mangel af eventuelle ændringer i forhold til wild-type protein attributter 42. Taget sammen med funktionelle oplysningerne i eukaryote celler, der udtrykker modifikation-blokerende muterede versioner af protein (fx Asn-til-Ala), vil den i øjeblikket beskrevne fremgangsmåde give ny indsigt i de strukturelle mekanismer af protein regulering af posttranslationelle modifikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (05239 til PBS), canadiske Foundation for Innovation/Ontario forskningsfond (til PBS), Prostata Cancer kæmpe Foundation - Telus Ride for far (til PBS) og Ontario Graduate stipendium (til Y.J.C. og N.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), Epub 2005 May 2002 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L. Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. Agostinis, P., Afshin, S. , Bristol-Myers Squibb. Syracuse, NY. 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Immunologi spørgsmålet 128 glykosylering methanethiosulfonate cystein thiol modifikation stromale interaktion molekyle-1 EFSAM løsning Kernemagnetisk resonans-spektroskopi massespektrometri
Målretning cystein dithioler for <em>in Vitro</em> lokationsspecifikke glykosylering af rekombinante proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S.,… More

Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter