Det här protokollet beskriver en roman tredimensionella in vitro- modell, där hornhinnan stromaceller och differentierade neuronala celler odlas tillsammans att bistå i undersökning och förståelse för samspelet mellan de två celltyper.
Vävnadsteknik har fått betydande erkännande på grund av den höga efterfrågan på mänskliga hornhinnan ersättare med uppskattningsvis 10 miljoner människor i världen lider av hornhinnans vision förlust1. För att möta efterfrågan på livskraftiga mänskliga hornhinnor, betydande framsteg i tredimensionella (3D) vävnad har engineering gjorts2,3,4. Dessa hornhinnan modeller sträcker sig från enkla enskiktslager system multilayered modeller, leder till 3D full-tjocklek korneal medel2.
Men användningen av en 3D-vävnadstekniska hornhinnan i samband med in vitro- sjukdomsmodeller studerade till datum saknar likhet med multilayered 3D hornhinnans vävnad struktur, funktion och nätverksbyggande mellan olika celltyper (dvs, det nerv, epitel, stroma och endotel)2,3. Dessutom ökat efterfrågan på in vitro- hornhinnan vävnad modeller i ett försök att minska djurförsök för farmaceutiska produkter. Således, mer sofistikerade modeller krävs att bättre matcha system till människans fysiologiska krav, och utvecklingen av en modell som är mer relevant för patientgruppen är absolut nödvändigt. Med tanke på att flera celltyper i hornhinnan påverkas av sjukdomar och dystrofier, såsom keratokonus, diabetiker keratopati och Fuchs, innehåller denna modell en 3D samtidig kultur modell av primära mänskliga korneal fibroblaster (HCF) från friska donatorer och nervceller från SH-SY5Y cell linje. Detta gör att vi för första gången att undersöka samspelet mellan de två celltyper inom mänskliga hornhinnans vävnad. Vi anser att denna modell potentiellt kunde dissekera de bakomliggande mekanismerna är associerad med stromaceller-nerv interaktioner av hornhinnans sjukdomar som uppvisar nerv skador. Denna 3D modellen speglar den grundläggande anatomiska och fysiologiska naturen i hornhinnans vävnad i vivo och kan användas i framtiden som ett verktyg för att undersöka hornhinnan defekter samt screening effekten av olika agenter innan djurförsök.
I den mänskliga kroppen är hornhinnan tätast innerverade vävnaden. Nerverna är ansvariga för olika förnimmelser som beröring, smärta, temperatur och har även en viktig roll i sårläkning, blinka reflexer, Riva produktion och sekretion5,6,7. I hornhinnan, stromal nerv stammar uppstår från limbala plexus och ange perifera hornhinnestroman radiellt. Stromaceller nerv organisationen är parallell med de kollagen lamellerna och de ytterligare filial till mindre fascicles när de fortsätter mot den ytliga stroma5,8. Nervfibrerna ytterligare tränger epitelskiktet och således innervation är allmänt spridda över hornhinneepitelet och stroma. Innervation har därför en viktig roll i det friska och sjuka tillståndet av hornhinnan. I detta protokoll avslöjar vi befordran av en roman 3D in vitro- modell, som är först i sitt slag att efterlikna de i vivo stromaceller-nerv interaktionerna. SH-SY5Y cell raden användes för denna studie, eftersom det är en av de mest etablerade, som väl kännetecknas linjer som används för att studera neuronal tillväxt. SH-SY5Y cell linjen har beskrivits att producera båda substrat anhängare (S-typ) och neuroblastic (N-typ) celler som kan genomgå transdifferentiation9. Som ett resultat, även om denna cellinje härleds från en trippel successiva subclone urval av N-typ celler, innehåller den också ett litet antal S-typ celler kan genomgå differentiering in nervceller genom användning av retinoic acid och hjärnan som härrör neurotrofa faktor9. Detta ger ett verktyg som kan leda till en bättre förståelse av hornhinnans komplikationer i samband med diabetesretinopati (DM) och andra ögonsjukdomar. På grund av svårigheterna med att erhålla och odlingsskålar nervceller från patienter med okulär sjukdom, ger denna 3D in vitro- modell betydande effekter i studera de neuronala interaktionerna och signalering med hornhinnestroman.
Sjuka villkor påverkar ofta olika vävnader i kroppen i mycket stor skala, vilket leder till en nedsatt livskvalitet. Okulär dystrofier är vanliga komplikationer som ofta förknippas med systemiska sjukdomar och leda till förlust av synskärpa eller ens permanent synbortfall. Omfattande studier är ofta avgörande för en bättre förståelse av sjukdomstillstånd samt effekterna på basal cellnivå. För att studera effekterna av sådana sjukdomar, har olika i vivo och in vitro- modeller utvecklats med hjälp av vävnad tekniska tillämpningar. Hornvävnad engineering program har rönt stort intresse inom olika områden av vetenskap10,11,12,13,14, men det finns fortfarande stora begränsningar under faktiska tillämpningen, inklusive korneal ympa avslag, infektioner och ärrbildning10,11,12,13,14. Det finns flera studier som har framgångsrikt utvecklat och etablerat olika in vitro- modeller3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. 3D in vitro- modellerna är de mest lovande och av stort vetenskapligt intresse. 3D-modeller är kända för att bättre spegla i vivo cellulära och fysiologiska händelser som är kritiska under fibros och såret helande15,27,28,29. Dessa in vitro- modeller spelar en viktig roll i att hitta nya terapeutiska metoder för behandling av olika sjukdomstillstånd inklusive korneal komplikationer. Trots den kritiska rollen innervation i hornhinnan funktioner gjorts lite ansträngning att främja perifer nerv spridning inom korneal vävnadstekniska konstruktioner2,3. Dock efterlikna de föreslagna 3D i vitro cell konstruktioner målvävnaden för att uppnå önskad vävnad funktionaliteten.
Även diabetiker keratopati är ett uppenbart program för den modell som beskrivs här på grund av de neuronala defekterna, finns det flera andra sjukdomar i hornhinnan som kan dra nytta av en mänsklig in vitro- modell inklusive keratokonus och Fuchs dystrofier. Vår 3D modell framgår detta framtidsperspektiv och föreslår utveckling av ett in vitro- representation av Hornvävnad att bedöma drug delivery och säkerhet av nya okulära läkemedel.
Flera studier har fokuserat på att utveckla olika djurmodeller som kan bidra till att utveckla en bättre förståelse av sjukdomar i hornhinnan samt upptäcka behandlingar. Dock har ett betydande värde för människor från dessa studier inte verifierats. Hittills har har olika in vitro- modeller utvecklats och allmänt utreds på grund av deras anmärkningsvärda klinisk betydelse. Vår tidigare etablerade 3D in vitro- modell är en roman system som avsevärt bidrar till medicinsk vetenskap framsteg…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill utöka vårt uppriktiga tack Dr Ben Fowler för hans tekniska hjälp med TEM experimenten.
Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
Wax block | VWR | 50-949-027 | |
SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |