Summary
Este protocolo describe un novela tridimensional en vitro modelo, donde las células del estroma corneales y las células neuronales diferenciadas se cultivan juntos para ayudar en el examen y la comprensión de las interacciones de los dos tipos celulares.
Abstract
Ingeniería de tejidos ha ganado reconocimiento sustancial debido a la alta demanda de reemplazo de la córnea humana con un estimado 10 millones de personas sufren de pérdida de visión córnea1. Para atender la demanda de córneas humanas viables, progresos significativos en el tejido (3D) tridimensional ingeniería se ha hecho2,3,4. Estos córnea modelos oscilan los sistemas monocapa simple a modelos de varias capas, a 3D equivalentes corneal de espesor completo2.
Sin embargo, el uso de una córnea de ingeniería de tejido 3D en el contexto de modelos de enfermedad en vitro estudiados a la fecha no tiene semejanza a la estructura de varias capas 3D tejido corneal, función y la interconexión de diferentes tipos de células(es decir, nervio, epitelio, estroma y endotelio)2,3. Además, ha aumentado la demanda de en vitro modelos de tejido de córnea en un intento de reducir los ensayos con animales para productos farmacéuticos. Por lo tanto, modelos más sofisticados deben adaptarse mejor a los sistemas a las necesidades fisiológicas humanas, y el desarrollo de un modelo que es más relevante para la población de pacientes es absolutamente necesario. Dado que múltiples tipos de células en la córnea son afectados por enfermedades y distrofias, como queratocono, Keratopathy diabética y Fuchs, este modelo incluye un modelo 3D co-cultivo de fibroblastos corneales humanos primarios (HCF) de donantes sanos y neuronas de la línea de células SH-SY5Y. Esto nos permite por primera vez a investigar las interacciones entre los dos tipos celulares en el tejido de la córnea humano. Creemos que este modelo podría potencialmente diseccionar los mecanismos subyacentes asociados con las interacciones estroma-nervio de enfermedades corneales que presentan daños del nervio. Este modelo 3D refleja la naturaleza anatómica y fisiológica básica del tejido corneal en vivo y puede utilizarse en el futuro como una herramienta para investigar defectos corneales, así como la eficacia de diversos agentes de detección antes de los ensayos con animales.
Introduction
En el cuerpo humano, la córnea es el tejido más densamente inervado. Los nervios son responsables de varias sensaciones como el tacto, dolor, temperatura y también tienen un papel esencial en la cicatrización de heridas, reflejos de parpadeo, rasgar la producción y secreción5,6,7. En la córnea, stromal troncos del nervio surgen del plexo limbal y escriba del estroma corneal periférico radialmente. La organización de stromal del nervio es paralela a las laminillas de colágeno y más ramifican en pequeños fascículos como proceden hacia el estroma superficial5,8. Las fibras nerviosas más penetran en la capa epitelial y por lo tanto, la inervación es ampliamente repartida por el epitelio corneal y el estroma. Por lo tanto, la inervación tiene un papel esencial en el estado sano y enfermo de la córnea. En este protocolo, nos revelan el avance de un modelo de novela 3D en vitro , que es la primera de su tipo a imitar las interacciones en vivo stromal del nervio. La línea de células SH-SY5Y fue utilizada para este estudio, ya que es una de las líneas establecidas, bien caracterizadas, utilizadas para estudiar el crecimiento neuronal. Se ha descrito para producir ambos adherentes de substrato (S-type) la línea de células SH-SY5Y y neuroblastic (tipo N) de las células que pueden experimentar transdifferentiation9. Como resultado, a pesar de que esta línea celular se deriva de una selección triple subclone sucesivas de células de tipo N, también contiene un pequeño número de células de tipo S capaces de someterse a la diferenciación a neuronas mediante el uso de retinoico ácido y derivado del cerebro Neurotrophic factor9. Esto proporciona una herramienta que puede llevar a una mejor comprensión de las complicaciones corneales asociados con la retinopatía diabética (DM) y otras enfermedades oculares. Debido a las dificultades asociadas con la obtención y cultivo de neuronas de pacientes con enfermedad ocular, este modelo 3D en vitro proporciona importantes implicaciones en el estudio de las interacciones neuronales y señalización con el tejido conectador córneo.
Condiciones enfermas a menudo afectan a varios tejidos del cuerpo a muy gran escala, conducen a una calidad de vida comprometida. Dystrophies oculares son complicaciones comunes a menudo asociadas con enfermedades sistémicas y conducen a la pérdida de la agudeza visual o incluso permanente de la visión. Estudios completos son a menudo esenciales para una mejor comprensión de la condición de la enfermedad, así como los efectos a nivel celular basal. Para estudiar los efectos de estas enfermedades, se han desarrollado varios modelos en vivo y en vitro con la ayuda de aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aplicaciones de ingeniería de tejido corneal han cosechado gran interés en diversos campos de la ciencia10,11,12,13,14, pero hay aún grandes limitaciones en aplicación efectiva, incluyendo corneal del injerto rechazos, infecciones y cicatrices10,11,12,13,14. Hay varios estudios que han desarrollado con éxito y estableció varios en vitro modelos3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Los modelos 3D en vitro son los más prometedores y de gran interés científico. Modelos 3D son conocidos para reflejar mejor los en vivo celulares y fisiológicas eventos que son esenciales durante la fibrosis y la herida curativo15,27,28,29. Estos modelos en vitro desempeñan un papel integral en la búsqueda de nuevos enfoques terapéuticos para tratar las diferentes enfermedades incluyendo las complicaciones corneales. A pesar del papel fundamental de la inervación corneal funciones, poco esfuerzo se ha promover proliferación periférica del nervio dentro de construcciones de ingeniería de tejido corneal2,3. Sin embargo, las propuesta 3D en vitro célula construcciones imitan el tejido diana para lograr la funcionalidad deseada del tejido.
Mientras keratopathy diabética es una aplicación obvia para el modelo descrito aquí debido a los defectos neuronales, hay varias otras enfermedades corneales que pueden beneficiarse de un modelo humano en vitro incluyendo distrofias queratocono y Fuchs. Nuestro modelo 3D surge de esta perspectiva y propone el desarrollo de una representación en vitro de tejido corneal para evaluar el suministro de medicamentos y la seguridad de nuevos medicamentos oculares.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices de la Junta de revisión de la Universidad de Oklahoma Health Sciences Center/institucional (IRB #4509). Todas las partes del Protocolo se reunió con los principios de la declaración de Helsinki. Se obtuvieron muestras corneales de desarrollo nacional e Instituto de investigación (NDRI) y Oklahoma Lions Eye Bank.
1. aislamiento de células primarias
- Tras la recepción de las muestras de tejido de la córnea humana, transferencia de los tejidos en un 21,5 cm2 placa de Petri que contiene 2 mL de solución salina estéril de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) (1 x).
- Raspar y quitar el epitelio corneal mediante el posicionamiento de la córnea domo hacia arriba. Para asegurar el retiro completo, raspe la capa epitelial con una cuchilla de afeitar a un ángulo de 45°. A continuación, voltear el córnea cúpula boca abajo y raspar bien el endotelio del estroma con una cuchilla de afeitar a un ángulo de 45° para asegurar el retiro completo. Lavar el tejido stromal con DPBS.
- Cortar los tejidos estromales en trozos pequeños, utilizando una cuchilla quirúrgica número 10, manteniendo los stromal pedazos húmedos en todo tiempo con DPBS. Recoger piezas stromal con pinzas estériles y en un matraz de cultivo T25 sin medios de comunicación (4 o 5 piezas de tejido de 2 x 2 mm cada frasco).
- Permita que los explantes que se adhieren a la parte inferior del frasco a 37 ° C por unos 30-40 min. Una vez adherido, agregue lentamente mínimo medio esencial del águila (EMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% antibiótico/Antimicosico en el matraz sin molestar a los explantes.
- Coloque con cuidado el frasco en el incubador a 37 ° C, 5% CO2. Deje reposar los explantes hasta que las celdas de aislamiento y migración en el frasco. Después de aproximadamente 2-4 semanas, las células deben llegar a confluencia 100%. 100% de confluencia, las células de paso eliminando los medios de cultivo de tejidos y lavan las células con DPBS.
- Añadir tripsina a las células y luego los incubar a 37° C. Después de aproximadamente 5 minutos, ve las células bajo microscopia ligera para confirmar que han separado y luego detener la proteolisis mediante la adición de medio fresco.
- Transferir la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL por centrifugación a 1.000 x g. quitar el sobrenadante con cuidado sin perturbar el pellet y suspender las células en EMEM fresco 10% FBS 1% antibiótico. Contar las células y de semilla de aproximadamente 1 x 106 células en T75 frasco de cultura para la futura expansión con fresco EMEM 1% FBS 1% antibiótico.
2. primaria HCF cultura y construcciones 3D montaje
- Montaje 3D de construcciones de explantes EMEM previamente crecido en 10% FBS 1% antibiótico/Antimicosico, paso y cuenta HCF.
- Semilla de aproximadamente 1 x 106 células/pozo de HCF primaria en insertos de membrana de policarbonato con poros de 0.4 μm de las construcciones 3D, junto con 1,5 mL de EMEM fresco 10% FBS 1% antibiótico/Antimicosico a la parte superior de la construcción. Añadir otro 1,5 mL del mismo medio a la parte inferior de cada construcción.
- Después de 24 h de sembrador de la célula, de la cultura las células con EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimicosico, estimulados con 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C) por agregar 1.5 mL en la parte superior y 1.5 mL en la parte inferior de cada construcción.
- Mantener los cultivos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 durante 3 semanas y suministrar medios frescos diariamente durante el período entero del estudio. No es necesario ningún otro paso.
3. diferenciación y co-cultivos de células
- Después de 3 semanas, agregar 8 x 103 células/pozo de las células del neuroblastoma humano SH-SY5Y en la parte superior el 3D montado anteriormente construye que contiene 1,5 mL de la EMEM que contiene 10% FBS, 1% antibiótico/Antimicosico y 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C).
- Permitir que las células de neuroblastoma SH-SY5Y creciendo encima de las células stromal córnea durante al menos 24 h antes de iniciar la diferenciación de la célula.
- Iniciar la diferenciación de las células SH-SY5Y al estimular las células con EMEM que contiene 1% FBS y 1,5 mL de 10 μm ácido retinoico sobre la construcción. Añadir 1,5 mL del EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimicosico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C) a la parte inferior de la construcción. Tenga en cuenta que el paso de ácido retinoico debe realizarse en la oscuridad.
- Continúan las células en este medio de diferenciación de la cultura durante 5 días.
- Cuando las células alcanzan la fase de diferenciación, cambiar las celdas a 1,5 mL de medio libre de suero que contenga 2 nM de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y 1% antibiótico/Antimicosico agregado a la EMEM, añadiendo a la parte superior de la construcción. Añadir 1,5 mL del EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimicosico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C) a la parte inferior de la construcción. Tenga en cuenta que se debe realizar el paso BDNF en la oscuridad.
- Las células de cultivo durante 2 días adicionales antes de procesar cualquier análisis adicional como se indica en la tabla 1.
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Representative Results
La figura 1 es una imagen representativa paso a paso del modelo de trabajo 3D en vitro . En el primer paso, las células están aisladas de córneas humanas. Entonces, son cultivadas en una membrana de policarbonato y estimulados con vitamina C para ensamblar una matriz 3D auto secretada. Este sistema de construcción 3D induce la síntesis de una de varias capas celulares en vivo-como matriz estromal. Después de eso, se siembran las células de neuroblastoma en la parte superior las células stromal seguidas por iniciar la diferenciación de la célula neuronal. Esto conduce al co-cultivo de células stromal córneas las células neuronales diferenciadas en el modelo 3D en vitro . Figura 2 es la imagen de microscopía electrónica (TEM) de transmisión de alta magnificación de la construcción uno mismo-montado 3D (figura 2A) que muestra la membrana de policarbonato y las células del estroma corneales sin semillas en la parte superior, secretando una matriz uno mismo-montado las células neuronales diferenciadas seguidas por (figura 2B) sembrados en la parte superior que muestra un arreglo de stromal de la célula neuronal. Las flechas en la imagen indican las células neuronales. Teniendo en cuenta la interferencia directa entre el estroma corneal y las células neuronales, creemos que los actores que afectan la regulación de los defectos córneos existen en la capa de estroma. Por lo tanto, este modelo presenta un humano neuronal en vitro modelo diferenciador SH-SY5Y neuroblastoma células en una morfología neuronal sostenible combinando con nuestro modelo 3D previamente establecida de la matriz extracelular (ECM) de cultivo con varios factores diferenciadores. Por lo tanto, sospechamos que este modelo permitirá futuros estudios de las diferencias morfológicas y moleculares entre sana y enferma de la ECM. Creemos que este modelo nuevo 3D en vitro ayudará analizar aspectos cruciales de los interacciones estroma corneal-nervio asociadas a patología corneal y allanar el camino para el desarrollo de nuevas terapias.
Figura 1: imagen ilustrativa que muestra el modelo 3D en vitro co-cultivo en una manera paso a paso. Esta imagen muestra el aislamiento de células de la córnea humana y células estromales sembradas en una membrana de policarbonato, situado en la construcción 3D, cultivadas en el EMEM y estimulado con vitamina C. Además, se muestran células neuronales diferenciadas a ser sembradas sobre las células del estroma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen TEM de alta magnificación del sistema 3D en vitro . Arreglo de células estromales (A) encima de la membrana de policarbonato. Sin semilla (B) diferenciar células neuronales en la parte superior las células stromal. Barras de escala = 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Técnicas de análisis | Posibles consecuencias |
| Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa | Investigar marcadores del colágeno (Col I, Col III y V de la Col), la actinia alfa-lisa del músculo del marcador fibrótica (α-SMA) y los principales mediadores en la DM como factor de crecimiento insulina-1 (IGF-1) y es receptor (IGF1-R) |
| Microscopía electrónica de transmisión | Cambios estructurales son investigados como fibrillas de colágeno y de las interacciones célula-ECM |
| Inmunofluorescencia | Uso de anticuerpos específicos químicamente conjugado colorante fluorescente para investigar antígenos celulares |
Tabla 1: Técnicas de análisis.
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Discussion
Varios estudios se han centrado en el desarrollo de diversos modelos animales que pueden ayudar a desarrollar una mejor comprensión de enfermedades corneales, así como descubrir tratamientos. Sin embargo, un valor significativo a los seres humanos de estos estudios no ha sido verificado. Hasta la fecha, varios modelos en vitro se han desarrollado e investigado ampliamente debido a su notable significación clínica. Nuestro modelo previamente establecido 3D en vitro es un novedoso sistema que significativamente contribuye a los avances de la ciencia médica en la investigación de la visión y muestra capacidad de Inmaculada de recapitular en vivo eventos en vitro28 , 29 , 30. el presente Protocolo pretende desarrollar la próxima generación de este en vitro modelo corneal que puede utilizarse para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de las complicaciones asociadas con enfermedades corneales como keratopathy diabética, queratocono y Fuchs. Tal avance podría proporcionar bases sólidas hacia el descubrimiento de nuevos tratamientos que se necesitan mucho clínicamente.
Este modelo puede ayudar en la identificación de diferentes alteraciones estructurales y celulares en DM y otras enfermedades corneales. Esto brinda implicaciones sustanciales, incluyendo la posibilidad de detección de estas enfermedades en una etapa inicial para potencialmente ayudar con el manejo de la enfermedad. El modelo propuesto aquí es simple, pero es muy innovador. Una de las ventajas más significativas es que las células del estroma corneales pueden secretar y montar su propio ECM en lugar de ser sembrado en un ambiente artificial. Además, los nervios se les permite distinguir con mayor precisión los interacciones de nervio stromal córnea modelo. Por lo tanto, este método ofrece la posibilidad de estudiar el tejido conectador córneo humano y red del nervio, así como las células que residen en el entorno del estroma. Esta plataforma cultural permitirá que futuras investigaciones de interacciones célula-célula y célula-matriz complejas que influyen en los Estados enfermos de la córnea. Este enfoque del modelo 3D en vitro prevé proporcionar mejorado y nuevo penetración en el mecanismo de la enfermedad, particularmente en comparación con el actual convencional de la cultura los sistemas o modelos animales.
La generación descrita de este modelo 3D en vitro allanará el camino para el futuro del tratamiento terapéutico y descubrimientos.
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Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Nos gustaría extender nuestro sincero agradecimiento a Dr. Ben Fowler por su ayuda técnica con los experimentos TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
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