Summary
이 프로토콜에는 새로운 3 차원 생체 외에서 모델을, 어디 각 막 실질 세포와 분화 된 신경 세포 교양 함께 시험에는 두 종류의 세포 상호 작용의 이해를 돕기 위해 설명 합니다.
Abstract
조직 공학 인간 각 막 교체 각 막 시력 손실1에서 고통을 전세계 약 10 백만 명에 대 한 높은 수요로 인해 상당한 인정을 받고 있다. 가능한 인간 각, 3 차원 (3D) 조직에 중요 한 진행에 대 한 수요를 해결 하기 위해 공학이 했다2,,34. 이러한 각 막 모델 에서부터 간단한 단층 시스템 3D 전체 두께 각 막 등가물2로 이어지는 다층된 모델.
그러나, 생체 외에서 질병 모델의 맥락에서 3 차원 조직 설계 각 막의 사용 날짜 부족 유사 다층된 3 차원 각 막 조직 구조, 기능, 및 서로 다른 세포 유형 (즉, 신경, 네트워킹을 공부 상피와 기질, 내 피)2,3. 또한, 생체 외에서 각 막 조직 모델에 대 한 수요는 제약 제품에 대 한 동물 실험을 줄이기 위해 시도에서 증가 했다. 따라서, 더 정교한 모델은 인간의 생리 적 요구 사항, 시스템 일치 하는 데 필요한 그리고 더 환자 인구에 관련 된 모델의 개발은 절대적으로 필요 하다. 각 막에 여러 세포 유형 영향을 받는 질환과 dystrophies Keratoconus, 당뇨병 각 Fuchs, 등을이 모델에 포함 된 기본 인간 각 막 섬유 아 세포 (HCFs) 건강 한 기증자와에서 뉴런에서의 3D 공동 문화 모델 SH SY5Y 셀 라인입니다. 인간의 각 막 조직 내에서 2 개의 세포 유형 사이 상호 작용을 조사 하기 위해 처음으로 수 있습니다. 우리는이 모델 잠재적으로 관련 된 신경 손상 하는 각 막 질환의 신경 기질 상호 작용 하는 근본적인 메커니즘을 해 부 수 믿습니다. 이 3D 모델 vivo에서 각 막 직물의 기본 해 부 및 생리 적 특성을 반영 하 고 수 도구로 사용 될 미래에는 각 막 결함 조사로 동물 테스트 하기 전에 다양 한 에이전트의 효능을 심사.
Introduction
인체 각 막에서는 가장 밀도가 innervated 조직입니다. 신경 터치, 고통, 온도, 다양 한 감각에 대 한 책임은 그리고 또한 상처 치유, 반사, 눈물 분 비5,,67및 생산에 필수적인 역할을 했습니다. 각 막, 실질 신경 줄기 limbal 총에서 발생 하 고 광선으로 주변 각 막 stroma를 입력 합니다. Stromal 신경 조직 콜라겐 lamellae 평행 이며, 그들은 더 작은 성숙기로 그들은 천박한 기질5,8쪽으로 진행으로 분기. 상피 층을 관통 하는 신경 섬유를 추가 하 고 따라서, 신경 분포 널리 퍼져 각 막 상피와 기질. 따라서, 신경 분포는 각 막의 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 필수적인 역할을 하고있다. 이 프로토콜에서 우리는 vivo에서 stromal 신경 상호 작용을 모방 하는 종류의 첫 번째 모델 소설 3 차원 생체 외에서 의 발전을 공개. 그것은 가장 설립, 잘 특징이 라인 신경 성장을 공부 하는 데 사용 중 SH-SY5Y 셀 라인이이 연구를 위해 사용 했다. SH SY5Y 셀 라인 두 기판 부착 (S 형) 생산 설명 되었으며 neuroblastic (N 형) 세포 transdifferentiation9를 받을 수 있습니다. 그 결과,이 셀 라인은 N 형 셀의 트리플 연속 subclone 선택에서 파생 된, 비록 그것은 또한 포함 retinoic 산 및 두뇌 파생 된 사용을 통해 신경 세포로 분화를 겪고 수 S 형 세포의 작은 수 科 요소9. 이 당뇨병 성 망막 증 (DM) 및 다른 눈 질병와 관련 된 각 막 합병증의 더 나은 이해로 이어질 수 있는 도구를 제공 합니다. 하 고 눈 질병을 가진 환자에서 신경 세포 배양과 관련 된 어려움 때문에이 3D 생체 외에서 모델 신경 상호 작용을 공부 하 고 각 막 stroma로 신호에 상당한 영향을 제공 합니다.
질병 상태는 종종 매우 큰 규모, 손상 된 삶의 질으로 이어지는 신체의 다양 한 조직 영향을. 눈 dystrophies는 종종 조직의 질병 및 시력의 손실 또는 심지어 영구적인 시력 상실을 리드와 관련 된 일반적인 합병증. 포괄적인 연구는 종종 질병 상태 뿐만 아니라 기저 세포 수준에서 효과의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 이러한 질병의 효과 연구, 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델 조직 엔지니어링 응용 프로그램의 도움으로 개발 되었습니다. 각 막 조직 공학 응용 과학10,11,12,,1314, 다양 한 분야에 걸쳐 큰 관심을 얻고 있다 하지만 여전히 주요 제한 중 실제 응용 프로그램을 거부, 감염과 흉터10,11,12,,1314이식 각 막 등. 여러 연구를 성공적으로 개발 하 고 다양 한 생체 외에서 모델3,15,,1617,18, 설립 있다 19,20,21,22,23,,2425,26. 3 차원 생체 외에서 모델은 가장 유망한와 큰 과학적 관심의. 3D 모델은 더 나은 vivo에서 세포 및 생리 적 이벤트 섬유 증 중 중요 하 고 상처 치유15,27,,2829거울 알려져 있습니다. 이러한 생체 외에서 모델 각 막 합병증 등 다른 질병 상태를 치료에 새로운 치료 접근을 찾는 중요 한 역할을. 각 막 기능에 신경 분포의 중요 한 역할에도 불구 하 고 약간의 노력이 했다 각 막 조직 설계 구조2,3내 주변 신경 확산을 촉진. 그러나, 제안 된 3D 생체 외에서 셀 구조는 원하는 조직 기능을 달성 하기 위하여 대상 조직 모방.
당뇨병 각 신경 결함 때문에 여기서 설명 하는 모델에 대 한 명백한 응용 프로그램은, 인간의 생체 외에서 모델 Keratoconus와 Fuchs dystrophies 등 누릴 수 있는 다른 여러 각 막 질환 있다. 우리의 3D 모델이이 전망에서 나온다 고 약 납품을 평가 하기 위해 각 막 직물의 생체 외에서 표현 및 새로운 눈 약의 안전의 개발을 제안.
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Protocol
이 프로토콜은 오클라호마 보건 과학 센터의 대학/기관 검토 위원회 (IRB #4509)의 지침을 따릅니다. 프로토콜의 모든 부분 헬싱키의 선언의 신조를 만났다. 각 막 샘플 국가 개발 및 연구 연구소 (NDRI)와 오클라호마 라이온 스 안구 은행에서 얻은 했다.
1입니다. 1 차 셀의 격리
- 21.5 cm2 무 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 2 개 mL를 포함 하는 배양 접시에 조직 인간 각 막 조직 샘플을 접수 한 후, 전송 (1 x).
- 긁 고 막 돔 얼굴 위로 배치 하 여 각 막 상피를 제거 합니다. 완전 한 제거를 보장 하기 위해, 철저 하 게 45 ° 각도로 면도날을 사용 하 여 상피 층을 다쳤어요. 다음, 각 막 돔 얼굴 다운 플립 하 고 철저 하 게 완전 한 제거를 보장 하기 위해 45 ° 각도로 면도날으로 기질에서 endothelium을 다쳤어요. 워시 DPBS와 실질 조직.
- 실질 조직 유지 하는 DPBS를 사용 하 여 모든 시간에 젖은 stromal 조각 10 외과 블레이드를 사용 하는 작은 조각으로 잘라. 미디어 (2 x 2 m m 조직 플라스 크 당 4 또는 5 조각) 없이 T25 문화 플라스 크에 소독 집게와 장소 stromal 조각을 선택 합니다.
- 약 30-40 분 동안 37 ° C에서 플라스 크의 밑바닥에 explants 허용. 준수, 일단 천천히 추가 글의 최소 필수 매체 (EMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 포함 된 항생제/Antimycotic는 explants 방해 없이 플라스 크에.
- 부드럽게 37 ° c, 5% CO2배양 기에 플라스 크를 배치 합니다. 세포 분리 시작 때까지 explants는 그대로 두고 플라스 크에서 마이그레이션. 약 2-4 주 후, 셀 100% 합류를 도달 한다. 100% 합류 시 조직 문화 미디어를 제거 하 여 세포를 통과 하 고 셀 DPBS 씻어.
- 세포를 트립 신을 추가 하 고 37 ° c.에서 그들을 품 어 약 5 분 후 그들은 분리가 확인 가벼운 현미경에서 세포를 확인 하 고 신선한 미디어를 추가 하 여는 베이스를 중단.
- 1000 x g.에서 원심 분리는 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고 신중 하 게 제거에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 중단 신선한 EMEM 셀 10% FBS 1% 항생제. 셀을 계산 하 고 씨앗 신선한 EMEM와 확장에 대 한 T75 문화 플라스 크에 약 1 x 106 셀 1% FBS 1% 항생제.
2. 기본 HCFs 문화 및 3D 어셈블리 생성
- 3D 조립에서 구문을 explants 이전에 성장된 EMEM 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic, 통로 및 수 HCFs.
- 씨 약 1 x 106 셀/잘 신선한 EMEM의 1.5 mL 함께 3D 구조에서 0.4 µ m 모와 폴 리 카보 네이트 막 삽입에 기본 HCFs의 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic 구성의 상단에. 각 구조물의 하단에 같은 미디어의 또 다른 1.5 mL를 추가 합니다.
- 셀 시드의 24 시간 후 문화 EMEM 셀 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic, 위에 추가 1.5 mL 및 각 구조물의 하단에 1.5 mL에 의해 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C) 자극.
- 37 ° c, 5% CO2 3 주 동안 인큐베이터에 문화를 유지 하 고 전체 연구 기간 동안 매일 신선한 미디어를 공급. 아니 더 통로 필요 합니다.
3. 세포 분화 및 공동 문화
- 3 주 후, 8 x 103 셀/잘 이전 조립된 3D 상단 SH-SY5Y 인간 신경 세포의 10%를 포함 하는 EMEM의 포함 1.5 mL를 구성 하는 것을 추가 FBS, 1% 항생제/Antimycotic, 그리고 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C)입니다.
- SH SY5Y 신경 세포 세포 분화를 시작 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 각 막 실질 세포의 위에 성장 하는 것을 허용 한다.
- EMEM 1 %FBS 및 10 µ M의 1.5 mL로 세포를 자극 하 여 SH SY5Y 세포 분화를 시작 구성 위에 Retinoic 산. 구성의 하단에는 EMEM 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C)의 1.5 mL를 추가 합니다. 참고 Retinoic 산 단계 어둠 속에서 수행 되어야 합니다.
- 5 일 동안이 차별화 미디어에 셀 문화를 계속 합니다.
- 세포 분화 단계에 도달, 1.5 mL 혈 청 자유로운 매체 포함 된 2 셀 전환 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF)와 1%의 nM 항생제/Antimycotic 구성의 상단에 추가 하 여 EMEM에 추가. 구성의 하단에는 EMEM 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C)의 1.5 mL를 추가 합니다. 참고 BDNF 단계 어둠 속에서 수행 되어야 합니다.
- 표 1에 표시 된 대로 어떤 추가 분석에 대 한 처리 하기 전에 2 추가 일에 대 한 셀을 문화.
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Representative Results
그림 1 은 작업 모델 3D 생체 외에서 단계별 대표 이미지입니다. 첫 번째 단계에서 세포 인간 각 막에서 격리 됩니다. 다음, 그들은 폴 리카 보 네이트 막에 성장 하 고 자기 secreted 3 차원 매트릭스를 비타민 C와 자극. 이 3D 구조 시스템 유도는 다층 세포 vivo에서의 합성-stromal 매트릭스 처럼. 그 후, 신경 세포는 신경 세포 분화를 시작 하 여 뒤 stromal 세포 위에 시드. 이것은 각 막 실질 세포와 3 차원 생체 외에서 모델에 차별화 된 신경 세포의 공동 문화. 그림 2 의 3D 자체 조립된 구조 (그림 2A) 폴 리카 보 네이트 막 보여주는 높은 확대 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지 이며 각 막 실질 세포 은닉 자체 조립된 매트릭스 위에 시드 (그림 2B) 뒤 차별화 된 신경 세포 실질 신경 세포의 배열을 보여주는 위에 시드. 이미지에 화살표 표시 신경 세포. 각 막 stroma와 신경 세포 사이 직접적인 누화를 감안할 때, 우리는 각 막 결함의 규정에 영향을 주는 핵심 선수 기질 계층에 존재 믿습니다. 따라서이 모델 제시는 인간의 신경 체 외에 모델 차별화 SH SY5Y 신경 셀 지속 가능한 신경 형태학에 세포 외 기질 (ECM)와 경작의 우리의 이전 설립된 3D 모델을 결합 하 여 다양 한 차별화 요인입니다. 따라서, 우리는이 모델의 건강 하 고 병에 걸린 ECM 형태학 및 분자 차이의 미래 연구 하면 의심 한다. 우리는이 새로운 3D 생체 외에서 모델 각 막 병 리와 관련 된 각 막 stroma 신경 상호 작용의 중요 한 측면을 해 부 및 새로운 치료제의 개발을 위한 길을 도움이 될 것입니다 믿습니다.
그림 1: 단계별 방식으로 3 차원 생체 외에서 공동 문화 모델을 보여주는 설명을 이미지. 이 화면은 인간의 각 막과 폴 리카 보 네이트 막에 시드에 3 차원 구조, EMEM에 교양 있으며 비타민 c 자극 stromal 세포에서 세포 격리 또한, 차별화 된 신경 세포는 stromal 세포 위에 시드할 수로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 3D 체 외에 시스템의 고배율 TEM 이미지. 폴 리카 보 네이트 막 위에 (A) Stromal 세포 배열. (B) Seeded stromal 세포 위에 신경 세포 분화. 스케일 바 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 분석을 위한 기법 | 잠재적인 영향 |
| 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 | 콜라겐 마커를 조사 (열 나, 열 세, 그리고 열 V), 거리 표식 알파-부드러운 근육 말라 (α-SMA)와 키 중재자 인슐린 성장 인자-1 (IGF-1)와 그것을 포함 하 여 DM에는 수용 체 (IGF1-R) |
| 전송 전자 현미경 검사 법 | 교원 질 소 및 세포-ECM 상호 작용 같은 구조적인 변화 조사 |
| 면역 형광 검사 | 화학적으로 세포 항 원을 조사 하에 형광 염료를 활용 하는 특정 항 체의 사용 |
표 1: 분석 기술입니다.
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Discussion
여러 연구 결과 각 막 질환의 더 나은 이해를 개발 하는 데 도움이 뿐만 아니라 수 치료를 발견 하는 다양 한 동물 모델 개발에 집중 되었습니다. 그러나, 이러한 연구에서 인 간에 게 중요 한 가치는 확인 되지는 않았습니다. 날짜 하려면, 다양 한 생체 외에서 모델 개발 고 널리 그들의 놀라운 임상 중요성으로 조사 되었습니다. 우리의 이전 설립 3 차원 생체 외에서 모델은 새로운 시스템을 크게 비전 연구에 의료 과학 발전에 기여 하 고 vivo에서 이벤트 생체 외에서28 업과의 뽀 얀 능력을 보여줍니다. , 29 , 30.이 프로토콜의 목표는이 체 외에 각 막 모델의 당뇨병 각, 원추 각 막과 같은 각 막 질병과 관련 된 합병증의 세포 및 분자 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있는 차세대 개발 그리고 Fuchs. 이러한 발전 많이 필요한 임상 새로운 치료법의 발견으로 견고한 기초를 제공할 수 있습니다.
이 모델은 DM에서 장소 및 기타 각 막 질병 다른 구조와 세포 변경 식별에 도움이 됩니다. 이를 잠재적으로 질병 관리를 통해 초기 단계에서이 질병에 대 한 심사에 대 한 가능성을 포함 하 여 상당한 의미를 제공 합니다. 여기 간단 합니다, 하지만 그것은 매우 혁신적인 모델을 제안 했다. 가장 중요 한 장점 중 하나는 각 막 실질 세포 분 비 및 인공 환경에 시드 되 고 대신 그들의 자신의 ECM을 조립 수 있습니다입니다. 또한, 신경 더 정확 하 게 모델 각 막 실질 신경 상호 작용을 차별화 수 있습니다. 따라서,이 방법은 기질 환경 내에 있는 세포 뿐 아니라 인간의 각 막 stroma 신경 네트워크, 연구 기능을 제공 한다. 이 문화 플랫폼에는 미래의 조사는 각 막의 질병 상태에 영향을 주는 복잡 한 세포-세포와 세포-매트릭스 상호 작용의 수 있게 됩니다. 이 3 차원 생체 외에서 모델 접근 제공을 개선 하 고 새로운 통찰력 질병 메커니즘, 특히 기존의 현재에 비교 될 때 문화 시스템 또는 동물 모델 예상 된다.
이 3 차원 생체 외에서 모델의 설명된 세대 미래 치료 치료 및 발견에 대 한 방법을 포장 됩니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 우리의 진심으 감사 닥터 벤 파울러에 대 한 그의 기술 편 실험을 확장 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
References
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