Summary
Um protocolo para o aplicativo neuroprotetor da pressão atmosférica de baixa dose de tratamento de plasma em lesões de SH-SY5Y de induzida por privação de glicose.
Abstract
Jato de plasma a pressão atmosférica (APPJ) tem atraído a atenção de muitos pesquisadores de várias disciplinas nos últimos anos, porque suas emissões incluem vários tipos de espécies reativas de nitrogênio (RNS) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Nosso estudo anterior demonstrou o efeito de tilacoides da APPJ contra lesões induzida por estresse oxidativos. O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo de tratamento detalhado em vitro sobre os aplicativos neuroprotetor de hélio APPJs na lesão induzida por privação de glicose nas células SH-SY5Y. A linha de células humanas de neuroblastoma-derivado de SH-SY5Y foi mantida em meio RPMI 1640, suplementado com soro fetal bezerro de 15%. O meio de cultura foi então alterado para RPMI 1640 sem glicose antes do tratamento APPJ. Após uma incubação de 1 h em uma incubadora de célula, viabilidade celular foi determinada utilizando célula contando Kit 8. Os resultados mostraram que, comparado com o grupo de privação de glicose, as células tratadas com APPJ exibiram viabilidade celular significativamente aumentada de forma dose-dependente, com 8 s/bem observado como uma dose ideal. Enquanto isso, o fluxo de hélio não teve efeito sobre a imparidade de celular induzida por privação de glicose. Nossos resultados indicaram que a APPJ poderia potencialmente ser usado como um método de tratamento para as doenças no sistema nervoso central relacionadas com privação de glicose. Este protocolo também pode ser usado como uma aplicação de tilacoides para outras células com diferentes deficiências, mas a cultura de pilha e condições de tratamento APPJ devem ser reajustadas, e a dose de tratamento deve ser relativamente baixa.
Introduction
O cérebro adulto utiliza quase exclusivamente glicose como um substrato para o metabolismo energético sob condições fisiológicas normais. O cérebro humano constitui apenas 2% do peso corporal, mas consome aproximadamente 25% da glicose total dentro do corpo1. Está bem documentado que disfunção do metabolismo de glicose é uma das principais alterações patológicas durante o acidente vascular cerebral isquêmico e várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Huntington (HD) e a doença de Parkinson (PD) 2,3. A falta de glicose e a absorção de glicose prejudicada ou fosforilação oxidativa pode afetar diretamente a produção de ATP e ainda induzir a morte de células nervosas, o que pode aumentar o risco de disfunção neuronal, sugerindo que manter viabilidade celular ou atrasando o ferimento da pilha após privação de glicose pode ser uma abordagem razoável para o tratamento destas doenças. A investigação dos efeitos neuroprotective através da modulação de glicose, com foco em agentes anti-inflamatórios, moduladores de canais de íon, catadores de radicais livres, fatores neurotróficos, etc tem sido de interesse. No entanto, a tradução dessas abordagens neuroprotetor do banco para a prática clínica não foi sucesso4.
Jatos de plasma a pressão atmosférica (APPJs) são um novo tipo de tecnologia de descarga de gás atmosférico de baixa temperatura que tem atraído a atenção de muitos pesquisadores de várias disciplinas nos últimos anos. APPJs foram usados por décadas em várias aplicações biomédicas, tais como o tratamento do câncer célula inativação bacteriana, coagulação sanguínea, cicatrização de feridas, medicina oral,5, etc.6, devido as emissões de vários tipos de espécies reativas de nitrogênio (RNS) e espécies reativas de oxigênio (ROS) (Figura 1)7. Aplicações anteriores de bio-medicina de plasma concentrou-se principalmente o stress oxidativo e/ou nitrative em bactérias, células e tecidos8. No entanto, a APPJ também poderia ser uma "espada de dois gumes" desde RNS e ROS são moléculas de sinalização intracelulares importantes relacionadas a muitos processos fisiológicos e fisiopatológicos9. Óxido nitroso (n) controla uma grande variedade de processos biológicos e desempenha um duplo papel no corpo humano, especialmente no sistema nervoso central (SNC). Baixos níveis de n mostraram suas atividades neuroprotetor ambos em vitro e em vivo através de múltiplos caminhos de sinal10. Nosso estudo anterior relatada pela primeira vez o hélio produção não estava envolvida no efeito neuroprotetor da APPJ contra lesões induzida por estresse oxidativo11APPJ-induzida. No entanto, os efeitos da APPJs sobre outras lesões não foram relatados. Portanto, o objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo de tratamento em vitro sobre os aplicativos neuroprotetor de hélio APPJ na lesão induzida por privação de glicose nas células SH-SY5Y. Diferente de estudos anteriores, nosso protocolo usado tratamento de plasma de baixa dose para aplicações neuroprotetor sem consequências de lesões excessivas induzida por plasma, indicando que o tratamento APPJ poderia ser potencialmente usado como um romance "nenhuma droga do doador "para futuras pesquisas e até mesmo para a tradução clínica. Este protocolo foi também sugerido para ser usado como um aplicativo de tilacoides para outros tipos de células com diferentes deficiências, mas as condições de tratamento APPJ devem ser reajustadas e a dose de tratamento deve ser relativamente baixa.
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Protocol
1. preparação do dispositivo APPJ
atenção: favor consultar todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Por favor, use as práticas de segurança adequadas ao executar todos os experimentos, incluindo o uso de uma coifa e equipamento de protecção pessoal (óculos de segurança, luvas de proteção, jaleco, etc.). O protocolo exige célula padrão manipulação técnicas (esterilização, recuperação da célula, célula passagem, congelamento de célula, coloracao celular, etc).
- Escolher um tubo de quartzo com diâmetro interno de 1 mm e diâmetro externo de 3 mm. alise os cortes transversais em ambas as extremidades, usando uma folha de polimento.
- Usar uma agulha de aço niquelada com um diâmetro de 1,0 mm como o eletrodo de alta tensão. Moer sua ponta a um raio de curvatura de 0,05 mm. Bocal
- envoltório de folha de alumínio (2 mm de largura) ao redor do tubo de quartzo, a 1 cm do tubo de quartzo. Corrigi o ponto de agulha de aço inoxidável a 1 cm da outra extremidade da película de alumínio. Usar o anel de folha de alumínio como o eletrodo de baixa tensão.
2. Aquisição de jatos
- para fornecer um sinal AC, ligue o amplificador de potência de alta tensão para o gerador de sinal de função que serve como uma fonte de alimentação. Registar as formas de onda da tensão aplicada para o eletrodo de alta tensão, conecte uma extremidade da sonda alta tensão para o osciloscópio digital e conecte a outra extremidade da corrente eléctrica. Para proteger o circuito, use um 2K Ω resistor como um resistor de proteção. Ligue o circuito conforme mostrado na Figura 2.
Cuidado: Não toque as linhas de alta tensão. - Continuamente passar hélio (fração de volume, 99.999%) sobre o tubo de quartzo e controlar a taxa de fluxo de gás em um litro de padrão 1.4 estável por minuto (SLM).
Nota: Não usamos um filtro antes de tratar de culturas celulares. A fração de volume de hélio usado no experimento é de 99,999%, e a maioria dos microrganismos não podem viver sob essas condições. - Girar sobre o poder do osciloscópio, gerador de sinal e amplificador de potência de alta tensão. Gire o botão de ajuste de frequência de 5 kHz. Gradualmente aumentar a tensão para um valor de pico a pico de 6 kV.
Nota: O jet é o tempo suficiente (cerca de 3 cm) quando o valor de pico a pico da tensão aplicada na agulha é aproximadamente 6 kV.
3. Preparação de células de SH-SY5Y
- linha de células de neuroblastoma-derivado humano cresce o SH-SY5Y num balão de 2 25 cm em RPMI 1640 suplementado com 15% de soro de vitela fetal (FBS). Manter as células em uma incubadora umidificada contendo 5% CO 2 e 95% ar a 37 ° C.
- Quando as células atingir 85% confluência, cuidadosamente Aspire os meios de cultura e adicionar tripsina 0,25% de 1 mL + 0,1% EDTA para as células.
- Após 15 s de incubação à temperatura ambiente, cuidadosamente Aspire a tripsina e a adicionar 2 mL de RPMI 1640 contendo 15% FBS neutralizar.
- Suavemente Pipetar para cima e para baixo, lavando o fundo do poço, até que o SH-SY5Y monocamada é completamente separada.
- Contar as células por meio da hemocytometer e ajustar a concentração de células a 2 x 10 5 células/mL, adicionando RPMI 1640 médio + 15% FBS e então transferência 100 µ l de suspensão de células para cada poço de uma placa de 96 poços.
- Permitem que as células anexar para 12h em uma incubadora de célula antes do tratamento APPJ.
4. Tratamento de APPJ de SH-SY5Y
tubo- ajustar a distância entre o bocal do quartzo e a plataforma onde será colocada a placa de 96 poços para 3 cm. Certifique-se de que o feixe pode tocar a superfície do meio de cultura.
Nota: A distância não é medida da parte inferior da placa. Primeiro, ele é ajustado a 3 cm entre o bico do tubo de quartzo e a plataforma usada para colocar a placa de 96 poços. - Antes do tratamento, APPJ alterar o meio de cultura em cada poço exceto os poços de controle para RPMI 1640 sem médio glicose.
- Coloque a chapa de baixo do bico APPJ e certifique-se de que os jatos podem atirar verticalmente em cada poço. S
- células de deleite em poços separados com APPJ para 0, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s e 12 s.
Nota: APPJ é gerado pela radiação ionizante hélio ( Figura 1). As células feridas por privação de glicose são tratadas por 4 s e fluxo de hélio s 8 para eliminar os efeitos de hélio em células. Todos os tratamentos devem ser executados em triplicado.
5. Ensaio da viabilidade de células
Nota: não altere o meio nesta etapa.
- Após o tratamento APPJ, Incube as celulas por 1h em uma incubadora celular.
- Adicionar 10 µ l da solução de célula contando Kit-8 (CCK-8) para cada poço.
- Incube as celulas a 37 ° C por 4 h.
Nota: A linha de celular de SH-SY5Y é sensível à privação de glicose condições 12. Viabilidade celular diminui a quase 50% após a privação de glicose 1 h, que é a condição de viabilidade celular ideal para estudos de farmacodinâmica. CCK-8 não tem nenhuma citotoxidade de células e células são incubadas com o reagente de CCK-8 para outra 4h nas condições de privação de glicose após o tratamento APPJ para verificar a viabilidade celular. Após a privação de glicose 8 h e APPJ tratamento, o efeito protetor da APPJ foi significativamente reduzido porque a longa duração da privação de glicose levou a graves danos das células SH-SY5Y. Não havia nenhuma evidência de células vivas após 24 horas de privação de glicose 11. - Medir a absorvância a 450 nm com um leitor de microplacas.
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Representative Results
Dados são expressos como a média ± DP pelo menos três experimentos independentes. Os resultados do grupo foram analisados para variância usando ANOVA. Todas as análises foram realizadas utilizando o software de análise estatística de prisma e p < 0.05 foi o limiar de significância estatística.
Viabilidade celular foi mensurada após 4 h de incubação CCK-8. Como mostrado na Figura 3, privação de glicose reduzidos a viabilidade das células SH-SY5Y de 44,1 ± 2,6% comparada com a do grupo controle (células normalmente cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 15% FBS). O tratamento APPJ aumentou significativamente a viabilidade celular de uma forma dose-dependente em uma dose ideal de 8 s/poço, e a viabilidade celular chegou para 62,27 ± 3,1%. Fluxo de gás não teve efeito sobre a imparidade de celular induzida por privação de glicose (tabela 1).
Figura 1: reações típicas RNS e ROS nas emissões APPJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquema da instalação experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeito protetor da APPJ na lesão induzida por privação de glicose das células SH-SY5Y. As células foram tratadas com APPJ e submetidas a privação de glicose por 1h, após o qual a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de CCK-8. Barras de erro representam média ± DP. * * * P < 0,001 versus controle; #P < 0,05 e ##P < 0,01 contra o grupo de privação de glicose (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Grupos de | Viabilidade celular (% de controle) | |||
| Controle | 100 ± 3,7% | |||
| Privação de glicose | 44,1 ± 2,6% * * * | |||
| Tratamento de APPJ + privação de glicose | 1 s | 49,3 ± 2,8% | ||
| 2 s | 53,0 ± 2,7% | |||
| 4 s | 60,4 ± 2,3%# | |||
| 8 s | 62,3 ± 3,1%# | |||
| 12 s | 51,3 ± 2,7% | |||
| Fluxo + privação de glicose | 4 s | 45,4 ± 2,4% | ||
| 8 s | 44,1 ± 3,1% | |||
Tabela 1: dados de porcentagem de viabilidade de SH-SY5Y células após a privação de glicose, com ou sem tratamento de APPJ. P < 0,001 versus controle; #P < 0,05 e ##P < 0,01 contra o grupo de privação de glicose (n = 3).
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Discussion
SH-SY5Y células são uma linhagem de células de neuroblastoma-derivado humano e são amplamente utilizadas como um modelo de célula apropriada para estudos em vitro na neurotoxicidade ou neuroproteção12. A linha de celular de SH-SY5Y foi sensível às condições de privação de glicose. Viabilidade celular diminuiu para quase 50% após a privação de glicose 1 h, que é a condição de viabilidade celular ideal para estudos de farmacodinâmica. Além disso, a CCK-8 reagente não tem nenhuma citotoxidade de células e as células foram incubadas com reagente de CCK-8 para outra 4h nas condições de privação de glicose após tratamento APPJ para verificar a viabilidade celular. No estudo atual, apresentamos um protocolo de tratamento detalhado em vitro sobre as aplicações neuroprotetor da APPJ sobre a lesão induzida por privação de glicose das células SH-SY5Y.
Modificações e solução de problemas
O tempo de incubação de CCK-8 pode ser menor se a cor em cada bem significativamente alterado. Mas se SH-SY5Y densidade de pilha for inferior a 1 x 104 células por alvéolo, células será morto após tratamento APPJ e privação de glicose. Também é aconselhável reduzir a taxa de fluxo de gás, garantindo que o feixe de plasma pode tocar a superfície do meio de cultura. APPJ também pode ser usado como um agente de tilacoides para outras linhas de celular neuronal afins (HT-22, neuro-2A ou neurônios mesmo primários) com diferentes deficiências (hipóxia, estresse oxidativo, etc), mas a cultura de pilha e condições de tratamento APPJ devem ser reajustado, e a dose de tratamento deve ser relativamente baixa. Nós tentamos reduzir a distância neste parâmetro de geração APPJ, e achamos que o jato de plasma diretamente pode afetar a fixação de células SH-SY5Y que poderia resultar em lesões de célula (SH-SY5Y células foram facilmente retiradas seu Estado aderente). Acreditamos que a distância de tratamento deve basear-se sobre as características da célula e a tolerância para o tratamento de jato de plasma.
Limitações da técnica
O atual protocolo centrou-se apenas o efeito em vitro neuroprotetor da APPJ em células de SH-SY5Y de feridos de privação de glicose. Pesquisa anterior mostrou que a inalação de plasma poderia melhorar funções cardíacas em um rato do miocárdio modelo13. Mais trabalho ainda é necessário investigar o método de tratamento na vivo para a proteção do cérebro.
Importância no que diz respeito a métodos existentes
Pesquisas anteriores na medicina de plasma prestado mais atenção às capacidades de inativação de bactérias, células cancerosas e os tecidos por causa do stress oxidativo e/ou nitrative induzido por APPJ tratamento14. Nosso protocolo usado tratamento de plasma de baixa dose para aplicações neuroprotetor sem consequências de lesões excessivas induzida por plasma, indicando que o tratamento APPJ poderia potencialmente ser usado como um romance "Nenhuma droga de doador" para as futuras pesquisas e até mesmo para a tradução clínica.
Passos críticos dentro do protocolo
O passo mais crítico neste protocolo é certificar-se que a dose de tratamento APPJ é relativamente baixa, desde o tratamento com APPJ irá agravar lesões de célula e diretamente induzir a morte celular. Outro passo crítico é controlar a duração de privação de glicose ou as células morrem e o efeito de tilacoides de APPJ será significativamente reduzido. Hélio puro, em vez de hélio misturado com uma pequena quantidade de ar, ou de O2 foi usado. Quando Hélio misturado com uma pequena quantidade de ar ou de O2 é usado, aumentará a quantidade de ROS no plasma. É muito difícil fazer um diagnóstico, quando ocorrem reações químicas complicadas de plasma.
Aplicações futuras
Também vale a pena notar que foi aplicado o tratamento de APPJ após a indução de privação de glicose nas células de SH-SY5Y, indicando que a APPJ poderia potencialmente ser usado como um método de tratamento para doenças relacionadas com a privação de glicose no sistema nervoso central, acidente vascular cerebral isquêmico especialmente. Portanto, é necessário para estudos futuros avaliar as condições de tratamento do efeito neuroprotetor da APPJ em paz e em combinação com outros agentes neuroprotective em diferentes períodos após a privação de glicose.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse foram declarados em relação a este papel.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo fundo de inovação do Instituto de neurocirurgia de Beijing (2014-11), Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. 11475019 e 81271286) e a Fundação de ciência Natural de Beijing (n º 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
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