Summary
Een protocol voor het neuroprotectieve toepassing van lage dosis luchtdruk plasma behandeling op glucose ontbering-geïnduceerde SH-SY5Y verwondingen.
Abstract
De atmosferische druk plasma jet (APPJ) heeft trok de aandacht van vele onderzoekers uit meerdere disciplines in de afgelopen jaren, omdat de uitstoot meerdere soorten reactieve stikstof soorten (RNS) en reactieve zuurstof soorten (ROS omvatten). Onze vorige studie blijkt het effect van de cytoprotective van de APPJ tegen oxidatieve stress-geïnduceerde verwondingen. Het doel van de huidige studie is bedoeld als een gedetailleerde in vitro behandeling protocol betreffende de toepassingen van de neuroprotectieve van helium APPJs op glucose ontbering-veroorzaakte schade in SH-SY5Y cellen. De SH-SY5Y menselijke neuroblastoma afkomstige cellijn werd gehandhaafd in RPMI 1640 medium aangevuld met 15% foetaal kalfsserum. Het kweekmedium werd vervolgens gewijzigd in RPMI 1640 zonder glucose vóór de APPJ behandeling. Na een incubatie van 1 uur in een cel incubator, was de levensvatbaarheid van cellen bepaald met behulp van cel tellen Kit 8. De resultaten toonden aan dat, in vergelijking met de glucose ontbering groep, cellen behandeld met APPJ tentoongesteld aanzienlijk verhoogde levensvatbaarheid op een dosis-afhankelijke manier, met 8 s/putje waargenomen als een optimale dosis. Ondertussen, helium stroom had geen effect op de schending van de ontbering-geïnduceerde cel glucose. Onze resultaten aangegeven dat de APPJ als een behandelingsmethode van de ziekten in het centrale zenuwstelsel aan deprivatie glucose gerelateerde potentieel gebruikt kan worden. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een cytoprotective-applicatie voor andere cellen met verschillende afboekingen, maar de celcultuur en APPJ behandeling voorwaarden moeten worden aangepast, en de dosis behandeling moet relatief laag.
Introduction
De volwassen hersenen gebruikt bijna uitsluitend glucose als substraat voor energiemetabolisme onder normale fysiologische omstandigheden. Het menselijk brein vormt slechts 2% van het lichaamsgewicht, maar verbruikt ongeveer 25% van de totale glucose binnen het lichaam1. Het is goed gedocumenteerd dat glucose metabolisme dysfunctie is één van de belangrijkste pathologische veranderingen tijdens ischemische beroerte en diverse neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Huntington (HD) en de ziekte van Parkinson (PD) 2,3. Het gebrek aan glucose en verminderde glucose-opname of oxidatieve fosforylatie kan rechtstreeks van invloed zijn ATP productie en verdere veroorzaken neurale celdood, die kan het risico van neuronale dysfunctie, suggereren dat handhaving levensvatbaarheid van de cellen verhogen of vertragen cel letsel na glucose ontbering misschien wel een redelijke benadering voor de behandeling van deze ziekten. Het onderzoek van neuroprotectieve effecten via glucose modulatie, gericht op ontstekingsremmers, ion kanaal modulatoren, vrije radicalen aaseters, neurotrophic factoren, etc. is van belang. Vertaling van deze neuroprotectieve benaderingen van Bank naar de klinische praktijk is echter geen succesvolle4.
Luchtdruk plasma jets (APPJs) zijn een nieuw soort atmosferische lage temperatuur gas geen kwijting technologie die heeft trok de aandacht van vele onderzoekers uit meerdere disciplines in de afgelopen jaren. APPJs zijn gebruikt voor decennia in verschillende biomedische toepassingen zoals de behandeling van de cel van de kanker, bacteriële inactivatie, bloedstolling, wondgenezing, oraal geneesmiddel, etc.5,6, als gevolg van de uitstoot tot meerdere typen van reactieve stikstof soorten (RNS) en reactieve zuurstof soorten (ROS) (Figuur 1)7. Toepassingen van de bio-geneeskunde vorige plasma is voornamelijk gericht op de oxidatieve en/of nitrative stress op bacteriën, cellen en weefsels8. De APPJ kan ook wel een "tweesnijdend zwaard" aangezien RNS en ROS belangrijke intracellulaire signalering moleculen aan vele fysiologische en pathofysiologische processen9gerelateerde zijn. Stikstofoxide (NO) beheert een breed scala aan biologische processen en speelt een dubbele rol in het menselijk lichaam, met name in het centrale zenuwstelsel (CNS). Lage niveaus van nr gebleken hun neuroprotectieve activiteiten zowel in vitro en in vivo via meerdere signaal trajecten10. Onze vorige studie eerst gemeld dat helium APPJ-geïnduceerde geen productie was betrokken bij het neuroprotectieve effect van APPJ tegen oxidatieve stress-geïnduceerde verwondingen11. De gevolgen van APPJs voor andere verwondingen zijn echter niet gemeld. Daarom is het doel van de huidige studie om een in vitro behandeling protocol betreffende de toepassingen van de neuroprotectieve van helium APPJ op glucose ontbering-veroorzaakte schade in SH-SY5Y cellen. Anders dan eerdere studies, onze protocol gebruikt lage dosis plasma behandeling voor neuroprotectieve toepassingen zonder de gevolgen van excessieve plasma-geïnduceerde verwondingen, die aangeeft dat de APPJ behandeling mogelijk zou kunnen worden gebruikt als een roman "geen donor drug "voor toekomstig onderzoek en zelfs voor klinische vertaling. Dit protocol werd ook voorgesteld om te worden gebruikt als een cytoprotective-applicatie voor andere celtypes met verschillende afboekingen, maar de APPJ behandeling voorwaarden moeten opnieuw aangepast en de dosis van de behandeling moet relatief laag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van het APPJ-apparaat
Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Gebruik de juiste veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van alle experimenten, met inbegrip van het gebruik van een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, beschermende handschoenen, laboratoriumjas, enz.). Het protocol vereist standaard cel behandeling technieken (steriliseren, herstel van de cel, cel passaging, bevriezing van de cel, cel kleuring, etc.).
- Kies een kwarts-buis met een inwendige diameter van 1 mm en een uitwendige diameter van 3 mm. de dwarsdoorsneden aan beide uiteinden met een polijst folie glad.
- Gebruiken een vernikkelde naald van roestvrij staal met een diameter van 1,0 mm als de hoogspanning-elektrode. Slijpen van haar tip om kromtestraal van 0,05 mm.
- Wrap de aluminiumfolie (2 mm in de breedte) rond de kwarts buis op 1 cm van de quartz-buis nozzle. De roestvrijstalen naaldpunt op 1 cm vanaf de andere kant van de aluminiumfolie vaststellen. De aluminiumfolie ring gebruiken als de lage spanning elektrode.
2. Verwerving van Jets
- voorzien van een AC-signaal, de hoogspannings-eindversterker verbinden met de functie signaalgenerator die als een voeding fungeert. Het registreren van de golfvormen van de toegepaste spanning op de hoge spanning elektrode, sluit één uiteinde van de sonde van de hoog-voltage aan de digitale oscilloscoop en sluit het andere uiteinde aan op netspanning. Ter bescherming van het circuit, gebruiken een 2 k Ω weerstand als een beschermende weerstand. Sluit het circuit zoals aangegeven in Figuur 2.
Let op: Raak niet de hoogspanning lijnen. - Continu helium (volume Fractie, 99,999%) voorbij de quartz-buis en controle van de gasstroom op een stabiele 1.4 standaard Liter per minuut (SLM).
Opmerking: Niet wij een filter gebruiken voor het behandelen van celculturen. De Fractie van de volume van helium gebruikt in het experiment is 99,999%, en de meeste micro-organismen kunnen niet leven onder deze omstandigheden. - Zet de kracht van de oscilloscoop, signaalgenerator en hoogspannings-eindversterker. Draai de instelknop van de frequentie tot 5 kHz. Geleidelijk verhogen van de spanning tot een waarde van de piek-tot-piek van 6 kV.
Opmerking: De jet is lang genoeg is (ongeveer 3 cm) wanneer de waarde van de piek-tot-piek van de spanning toegepast in de naald is ongeveer 6 kV.
3. Preparaat cellen van de SH-SY5Y
- groeien de SH-SY5Y menselijke neuroblastoma afkomstige cellijn in een maatkolf van 25 cm 2 in RPMI 1640 medium aangevuld met 15% foetaal kalfsserum (FBS). Handhaven van de cellen in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 en 95% lucht bij 37 ° C.
- Wanneer de cellen bereiken 85% samenvloeiing, zorgvuldig gecombineerd de voedingsbodems en 1 mL 0,25% trypsine + 0,1% EDTA aan de cellen toevoegen.
- Na 15 s incubatie bij kamertemperatuur, zorgvuldig gecombineerd de trypsine en voeg 2 mL RPMI 1640 met 15% FBS te neutraliseren.
- Pipetteer zachtjes op en neer, wassen van de bodem van de put, totdat de SH-SY5Y enkelgelaagde volledig vrijstaande is.
- Cellen tellen door middel van de hemocytometer en de concentratie van de cel tot 2 x 10 5 cellen/mL aanpassen door het toevoegen van RPMI 1640 middellange + 15% FBS, en vervolgens de overdracht 100 µL celsuspensie aan elk putje van een 96-wells-plaat.
- De cellen te voegen gedurende 12 uur in een cel incubator vóór de behandeling van de APPJ toestaan.
4. APPJ behandeling van SH-SY5Y
- aanpassen de afstand tussen het mondstuk van de quartz buis en het platform waar de 96-wells-plaat wordt geplaatst tot 3 cm. er zorg voor dat de straal het oppervlak van het kweekmedium raken kan.
Opmerking: De afstand wordt niet gemeten vanaf de onderkant van de plaat. Het is ten eerste tot 3 cm tussen het mondstuk van de quartz-buis en het platform gebruikt om plaats van 96-wells-plaat aangepast. - Voor de behandeling van APPJ, omzetten in het kweekmedium in elk putje met uitzondering van de controleputjes RPMI 1640 zonder glucose medium.
- Plaats van de plaat onder de APPJ verstuiver en ervoor te zorgen dat de jets verticaal in elk putje schieten kunnen.
- Traktatie cellen in aparte putjes met APPJ voor 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s, en 12 s.
Opmerking: APPJ wordt gegenereerd door ioniserende helium ( Figuur 1). De cellen gewond door glucose ontbering worden behandeld door 4 s en 8 s helium doorstroming naar het elimineren van de effecten van helium op cellen. Alle behandelingen moeten worden uitgevoerd in drievoud.
5. Cel levensvatbaarheid Assay
Opmerking: Wijzig niet het medium in deze stap.
- Na de APPJ behandeling, Incubeer de cellen gedurende 1 uur in een cel incubator.
- Voeg toe 10 µL van cel tellen Kit-8 (CCK-8) oplossing aan elk putje.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 4 h.
Opmerking: De SH-SY5Y-cellijn is gevoelig voor glucose ontbering voorwaarden 12. Levensvatbaarheid van de cellen daalt tot bijna 50% na 1 h glucose ontbering, die de optimale cel levensvatbaarheid voorwaarde voor farmacodynamica studies. CCK-8 heeft geen cytotoxiciteit naar cellen en cellen worden geïncubeerd met CCK-8 reagens voor een andere 4 h in de voorwaarden van de achterstelling glucose na behandeling van de APPJ om te controleren van de levensvatbaarheid van de cellen. Na 8u glucose ontbering en APPJ behandeling, werd het beschermende effect van APPJ aanzienlijk verminderd omdat de lange duur van de glucose vrijheidsstraf heeft geleid tot ernstige schade van de SH-SY5Y cellen. Er was geen bewijs van levende cellen na 24u glucose ontbering 11. - Meet de extinctie bij 450 nm met een lezer microplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Groepsresultaten werden geanalyseerd voor variantie met ANOVA. Alle analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware Prism en p < 0.05 werd de drempel voor statistische significantie.
Levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten na 4 uur van CCK-8 incubatie. Zoals blijkt uit Figuur 3, glucose ontbering verminderde de levensvatbaarheid van de cellen van de SH-SY5Y tot 44,1 ± 2,6% vergeleken met die van de controlegroep (cellen normaal gekweekt in RPMI 1640 opslagmedium met 15% FBS). De behandeling van de APPJ aanzienlijk verhoogd levensvatbaarheid van de cellen op een dosis-afhankelijke manier bij een optimale dosis van 8 s/put, en de levensvatbaarheid van de cellen bereikt tot 62.27 ± 3,1%. Gasstroom had geen effect op de bijzondere waardevermindering van glucose, ontbering-geïnduceerde cel (tabel 1).
Figuur 1: typische RNS en ROS reacties APPJ uitstoot. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische van de experimentele opstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: beschermend effect van APPJ op glucose ontbering-geïnduceerde letsel van cellen van de SH-SY5Y. Cellen werden behandeld met APPJ en onderworpen aan glucose vrijheidsstraf 1 h, waarna de levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met behulp van de CCK-8 bepaling. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. *** P < 0.001 versus controle; #P < 0,05 en ##P < 0,01 ten opzichte van de glucose ontbering groep (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Groepen | Levensvatbaarheid van de cellen (controle %) | |||
| Controle | 100 ± 3,7% | |||
| Glucose ontbering | 44,1 ± 2.6% *** | |||
| APPJ behandeling + Glucose ontbering | 1 s | 49.3 ± 2,8% | ||
| 2 s | 53,0 ± 2,7% | |||
| 4 s | 60.4 ± 2,3%# | |||
| 8 s | 62,3 ± 3,1%# | |||
| 12 s | 51.3 ± 2,7% | |||
| Hij stroom + Glucose ontbering | 4 s | 45.4 ± 2,4% | ||
| 8 s | 44,1 ± 3,1% | |||
Tabel 1: gegevens van de procentuele levensvatbaarheid van de SH-SY5Y cellen na glucose ontbering met of zonder APPJ behandeling. P < 0.001 versus controle; #P < 0,05 en ##P < 0,01 ten opzichte van de glucose ontbering groep (n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SH-SY5Y cellen zijn een menselijke neuroblastoma afkomstige cellijn en worden veel gebruikt als een model van de juiste cel voor in vitro onderzoek naar neurotoxiciteit of neuroprotectie12. De SH-SY5Y-cellijn was gevoelig voor glucose ontbering voorwaarden. Levensvatbaarheid van de cellen daalde tot bijna 50% na 1 h glucose ontbering, die de optimale cel levensvatbaarheid voorwaarde voor onderzoek van de farmacodynamica. Bovendien, CCK-8 reagens heeft geen cytotoxiciteit naar cellen en cellen werden geïncubeerd met CCK-8 reagens voor een andere 4 h in de voorwaarden van de achterstelling glucose na behandeling van de APPJ om te controleren van de levensvatbaarheid van de cellen. In de huidige studie bieden wij een gedetailleerde in vitro behandeling protocol betreffende de toepassingen van de neuroprotectieve van APPJ inzake de glucose ontbering-veroorzaakte schade van SH-SY5Y cellen.
Wijzigingen en probleemoplossing
De incubatietijd van CCK-8 zou korter als de kleur in elk goed aanzienlijk gewijzigd. Maar als de celdichtheid SH-SY5Y lager dan 1 x 104 cellen per putje is, cellen zal dood na glucose ontbering en APPJ behandeling. Het is ook aanbevolen om het verminderen van de gasstroom, terwijl ervoor te zorgen dat de plasma-straal het oppervlak van het kweekmedium raken kan. APPJ kan ook worden gebruikt als een agent van de cytoprotective voor andere neuronale verwante cellijnen (HT-22, neuro-2A of zelfs primaire neuronen) met verschillende bijzondere waardeverminderingen (hypoxie, oxidatieve stress, enz.), maar de celcultuur en APPJ behandeling voorwaarden moeten aangepast, en de dosis van de behandeling moet relatief laag. We hebben geprobeerd om de afstand in deze APPJ generatie parameter, en we vonden dat de plasma jet rechtstreeks van invloed kan zijn op de bevestiging van de SH-SY5Y cellen, die in verwondingen van de cel resulteren kan (SH-SY5Y cellen werden gemakkelijk gescheiden van hun aanhangend staat). Wij zijn van mening dat de behandeling afstand op de eigenschappen van de cellen en de tolerantie voor de behandeling van plasma jet berusten moet.
Beperkingen van de techniek
Het huidige protocol alleen gericht op het in vitro neuroprotectieve effect van APPJ op glucose ontbering-verwonde SH-SY5Y cellen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat inhalatie van plasma cardiale functies in een rat myocardiaal infarct model13zou kunnen verbeteren. Meer werk is nog steeds nodig om te onderzoeken de in vivo behandelingsmethode voor de bescherming van de hersenen.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Eerder onderzoek op plasma geneeskunde meer aandacht besteed aan inactivatie capaciteiten in bacteriën, kankercellen en weefsels door de stress van het oxidatieve en/of nitrative geïnduceerd door APPJ behandeling14. Ons protocol gebruikt lage dosis plasma behandeling voor neuroprotectieve toepassingen zonder de gevolgen van excessieve plasma-geïnduceerde verwondingen, die aangeeft dat de APPJ behandeling kon potentieel worden gebruikt als een roman "Geen donor drug" voor het toekomstige onderzoek en zelfs voor klinische vertaling.
Kritische stappen binnen het protocol
De meest kritische stap in dit protocol is om ervoor te zorgen dat de APPJ behandeling dosis is relatief laag, sinds over behandeling met APPJ zal cel verwondingen verergeren en rechtstreeks leiden tot celdood. Een andere belangrijke stap is het bepalen van de duur van de vrijheidsbeneming glucose of de cellen zullen sterven en het effect van de cytoprotective van de APPJ zal aanzienlijk worden verminderd. Pure helium, werd in plaats van helium met een kleine hoeveelheid O2 of lucht vermengd gebruikt. Wanneer helium gemengd met een kleine hoeveelheid O2 of door de lucht wordt gebruikt, vergroot de hoeveelheid ROS in het plasma. Het is zeer moeilijk te maken van een diagnose als ingewikkeld plasma chemische reacties optreden.
Toekomstige toepassingen
Het is ook de moeite waard om op te merken dat de APPJ behandeling werd toegepast na de inductie van ontbering van de glucose op SH-SY5Y cellen, die aangeeft dat de APPJ potentieel worden als een behandelingsmethode voor glucose ontbering-gerelateerde ziekten in het centrale zenuwstelsel gebruikt kan, vooral ischemische beroerte. Het is daarom noodzakelijk voor toekomstige studies om te evalueren van de voorwaarden van de behandeling van het neuroprotectieve effect van APPJ, zowel alleen als in combinatie met andere agentia neuroprotectieve in verschillende periodes na glucose ontbering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten werden met betrekking tot dit document verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het innovatiefonds van Peking neurochirurgische Instituut (2014-11), nationale Natural Science Foundation van China (nrs. 11475019 en 81271286) en Peking Natural Science Foundation (nr. 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
- Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
- Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
- Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339 (2015).
- Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005 (2012).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
- Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049 (2016).
- Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
- Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401 (2017).
- Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309 (2014).
- Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).
