Summary
Un protocollo per l'applicazione di neuroprotective del trattamento al plasma a pressione atmosferica della basso-dose sulle lesioni di SH-SY5Y indotta da privazione del glucosio.
Abstract
Il getto di plasma di pressione atmosferica (APPJ) ha attirato l'attenzione di molti ricercatori di diverse discipline negli ultimi anni, perché le sue emissioni includono più tipi di specie reattive dell'azoto (RNS) e specie reattive dell'ossigeno (ROS). Il nostro studio precedente ha mostrato l'effetto cytoprotective di APPJ contro le lesioni indotte da stress ossidativa. L'obiettivo del presente studio è quello di fornire un protocollo di trattamento dettagliato in vitro per quanto riguarda le applicazioni di neuroprotective di elio APPJs sulla lesione indotta da privazione di glucosio nelle cellule SH-SY5Y. La linea di cellulari derivate di neuroblastoma umano SH-SY5Y è stata mantenuta in RPMI 1640 supplementato con 15% di siero fetale di vitello. Il terreno di coltura è stato quindi modificato RPMI 1640 senza glucosio prima del trattamento APPJ. Dopo un'incubazione di 1 h in un'incubatrice cellulare, attuabilità delle cellule è stata determinata utilizzando cella contando Kit 8. I risultati hanno mostrato che, rispetto al gruppo di privazione del glucosio, cellule trattate con APPJ esposto attuabilità delle cellule significativamente aumentata in modo dose-dipendente, con 8 s/bene osservata come una dose ottimale. Nel frattempo, flusso di elio non ha avuto effetto sul danno cellulare indotta da privazione del glucosio. I nostri risultati hanno indicato che APPJ potrebbero essere utilizzati come un metodo di trattamento per le malattie del sistema nervoso centrale legate alla privazione del glucosio. Questo protocollo potrebbe anche essere usato come applicazione cytoprotective per altre cellule con differenti disabilità, ma la coltura cellulare e condizioni di trattamento APPJ dovrebbero essere regolate, e la dose di trattamento deve essere relativamente bassa.
Introduction
Il cervello adulto usa quasi esclusivamente il glucosio come substrato per il metabolismo energetico in condizioni fisiologiche normali. Il cervello umano costituisce solo il 2% del peso corporeo ma consuma circa il 25% del glucosio totale all'interno del corpo1. È ben documentato che disfunzione del metabolismo del glucosio è uno dei principali cambiamenti patologici durante il colpo ischemico e varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Huntington (HD) e malattia di Parkinson (MDP) 2,3. La mancanza di glucosio e l'assorbimento del glucosio alterata o fosforilazione ossidativa può influenzare direttamente la produzione di ATP e ulteriormente indurre la morte delle cellule neurali, che può aumentare il rischio di disfunzione di un neurone, suggerente che mantenere la vitalità cellulare o ritardare la lesione delle cellule dopo privazione del glucosio potrebbe essere un approccio ragionevole per il trattamento di queste malattie. L'indagine degli effetti neuroprotective via modulazione glucosio, concentrandosi su modulatori di canale ionico, antiradicali liberi, agenti antinfiammatori, fattori neurotrofici, ecc è stato di interesse. Tuttavia, la traduzione di questi approcci di neuroprotective dalla panchina alla pratica clinica non è successo4.
Ugelli del plasma di pressione atmosferica (APPJs) sono un nuovo tipo di tecnologia di scarico di gas atmosferici bassa temperatura che ha attirato l'attenzione di molti ricercatori di diverse discipline negli ultimi anni. APPJs sono stati utilizzati per decenni in varie applicazioni biomediche, come trattamento del cancro delle cellule, inattivazione batterica, coagulazione del sangue, la guarigione della ferita, medicina orale, ecc.5,6, dovuto le sue emissioni di più tipi di specie reattive dell'azoto (RNS) e specie reattive dell'ossigeno (ROS) (Figura 1)7. Applicazioni di bio-medicina del plasma precedenti incentrato principalmente sullo stress ossidativo e/o nitrative su batteri, cellule e tessuti8. Tuttavia, il APPJ potrebbe anche essere una "spada affilata" poiché RNS e ROS sono molecole di segnalazione intracellulare importante relazionate a molti processi fisiologici e fisiopatologici9. Protossido di azoto (NO) controlla una vasta gamma di processi biologici e svolge un duplice ruolo nel corpo umano, soprattutto nel sistema nervoso centrale (SNC). Bassi livelli di NO hanno dimostrato la loro attività di neuroprotective entrambi in vitro e in vivo attraverso molteplici vie di segnale10. Il nostro studio precedente in primo luogo segnalato che Elio APPJ-indotto nessuna produzione è stato coinvolto nell'effetto neuroprotective del APPJ contro le lesioni indotte da stress ossidativo11. Tuttavia, gli effetti della APPJs su altre lesioni non sono stati segnalati. Pertanto, l'obiettivo del presente studio è di fornire un protocollo di trattamento in vitro per quanto riguarda le applicazioni di neuroprotective di elio APPJ sulla lesione indotta da privazione di glucosio nelle cellule SH-SY5Y. Diverso da studi precedenti, nostro protocollo utilizzato trattamento al plasma della basso-dose per applicazioni di neuroprotective senza le conseguenze delle lesioni eccessive di plasma-indotta, che indica che il trattamento di APPJ poteva essere utilizzato come un romanzo "nessun farmaco donatore "per la ricerca futura e anche per traduzione clinica. Questo protocollo è stato anche suggerito per essere utilizzato come un'applicazione di cytoprotective per altri tipi di cellule con differenti disabilità, ma le condizioni di trattamento APPJ dovrebbero essere ri-regolate e la dose di trattamento deve essere relativamente bassa.
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Protocol
1. preparazione del dispositivo APPJ
Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare pratiche adeguate di sicurezza durante l'esecuzione di tutti gli esperimenti, compreso l'uso di una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale (occhiali protettivi, guanti protettivi, camice da laboratorio, ecc.). Il protocollo richiede cella standard gestione tecniche (sterilizzazione, recupero delle cellule, cellule passaggio, congelamento delle cellule, macchiatura delle cellule, ecc.).
- Scegliere un tubo di quarzo con un diametro interno di 1 mm e un diametro esterno di 3 mm. lisciare le sezioni trasversali ad entrambe le estremità utilizzando una lamina lucidatura.
- Utilizzare un ago di acciaio nichelato con un diametro di 1.0 mm come l'elettrodo ad alta tensione. Macinare la sua punta ad un raggio di curvatura di 0,05 mm. Ugello
- wrap stagnola (2 mm di larghezza) attorno al tubo di quarzo a 1 cm dal tubo di quarzo. Difficoltà la punta dell'ago in acciaio inox a 1 cm da altra estremità del foglio di alluminio. Utilizzare l'anello di lamina di alluminio come l'elettrodo di bassa tensione.
2. Acquisizione di getti
- per fornire un segnale AC, collegare l'amplificatore di potenza ad alta tensione per il generatore di segnale di funzione che funge da un alimentatore. Per registrare le forme d'onda della tensione applicata all'elettrodo ad alta tensione, collegare un'estremità della sonda ad alta tensione per l'oscilloscopio digitale e collegare l'altra estremità alla rete di alimentazione. Per proteggere il circuito, utilizzare un 2K Ω resistenza di un resistore di protezione. Collegare il circuito come illustrato nella Figura 2.
Attenzione: Non toccare le linee ad alta tensione. - Continuamente passare Elio (frazione di volume, 99,999%) sopra il tubo di quarzo e controllo della portata di gas in uno stabile 1,4 Standard litri al minuto (SLM).
Nota: Non usiamo un filtro prima di trattare colture cellulari. La frazione di volume di elio usato nell'esperimento è 99,999%, e la maggior parte dei microrganismi non possono vivere in queste condizioni. - Attivare il potere dell'oscilloscopio, generatore di segnale e amplificatore di potenza ad alta tensione. Ruotare la manopola di regolazione di frequenza di 5 kHz. Aumentare gradualmente la tensione ad un valore di picco-picco di 6 kV.
Nota: Il getto è abbastanza lungo (circa 3 cm) quando il valore di picco-picco della tensione applicata nell'ago è di circa 6 kV.
3. Preparazione delle cellule SH-SY5Y
- Grow SH-SY5Y neuroblastoma-derivato di cellula umana in una beuta, 2 cm 25 in RPMI 1640 supplementato con 15% siero fetale di vitello (FBS). Mantenere le cellule in un incubatore contenente 5% CO 2% e 95% aria a 37 ° C.
- Quando le cellule raggiunge 85% confluenza, attentamente aspirare i terreni di coltura e aggiungere della tripsina 1 mL 0,25% + 0,1% EDTA alle cellule.
- 15 dopo incubazione di s a temperatura ambiente, attentamente aspirare la tripsina e aggiungere 2 mL di RPMI 1640 contenente 15% FBS per neutralizzare.
- Delicatamente Pipettare su e giù, lavare il fondo del pozzo, fino a quando non sia completamente staccato il monostrato di SH-SY5Y.
- Contare le celle mediante l'emocitometro e regolare la concentrazione di cellule a 2 x 10 5 cellule/mL aggiungendo RPMI 1640 medio + 15% FBS e quindi trasferire 100 µ l di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Permettono alle cellule di allegare per 12 h in un'incubatrice di cellulare prima del trattamento APPJ.
4. Trattamento APPJ di SH-SY5Y
- regolare la distanza tra l'ugello del quarzo tubo e la piattaforma dove inserire la piastra a 96 pozzetti a 3 cm. assicurare che il fascio può toccare la superficie del terreno di coltura.
Nota: La distanza non si misura dalla parte inferiore della piastra. In primo luogo è stata impostata a 3 cm tra l'ugello del tubo di quarzo e la piattaforma utilizzata per posizionare la piastra a 96 pozzetti. - Prima del trattamento di APPJ, modificare il terreno di coltura in ogni pozzetto tranne i pozzetti di controllo in RPMI 1640 senza medium del glucosio.
- Posizionare la piastra sotto l'ugello APPJ e garantire che i getti possono sparare verticalmente in ogni pozzetto.
- Cellule di delizia in pozzetti separati con APPJ per 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s e 12 s.
Nota: APPJ è generato dalla ionizzazione dell'elio ( Figura 1). Le cellule ferite da privazione del glucosio sono trattate da 4 s e flusso di elio 8 s per eliminare gli effetti di elio sulle cellule. Tutti i trattamenti devono essere eseguiti in triplice copia.
5. Analisi di attuabilità di cella
Nota: non modificare il mezzo in questo passaggio.
- Dopo il trattamento APPJ, incubare le cellule per 1h in un'incubatrice di cell.
- Aggiungere 10 µ l di soluzione di cella contando Kit-8 (CCK-8) in ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule a 37 ° C per 4 h.
Nota: La linea di cellule SH-SY5Y è sensibile al glucosio privazione condizioni 12. Vitalità cellulare diminuisce a quasi il 50% dopo privazione del glucosio 1 h, che è la condizione di vitalità cellulare ottimale per gli studi di farmacodinamica. CCK-8 non ha nessuna citotossicità alle cellule e le cellule sono incubate con reagente CCK-8 per un altro 4 h nelle condizioni di deprivazione di glucosio dopo il trattamento APPJ per controllare la vitalità cellulare. Dopo privazione del glucosio 8h e APPJ trattamento, l'effetto protettivo di APPJ è stata ridotta significativamente perché la lunga durata della privazione del glucosio ha portato a gravi danni delle cellule SH-SY5Y. Non c'era nessuna prova delle cellule viventi dopo 24 h glucosio privazione 11. - Misurare l'assorbanza a 450 nm con un lettore di micropiastre.
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Representative Results
I dati sono espressi come media ± SD di almeno tre esperimenti indipendenti. Risultati del gruppo sono stati analizzati per varianza mediante ANOVA. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando software di analisi statistica prisma e p < 0.05 era la soglia di significatività statistica.
La vitalità cellulare è stata misurata dopo 4 h di incubazione CCK-8. Come mostrato nella Figura 3, la privazione del glucosio ridotto la vitalità delle cellule SH-SY5Y a 44,1 ± 2,6% rispetto a quello del gruppo di controllo (cellule normalmente coltivate in medium RPMI 1640 contenente 15% FBS). Il trattamento di APPJ ha aumentato significativamente la vitalità cellulare in maniera dose-dipendente a una dose ottimale di 8 s/bene, e l'attuabilità delle cellule ha raggiunto al 62,27 ± 3,1%. Flusso del gas non ha avuto effetto sul danno cellulare indotta da privazione del glucosio (tabella 1).
Figura 1: tipico RNS e ROS reazioni delle emissioni APPJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schema del setup sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: effetto protettivo del APPJ sulla lesione indotta da privazione di glucosio delle cellule SH-SY5Y. Le cellule sono state trattate con APPJ e sottoposti alla privazione del glucosio per 1 h, dopo di che l'attuabilità delle cellule è stata determinata usando l'analisi di CCK-8. Barre di errore rappresentano la media ± SD. * * * P < 0.001 contro controllo; #P < 0,05 e n. #P < 0,01 contro il gruppo di privazione del glucosio (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gruppi | Vitalità cellulare (% di controllo) | |||
| Controllo | 100 ± 3,7% | |||
| Privazione del glucosio | 44,1 ± 2,6% * * * | |||
| Trattamento APPJ + privazione del glucosio | 1 s | 49,3 ± 2,8% | ||
| 2 s | 53,0 ± 2,7% | |||
| 4 s | 60,4 ± 2,3%# | |||
| 8 s | 62,3 ± 3,1%# | |||
| 12 s | 51,3 ± 2,7% | |||
| Egli flusso + privazione del glucosio | 4 s | 45,4 ± 2,4% | ||
| 8 s | 44,1 ± 3,1% | |||
Tabella 1: dati di redditività percentuale di SH-SY5Y cellule dopo privazione del glucosio con o senza trattamento di APPJ. P < 0.001 contro controllo; #P < 0,05 e n. #P < 0,01 contro il gruppo di privazione del glucosio (n = 3).
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Discussion
SH-SY5Y cellule sono una linea di cellule umane di neuroblastoma-derivato e sono ampiamente usate come un modello di cella appropriata per studi in vitro sulla neurotossicità o neuroprotezione12. La linea di cellule SH-SY5Y era sensibile alle condizioni di privazione del glucosio. Attuabilità delle cellule è diminuito di quasi il 50% dopo privazione del glucosio 1 h, che è la condizione di vitalità cellulare ottimale per gli studi di farmacodinamica. Inoltre, CCK-8 reagente non ha nessuna citotossicità alle cellule e le cellule sono state incubate con reagente di CCK-8 per un altro 4 h nelle condizioni di deprivazione di glucosio dopo il trattamento APPJ per controllare la vitalità cellulare. Nello studio corrente, forniamo un protocollo di trattamento dettagliato in vitro per quanto riguarda le applicazioni di neuroprotective di APPJ sulla lesione indotta da privazione del glucosio delle cellule SH-SY5Y.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi
Il tempo di incubazione di CCK-8 potrebbe essere più breve se ben significativamente modificato il colore in ciascuna. Ma se la densità delle cellule SH-SY5Y è inferiore a 1 x 104 cellule per pozzetto, cellule sarà morto dopo privazione del glucosio e trattamento APPJ. Si consiglia inoltre di ridurre il tasso di flusso di gas, garantendo nel contempo che il getto di plasma può toccare la superficie del terreno di coltura. APPJ potrebbe essere utilizzato anche come agente citoprotettivo per altre linee neuronali correlate (HT-22, neuro-2A o neuroni anche primari) con diverse disabilità (ipossia, stress ossidativo, ecc.), ma dovrebbero essere la coltura cellulare e condizioni di trattamento APPJ riadattato, e la dose di trattamento deve essere relativamente bassa. Abbiamo cercato di ridurre le distanze in questo parametro di generazione APPJ, e abbiamo trovato che il getto di plasma potrebbe influenzano direttamente il collegamento delle cellule SH-SY5Y che potrebbe provocare lesioni delle cellule (cellule SH-SY5Y sono facilmente staccate dal loro stato aderente). Noi crediamo che la distanza di trattamento dovrebbe essere basata sulle caratteristiche delle cellule e la tolleranza per il trattamento di getto plasma.
Limiti della tecnica
L'attuale protocollo concentrato solo sull'in vitro effetto neuroprotective di APPJ sulle cellule SH-SY5Y privazione-danneggiati di glucosio. Precedenti ricerche hanno dimostrato che l'inalazione di plasma potrebbe migliorare le funzioni cardiache in un modello di infarto del miocardio del ratto13. Più lavoro è ancora necessario per studiare il metodo di trattamento in vivo per la protezione del cervello.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti
Precedenti ricerche sulla medicina del plasma pagato più attenzione alle capacità di inattivazione di batteri, cellule tumorali e tessuti a causa dello stress ossidativo e/o nitrative indotto da APPJ trattamento14. Nostro protocollo utilizzato il trattamento al plasma della basso-dose per applicazioni di neuroprotective senza le conseguenze delle lesioni eccessive di plasma-indotta, che indica che il trattamento di APPJ potrebbero essere utilizzati come un romanzo "Nessun farmaco donatore" per la ricerca futura e anche per traduzione clinica.
Fasi critiche all'interno del protocollo
La fase più critica in questo protocollo è per assicurarsi che la dose di trattamento APPJ è relativamente bassa, dal trattamento con APPJ sarà aggravare lesioni delle cellule e indurre direttamente la morte delle cellule. Un altro passo fondamentale è quello di controllare la durata di privazione del glucosio o le cellule moriranno e l'effetto cytoprotective di APPJ sarà notevolmente ridotta. Elio puro, piuttosto che Elio mescolato con una piccola quantità di aria, o O2 è stato utilizzato. Quando mescolato con una piccola quantità di aria o O2 l'elio è utilizzato, si aumenterà la quantità di ROS nel plasma. È molto difficile fare una diagnosi quando si verificano reazioni chimiche al plasma complicati.
Applicazioni future
Vale anche la pena notare che il trattamento di APPJ è stato applicato dopo induzione della privazione del glucosio sulle cellule SH-SY5Y, che indica che APPJ potrebbero essere utilizzati come un metodo di trattamento per malattie connesse con privazione di glucosio nel sistema nervoso centrale, colpo soprattutto ischemico. Pertanto, è necessario per gli studi futuri valutare le condizioni di trattamento dell'effetto neuroprotective del APPJ sia da solo che in combinazione con altri agenti neuroprotettivi in diversi periodi dopo privazione del glucosio.
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Disclosures
Senza conflitti di interesse sono stati dichiarati in relazione a questa carta.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo per l'innovazione di Pechino neurochirurgica Istituto (2014-11), Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (nn. 11475019 e 81271286) e Beijing Natural Science Foundation (No. 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
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