Summary
Ein Protokoll für die neuroprotektive Anwendung von niedrig dosierten Atmosphärendruck Plasmabehandlung auf Glukose Entbehrung-induzierte SH-SY5Y Verletzungen.
Abstract
Der Atmosphärendruck Plasma Jet (APPJ) hat die Aufmerksamkeit vieler Forscher aus verschiedenen Disziplinen in den letzten Jahren angezogen, weil seine Emissionen mehrere Arten von reaktivem Stickstoff-Spezies (RNS) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS gehören). Unsere frühere Studie hat die zellschützenden Wirkung des APPJ gegen oxidativen Stress-induzierte Verletzungen gezeigt. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, eine detaillierte in-vitro- Behandlungsprotokoll betreffend die neuroprotektive Anwendungen von Helium APPJs auf Glukose Entzug verursachten Verletzungen in SH-SY5Y Zellen zur Verfügung zu stellen. SH-SY5Y menschlichen Neuroblastoma abgeleitet Zelllinie wurde RPMI 1640 Medium mit 15 % fetalen Kälberserum ergänzt gehalten. Das Kulturmedium änderte dann in RPMI 1640 ohne Glukose vor der APPJ Behandlung. Nach einer 1 h Inkubation in einer Zelle-Inkubator wurde Zellviabilität bestimmt mit Zelle zählen Kit 8. Die Ergebnisse zeigten, dass, ausgestellt im Vergleich zu Glukose Entbehrung Gruppe, Zellen mit APPJ behandelt deutlich erhöhte Zellviabilität in einer Dosis-abhängigen Weise mit 8 s/gut als eine optimale Dosis beobachtet. Unterdessen hatte Helium Flow keinen Einfluss auf die Glukose Entbehrung-induzierte Zelle Beeinträchtigung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass APPJ möglicherweise als eine Behandlungsmethode für die Krankheiten in das zentrale Nervensystem im Zusammenhang mit Glukose Entbehrung genutzt werden könnte. Dieses Protokoll könnte auch als zellschützenden Anwendung verwendet werden, für andere Zellen mit unterschiedlichen Beeinträchtigungen, aber die Zellkultur und APPJ Behandlungsbedingungen nachgestellt werden sollte und die Behandlungsdosis relativ niedrig sein.
Introduction
Die Erwachsene Gehirn verwendet fast ausschließlich Glukose als Substrat für den Energiestoffwechsel unter normalen physiologischen Bedingungen. Das menschliche Gehirn verbraucht ca. 25 % der gesamten Glucose innerhalb der Körper1aber stellt nur 2 % des Körpergewichts. Es ist gut dokumentiert, dass Glukose-Stoffwechsel-Dysfunktion ist eine der wichtigsten pathologischen Änderungen während ischämischen Schlaganfall und verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Chorea Huntington (HD) und der Parkinson-Krankheit (PD) 2,3. Der Mangel an Glukose und beeinträchtigt Glukoseaufnahme oder Oxidative Phosphorylierung kann einen direkten Einfluss auf ATP-Produktion und weitere induzieren neuronaler Zelltod, die das Risiko der neuronalen Dysfunktion, was darauf hindeutet, dass die Aufrechterhaltung Zellviabilität erhöhen kann oder Verzögerung der Zelle Verletzung nach Glukose Entbehrung ein vernünftiger Ansatz für die Behandlung dieser Krankheit sein könnte. Die Untersuchung der neuroprotektive Effekte über Glukose Modulation, mit Schwerpunkt auf Entzündungshemmern, Ionen-Kanal Modulatoren, Radikalenfänger, neurotrophen Faktoren wurde etc. von Interesse. Übersetzung dieser neuroprotektive Ansätze von Bank in die klinische Praxis wurde jedoch nicht erfolgreichen4.
Atmosphärendruck-Plasma-Jets (APPJs) sind eine neue Art von atmosphärischer Niedertemperatur-Gas-Entlastung-Technologie, die die Aufmerksamkeit vieler Forscher aus verschiedenen Disziplinen in den letzten Jahren angezogen hat. APPJs haben seit Jahrzehnten in verschiedenen biomedizinische Anwendungen wie Zelle Krebsbehandlung, bakterielle Inaktivierung, Blutgerinnung, Wundheilung, Zahnmedizin, etc.5,6, durch die Emissionen von mehreren Typen im Einsatz von reaktivem Stickstoff-Spezies (RNS) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) (Abbildung 1)7. Vorherigen Plasmaanwendungen Biomedizin konzentrierten sich hauptsächlich auf den oxidativen und/oder nitrative Druck auf Bakterien, Zellen und Gewebe8. Jedoch könnte das APPJ auch ein "zweischneidiges Schwert", da RNS und ROS wichtige intrazelluläre Signalmoleküle, die im Zusammenhang mit viele physiologische und pathophysiologische Prozesse9 sind. Stickoxid (NO) steuert eine Vielzahl von biologischen Prozessen und eine doppelte Rolle im menschlichen Körper, vor allem im zentralen Nervensystem (ZNS). Niedrige Konzentrationen von NO haben ihre neuroprotektive Aktivitäten gezeigt, beide in Vitro und in Vivo über mehrere Signalwege10. Unsere früheren Studie erstmals berichtet, dass Helium APPJ-induzierte NO-Produktion war die neuroprotektive Wirkung des APPJ gegen oxidativen Stress-induzierte Verletzungen11beteiligt. Allerdings wurden die Auswirkungen von APPJs auf andere Verletzungen nicht gemeldet. Das Ziel der vorliegenden Studie soll daher eine in-vitro- Behandlung-Protokoll betreffend die neuroprotektive Anwendungen von Helium APPJ auf Glukose Entzug verursachten Verletzungen in SH-SY5Y Zellen zur Verfügung zu stellen. Anders als bei früheren Studien, unser Protokoll verwendet niedrig dosierte Plasmabehandlung für neuroprotektive Anwendungen ohne die Folgen von übermäßigen Plasma-induzierte Verletzungen, darauf hinweist, dass die APPJ Behandlung potentiell als Roman "kein Spender Medikament verwendet werden könnten "für die zukünftige Forschung und auch für klinische Übersetzung." Dieses Protokoll wurde auch vorgeschlagen, um für andere Zelltypen mit verschiedenen Beeinträchtigungen als zellschützenden Anwendung verwendet werden, aber die Behandlungsbedingungen APPJ sollte neu eingestellt werden und die Behandlungsdosis relativ niedrig sein.
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Protocol
1. Vorbereitung des Geräts APPJ
Vorsicht: konsultieren Sie bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung der Experimente, einschließlich der Verwendung einer Dampfhaube und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Schutzhandschuhe, Laborkittel, etc.). Das Protokoll erfordert Standardzelle Umgang mit Techniken (Sterilisation, Zelle Erholung, Zelle Passagierung, Zelle Einfrieren, Zelle Färbung, etc.).
- Wählen Sie ein Quarzrohr mit einem Innendurchmesser von 1 mm und ein Außendurchmesser von 3 mm. glatt die Querschnitte an beiden Enden mit einer Politur Folie.
- Verwenden eine vernickelte Edelstahl-Nadel mit einem Durchmesser von 1,0 mm als die Hochspannungselektrode. Schleifen von der Spitze bis zu einem Radius der Krümmung von 0,05 mm.
- Wrap Aluminiumfolie (2 mm in der Breite) um das Quarzrohr 1 cm aus dem Quarzrohr Düse. Befestigen Sie die Nadelspitze aus rostfreiem Stahl 1 cm vom anderen Ende der Aluminiumfolie. Verwenden Sie die Alu-Folie-Ring als Niederspannung Elektrode.
2. Erwerb von Jets
- , ein AC-Signal liefern, schließen die Hochspannungs-Endstufe an der Funktionsgenerator Signal, das als Stromversorgung dient. Die Wellenformen der angelegten Spannung um die Hochspannungselektrode aufnehmen, schließen Sie ein Ende der Hochspannungs-Sonde, die digitales Oszilloskop und verbinden Sie das andere Ende an die Stromversorgung an. Um die Schaltung zu schützen, verwenden Sie eine 2 k Ω Widerstand als ein Schutzwiderstand. Die Schaltung zu verbinden, wie in Abbildung 2 gezeigt.
Vorsicht: Berühren Sie nicht die Hochspannungsleitungen. - Kontinuierlich die Quarzröhre Helium (99,999 % Volumenanteil) übergehen und Kontrolle der Gasvolumenstrom an einem stabilen 1.4 Standard Liter pro Minute (SLM).
Hinweis: Wir keinen Filter verwenden, vor der Behandlung von Zellkulturen. Der Volumenanteil der Helium verwendet im Experiment ist 99,999 %, und die meisten Mikroorganismen nicht unter diesen Bedingungen leben. - Schalten Sie das Oszilloskop Signalgenerator und Hochspannungs-Endstufe. Drehen Sie den Einstellknopf Frequenz bis 5 kHz. Erhöhen Sie die Spannung auf einen Spitze-Spitze-Wert von 6 kV.
Hinweis: Der Jet ist lang genug (ca. 3 cm) als die Spitze-Spitze-Wert der angelegten Spannung in der Nadel ist ca. 6 kV.
3. Vorbereitung der SH-SY5Y Zellen
- wachsen die SH-SY5Y menschlichen Neuroblastom abgeleitet Zellinie in einem 25 cm 2 Kolben RPMI 1640 Medium mit 15 % fetalen Kälberserum (FBS) ergänzt. Pflegen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO 2 % bis 95 % Luft bei 37 ° c
- Wenn die Zellen erreichen 85 % Zusammenfluss, sorgfältig Aspirieren der Nährmedien und fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin + 0,1 % EDTA zu den Zellen.
- Nach 15 s Inkubation bei Raumtemperatur, sorgfältig die Trypsin Aspirieren und 2 mL RPMI 1640 mit 15 % FBS neutralisieren.
- Sanft pipette rauf und runter, die Tiefe des Brunnens, waschen, bis das SH-SY5Y monomolekularen Film völlig losgelöst ist.
- Zählen die Zellen durch die Hemocytometer und passen Sie die Zellkonzentration bis 2 x 10 5 Zellen/mL durch Zugabe von RPMI 1640 mittlere + 15 % FBS und dann Transfer 100 µL Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Erlauben die Zellen für 12 h in einem Inkubator Zelle vor der APPJ Behandlung anhängen.
4. APPJ Behandlung von SH-SY5Y
- stellen Sie den Abstand zwischen der Düse des Quarz-Rohr und die Plattform, wo sich die 96-Well-Platte bis 3 cm platziert werden. sicherstellen, dass der Strahl des Kulturmediums berühren kann.
Hinweis: Der Abstand ist nicht von der Unterseite der Platte gemessen. Es richtet sich zunächst nach 3 cm zwischen der Düse das Quarzrohr und der Plattform verwendet, 96-Well-Platte zu platzieren. - Vor der APPJ Behandlung, ändern Sie das Kulturmedium in jedes gut außer die Kontroll-Vertiefungen in RPMI 1640 ohne Glukose Medium.
- Die Platte unter die APPJ Düse und sicherzustellen, dass die Jets vertikal in jedes gut schießen können.
- Leckerbissen Zellen in separaten Brunnen mit APPJ für 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s und 12 s.
Hinweis: APPJ wird erzeugt durch ionisierende Helium ( Abbildung 1). Die Zellen von Glukose Entbehrung verletzt werden behandelt mit 4 s und 8 s Helium Flow, die Auswirkungen von Helium auf Zellen zu beseitigen. Alle Behandlungen durchgeführt werden, in dreifacher Ausfertigung.
5. Handy-Lebensfähigkeit Assay
Hinweis: ändern Sie das Medium in diesem Schritt nicht.
- Nach der APPJ Behandlung, die Zellen 1 h in einer Zelle Inkubator inkubieren.
- Fügen Sie 10 µL der Zelle zählen Kit-8 (CCK-8) Lösung in jede Vertiefung.
- Brüten die Zellen bei 37 ° C für 4 Std.
Hinweis: Die SH-SY5Y-Zell-Linie ist empfindlich gegenüber Glukose Entbehrung Bedingungen 12. Zellviabilität verringert sich auf fast 50 % nach 1 h Glukose Entzug, was die optimale Zelle Lebensfähigkeit Voraussetzung für Pharmakodynamik Studien ist. CCK-8 hat keine Zytotoxizität auf Zellen und Zellen werden nach APPJ Behandlung Zellviabilität überprüfen mit CCK-8 Reagenz für eine weitere 4 h in der Glukose Entbehrung Bedingungen inkubiert. Nach 8 h Glukose Entbehrung und APPJ Behandlung wurde die schützende Wirkung des APPJ deutlich reduziert, weil die lange Dauer der Glukose Entbehrung zu schweren Schäden der SH-SY5Y Zellen geführt. Es gab keine Anzeichen von lebenden Zellen nach 24 h Glukose Entbehrung 11. - Messen die Extinktion bei 450 nm mit einem Lesegerät Mikrotestplatte.
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Representative Results
Daten sind als Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Resultate der Gruppe wurden für Varianz mit ANOVA analysiert. Alle Untersuchungen wurden durchgeführt mit der statistischen Analysesoftware Prisma und p < 0,05 wurde die Schwelle für die statistische Signifikanz.
Zellviabilität wurde nach 4 h der CCK-8 Inkubation gemessen. Wie in Abbildung 3dargestellt, Glukose Entzug reduziert die Lebensfähigkeit der SH-SY5Y Zellen auf 44,1 ± 2,6 % im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Zellen, die normalerweise in RPMI 1640 Medium mit 15 % kultiviert FBS). Die APPJ-Behandlung signifikant erhöhen Zellviabilität in einer Dosis-abhängigen Weise an eine optimale Dosis von 8 s/weit, und die Zellviabilität 62,27 ± 3,1 % erreicht. Gasstrom hatte keinen Einfluss auf die Glukose Entbehrung-induzierte Zelle Beeinträchtigung (Tabelle 1).
Abbildung 1: typische RNS und ROS Reaktionen APPJ Emissionen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische des experimentellen Aufbaus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: schützende Wirkung von APPJ auf Glukose Entbehrung-induzierte Schädigung der SH-SY5Y Zellen. Zellen wurden mit APPJ behandelt und Glukose-Entzug für 1 h, danach wurde die Zellviabilität anhand des CCK-8-Tests. Fehlerbalken darzustellen Mittelwert ± SD. *** P < 0,001 versus Kontrolle; #P < 0,05 und ##P < 0,01 gegenüber der Glukose-Entzug-Gruppe (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Gruppen | Zellviabilität (% der Kontrolle) | |||
| Kontrolle | 100 ± 3,7 % | |||
| Glukose-Entzug | 44.1 ± 2,6 % *** | |||
| APPJ Behandlung + Glukose Entbehrung | 1 s | 49,3 ± 2,8 % | ||
| 2 s | 53,0 ± 2,7 % | |||
| 4 s | 60,4 ± 2,3 %# | |||
| 8 s | 62,3 ± 3,1 %# | |||
| 12 s | 51,3 ± 2,7 % | |||
| He-Flow + Glukose Entbehrung | 4 s | 45,4 ± 2,4 % | ||
| 8 s | 44,1 ± 3,1 % | |||
Tabelle 1: prozentuale Rentabilität Daten von SH-SY5Y Zellen nach Glukose Entzug mit oder ohne Behandlung der APPJ. P < 0,001 versus Kontrolle; #P < 0,05 und ##P < 0,01 gegenüber der Glukose-Entzug-Gruppe (n = 3).
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Discussion
SH-SY5Y Zellen sind eine menschliche Neuroblastom abgeleitet Zell-Linie und sind weit verbreitet als entsprechende Zellenmodell für in-vitro- Studien zur Neurotoxizität oder Neuroprotektion12. Die SH-SY5Y-Zell-Linie war empfänglich für Glukose Entbehrung Bedingungen. Zellviabilität sank um fast 50 % nach 1 h Glukose Entzug, das die optimale Zelle Lebensfähigkeit Bedingung für Studien der Pharmakodynamik. Darüber hinaus CCK-8 Reagenz hat keine Zytotoxizität auf Zellen und Zellen inkubiert mit CCK-8 Reagenz für eine weitere 4 h in der Glukose Entbehrung Bedingungen nach APPJ Behandlung Zellviabilität zu überprüfen. In der aktuellen Studie bieten wir eine detaillierte in-vitro- Behandlungsprotokoll über die neuroprotektive Anwendungen des APPJ auf die Glukose Entbehrung-induzierte Schädigung der SH-SY5Y Zellen.
Modifikationen und Fehlerbehebung
Die Inkubationszeit der CCK-8 könnte kürzer, wenn die Farbe in jedem gut deutlich geändert. Aber wenn 1 x 10-4 -Zellen pro Bohrloch SH-SY5Y Zelldichte unterschreitet, werden Zellen tot nach Glukose Deprivation und APPJ Behandlung. Es wird auch empfohlen, reduzieren den Gasdurchsatz, gleichzeitig sicherzustellen, dass der Plasmastrahl das Kulturmedium berühren kann. APPJ könnte auch als zellschützenden Agent für andere neuronale Verwandte Zelllinien (HT-22, Neuro-2A oder auch primäre Neuronen) mit verschiedenen Beeinträchtigungen (Hypoxie, oxidativer Stress, etc.) verwendet werden sollten, aber die Zellkultur und APPJ Behandlungsbedingungen neu justiert, und die Behandlungsdosis relativ niedrig sein. Wir haben versucht, in diesem APPJ Generation Parameter Abstand zu verringern, und wir fanden, dass der Plasmastrahl direkt die Befestigung des SH-SY5Y Zellen beeinträchtigen könnten die Zelle Verletzungen führen könnte (SH-SY5Y Zellen wurden aus ihrem anhaftenden Zustand leicht abgenommen). Wir glauben, dass die Behandlung Entfernung auf die Eigenschaften der Zelle und die Toleranz gegenüber der Plasmastrahl Behandlung beruhen sollte.
Grenzen der Technik
Das aktuelle Protokoll konzentrierte sich nur auf die in-vitro- neuroprotektive Wirkung von APPJ auf Glukose Entbehrung verletzt SH-SY5Y Zellen. Bisherige Untersuchungen haben gezeigt, dass das Einatmen von Plasma Herzfunktionen in Ratte Myokardinfarkt Modell13verbessern könnte. Mehr Arbeit ist erforderlich, um die in Vivo Behandlungsmethode für den Schutz des Gehirns zu untersuchen.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
Frühere Untersuchungen auf Plasmamedizin Aufmerksamkeit mehr zur Inaktivierung Kapazitäten in Bakterien, Krebszellen und Geweben aufgrund der oxidativen und/oder nitrative Stress induziert durch APPJ Behandlung14. Unser Protokoll verwendet niedrig dosierte Plasmabehandlung für neuroprotektive Anwendungen ohne die Folgen der übermäßigen Plasma-induzierte Verletzungen, darauf hinweist, dass die APPJ Behandlung möglicherweise genutzt werden als Roman "Kein Spender Medikament" für die zukünftige Forschung und sogar für klinische Übersetzung.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist um sicherzustellen, dass die APPJ Behandlungsdosis ist relativ gering, da über die Behandlung mit APPJ Zelle Verletzungen verschlimmern werden und direkt Zelltod zu induzieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist, die Glukose Entzug Dauer zu kontrollieren oder die Zellen sterben und die zellschützenden Wirkung des APPJ deutlich reduziert werden. Reines Helium, wurde anstatt eine kleine Menge von O2 oder in der Luft, Helium beigemischt verwendet. Wenn Helium gemischt mit einer kleinen Menge von O2 oder Luft verwendet wird, erhöht die Menge an ROS im Plasma. Es ist sehr schwierig, eine Diagnose zu stellen, wenn komplizierte Plasma chemische Reaktionen auftreten.
Zukünftige Anwendungen
Es lohnt sich auch zu beachten, dass die APPJ-Behandlung angewendet wurde, nach Induktion der Glukose Entbehrung auf SH-SY5Y Zellen, darauf hinweist, dass APPJ möglicherweise als eine Behandlungsmethode für Glukose Mangel-Erkrankungen in das zentrale Nervensystem genutzt werden könnte, vor allem ischämischen Schlaganfall. Daher ist es notwendig für zukünftige Studien, die Behandlungsbedingungen der neuroprotektive Wirkung von APPJ sowohl allein als auch in Kombination mit anderen Mitteln neuroprotektive zu verschiedenen Zeiten nach Glukose-Entzug zu bewerten.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte wurden in Bezug auf dieses Papier erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Innovationsfonds der neurochirurgischen Beijing Institute (2014-11), der National Natural Science Foundation von China (Nr. 11475019 und 81271286) und Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7152027) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
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