Summary
פרוטוקול של יישום neuroprotective לחץ אטמוספירי במינון נמוך טיפול פלזמה על גלוקוז הנוצרות על-ידי מניעת פציעות SH-SY5Y.
Abstract
המטוס פלזמה הלחץ האטמוספרי (APPJ) משכה את תשומת לבם של חוקרים רבים מתחומים רבים בשנים האחרונות מכיוון את פליטות כוללות מספר סוגים של חנקן ונבדקים מינים (האחיות המוסמכות) ועוד מינים חמצן תגובתי (ROS). המחקר הקודם שלנו מראה את השפעת cytoprotective APPJ נגד פציעות מפגינות חמצוני. מטרת המחקר הנוכחי היא לספק נתונים היסטוריים במבחנה פרוטוקול הטיפול בנוגע ליישומים neuroprotective של הליום APPJs על גלוקוז הנוצרות על-ידי מניעת פגיעה בתאים SH-SY5Y. הקו התא האנושי נגזר נוירובלסטומה SH-SY5Y נשמר בינוני RPMI 1640 בתוספת 15% עגל עוברית סרום. המדיום תרבות ואז שונה RPMI 1640 ללא גלוקוז לפני הטיפול APPJ. לאחר דגירה 1 h בחממה התא, התא הכדאיות נקבע באמצעות תא סופר קיט 8. התוצאות הראו, לעומת הקבוצה מניעת גלוקוז, תאים שטופלו APPJ הציג הכדאיות תא ולעלייה משמעותית באופן תלוי מינון, עם 8 s/ובכן התבונן מן המינון האופטימלי. בינתיים, זרימה הליום לא היתה השפעה על ירידת ערך התא הנוצרות על-ידי מניעת גלוקוז. התוצאות שלנו הצביעו על כך APPJ שעלול לשמש כשיטת טיפול למחלות במערכת העצבים המרכזית הקשורות גלוקוז מניעת. פרוטוקול זה יכול לשמש גם יישום cytoprotective עבור תאים אחרים עם מגבלות שונות, אבל צריך להיות והשתלב את תרבית תאים והתנאים טיפול APPJ, מינון הטיפול חייב להיות נמוך יחסית.
Introduction
המוח למבוגרים משתמשת באופן כמעט בלעדי גלוקוז כמו מצע לחילוף חומרים של אנרגיה בתנאים פיזיולוגיים רגילים. המוח האנושי מהווה רק 2% ממשקל הגוף, אך צורכת כ- 25% של הגלוקוז הכולל בתוך הגוף1. זה מתועד היטב את תפקוד מטבוליזם הגלוקוז הוא אחד השינויים הפתולוגיים העיקריים במהלך שבץ איסכמי, מחלות ניווניות שונות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת הנטינגטון (HD) של מחלת פרקינסון (PD) 2,3. חוסר גלוקוז ספיגת הגלוקוז לקוי או זרחון חמצוני ניתן משפיע ישירות על ייצור ATP, נוסף לגרום מוות תאי העצבים, אשר עלולה להגביר את הסיכון של תפקוד עצביים, מציעה את הכדאיות בשמירה על התא או עיכוב תא פגיעה לאחר גלוקוז מניעת עשויה להיות גישה סבירה לטיפול במחלות אלה. החקירה של אפקטים neuroprotective באמצעות גלוקוז אפנון, התמקדות סוכנים אנטי דלקתיות, יון ערוץ מאפננים, לוכדי רדיקלים חופשיים, הגורמים neurotrophic, וכו היה מעניין. עם זאת, התרגום של גישות אלה neuroprotective מן הספסל הקלינית לא היה מוצלח4.
לחץ אטמוספירי פלזמה מטוסי (APPJs) הם סוג חדש של טכנולוגיה פריקה גז בטמפרטורה נמוכה עם אווירה אשר משכה את תשומת לבם של חוקרים רבים מתחומים רבים בשנים האחרונות. APPJs שימשו במשך עשרות שנים בתוך יישומים ביו שונים כגון טיפול תאי סרטן, איון חיידקי, קרישת דם, ריפוי הפצע, תרופה דרך הפה, ועוד5,6, בשל את פליטות סוגי מרובים של חנקן ונבדקים מינים (האחיות המוסמכות) ושל מינים חמצן תגובתי (ROS) (איור 1)7. יישומים ביו-רפואה פלזמה הקודם התמקד בעיקר לחץ חמצוני ו/או nitrative על חיידקים, תאים ורקמות8. עם זאת, APPJ יכול להיות גם "חרב פיפיות" מאז האחיות המוסמכות ואת ROS חשוב מולקולות איתות תאיים הקשורים pathophysiological תהליכים פיזיולוגיים רבים9. תחמוצת החנקן (NO) משחקת תפקיד כפול של גוף האדם, ובמיוחד מערכת העצבים המרכזית (CNS) ופקדי מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. רמות נמוכות של לא הראו פעילותם neuroprotective בשני במבחנה ויוו באמצעות אות מספר מסלולים10. המחקר הקודם שלנו דיווח ההליום APPJ-induced הייצור לא היה מעורב השפעת neuroprotective APPJ נגד פציעות מפגינות חמצוני11. עם זאת, השפעת APPJs על פציעה אחרת לא דווחו. לכן, מטרת המחקר הנוכחי היא לספק פרוטוקול טיפול במבחנה בנוגע ליישומים neuroprotective של הליום APPJ על גלוקוז הנוצרות על-ידי מניעת פגיעה בתאים SH-SY5Y. שונה ממחקרים קודמים, פרוטוקול שלנו בשימוש טיפול במינון נמוך פלזמה ליישומים neuroprotective ללא ההשלכות של פציעות מופרז פלזמה-induced, המציין כי הטיפול APPJ שעלול לשמש בתור רומן "לא תורם סמים "למחקר עתידי, אפילו לתרגום קליניים. פרוטוקול זה הוצעה גם לשמש יישום cytoprotective עבור סוגי תאים אחרים עם מגבלות שונות, אבל התנאים טיפול APPJ צריך להיות מותאם מחדש, מינון הטיפול חייב להיות נמוך יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של המכשיר APPJ
אזהרה: נא היוועץ כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. אנא השתמש נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע כל הניסויים, כולל השימוש של הוד fume וכן ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות מגן, חלוק המעבדה, וכו '). הפרוטוקול מחייב תא רגיל בטיפול טכניקות (לחיטוי, שחזור תא, passaging תא, תא הקפאה, תא מכתים, וכד').
- לבחור צינור קוורץ עם קוטר פנימי של 1 מ מ, של 3 מ מ. קוטר חיצוני חלקה של חתכים בשני הקצוות באמצעות נייר ליטוש של.
- להשתמש מחט מפלדת מ מ בקוטר של 1.0 מ מ האלקטרודה מתח גבוה. לטחון את קצהו ברדיוס עקמומיות של 0.05 מ. זרבובית
- גלישת רדיד אלומיניום (2 מ מ רוחב) סביב הצינור קוורץ-1 ס מ מהצינור קוורץ. לתקן את הנקודה מפלדת מחט ב 1 ס מ בקצה השני של האלומיניום. להשתמש את הטבעת רדיד אלומיניום האלקטרודה מתח נמוך-
2. רכישת מטוסי
- כדי לספק אות AC, להתחבר המגבר בעוצמה גבוהה מחולל אותות פונקציה המשמשת ספק כוח. כדי להקליט את ואת של מתח המופעל על האלקטרודה מתח גבוה, חבר קצה אחד של המכשיר מתח גבוה אוסצילוסקופ דיגיטלי וחבר את הקצה השני אספקת החשמל. כדי להגן על המעגל, להשתמש 2 k Ω resistor כמו הנגד מגן. חבר את המעגל, כמוצג באיור 2.
התראה: אל תיגע את קווי מתח גבוה- - עוברים הליום (שבר נפח, 99.999%) על הצינור קוורץ ברציפות ולשלוט את קצב זרימת גז יציבה ליטר 1.4 סטנדרטי לכל דקה (SLM).
הערה: אנחנו לא משתמשים מסנן לפני טיפול תרביות תאים. השבר נפח של הליום המשמשים את הניסוי הוא 99.999%, רוב המיקרואורגניזמים לא יכול לחיות בתנאים האלה. - להפעיל את הכוח של אוסצילוסקופ, מחולל אותות, מגבר בעוצמה גבוהה. סובב את כפתור לכוונון בתדר 5 קילו-הרץ. הארך בהדרגה את המתח לערך שיא אל שיא של 6 kV-
הערה: המטוס הוא מספיק זמן (כ 3 ס מ) כאשר ערך שיא אל שיא המתח ליישם את המחט הוא כ 6 kV-
3. הכנה של תאים SH-SY5Y
- לגדול SH-SY5Y התא האנושי נגזר נוירובלסטומה בשורה בקבוקון 2 25 ס מ ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 15% עגל עוברית סרום (FBS). לשמור על התאים חממה humidified המכילה 5% CO אוויר 2 ו- 95% ב- 37 מעלות צלזיוס.
- כאשר התאים להגיע למפגש 85%, בזהירות תשאף התקשורת תרבות ולהוסיף טריפסין 0.25% 1 מ"ל + 0.1% EDTA לתאים.
- 15 לאחר דגירה s בטמפרטורת החדר, האחות של טריפסין היטב ולהוסיף 2 mL 1640 RPMI המכיל 15% FBS לנטרל.
- בעדינות פיפטה למעלה ולמטה, שטיפת בתחתית הבאר, עד טפט SH-SY5Y מנותקת לגמרי.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים את הריכוז תא 2 x 10 5 תאים/מ ל... על-ידי הוספת RPMI 1640 בינוני +15% FBS ולאחר מכן העברת 100 µL תא השעיה על כל טוב של צלחת 96-ובכן.
- לאפשר את התאים לצרף עבור 12 ח ב חממה תא לפני הטיפול APPJ.
4. טיפול APPJ SH-SY5Y
- התאם המרחק בין הצינור של קוורץ צינור הפלטפורמה שבה יוצבו את הצלחת 96-ובכן עד 3 ס מ. על מנת להבטיח כי הקרן יכולה לגעת השטח של המדיום תרבות.
הערה: לא נמדד המרחק מחלקו התחתון של הצלחת. זה מכוון קודם 3 ס מ בין הצינור של הצינור קוורץ פלטפורמת משמשת להצבת 96-ובכן צלחת- - לפני הטיפול APPJ, שנה את תרבות בינוני היטב כל פרט הבארות שליטה RPMI 1640 ללא גלוקוז בינונית.
- למקם את הצלחת תחת הצינור APPJ ולהבטיח כי מטוסי יכול לירות אנכית לבאר כל. S
- לטיפול בתאים נפרדים בארות עם APPJ 0, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s ו- 12 ס
הערה: APPJ נוצר על ידי מייננת הליום ( איור 1). התאים שנפגעו גלוקוז מניעת מטופלים על ידי 4 s ו- s 8 הליום זרימה כדי לחסל את ההשפעות של הליום על תאים. כל הטיפולים יש לבצע שהפקידים.
5. תא Assay הכדאיות
הערה: לא לשנות את המדיום בשלב זה.
- לאחר הטיפול APPJ, דגירה את התאים עבור 1 ש ח בחודש חממה תא.
- להוסיף 10 µL תא סופר קיט-8 (CCK-8) לפתרון כל טוב.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 h.
הערה: קו תא SH-SY5Y הוא רגיש גלוקוז מניעת התנאים 12. תא הכדאיות מקטין לכמעט 50% לאחר מניעת גלוקוז 1 h, אשר התנאי הכדאיות תא אופטימום ללימודי pharmacodynamics. CCK-8 יש cytotoxicity אין תאים, התאים מודגרת עם ריאגנט CCK-8 במשך עוד 4 שעות בתנאי קיפוח גלוקוז לאחר טיפול APPJ כדי לבדוק את הכדאיות התא. לאחר 8 שעות גלוקוז מניעת וטיפול APPJ, ההשפעה המגנה של APPJ צומצם באופן משמעותי כי משך זמן של גלוקוז מניעת הוביל לפגיעה חמורה של התאים SH-SY5Y. לא היו ראיות של תאים חיים אחרי 24 שעות גלוקוז מניעת 11. - למדוד את ספיגת ב 450 nm עם קורא microplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתונים מבוטא זאת אומרת ± SD לפחות שלושה ניסויים עצמאית. קבוצת התוצאות נותחו עבור השונות באמצעות ANOVA. כל הבדיקות בוצעו באמצעות ניתוח סטטיסטי תוכנה פריזמה ו- p < 0.05 היה הסף מובהקות סטטיסטית.
תא הכדאיות נמדדה אחרי 4 שעות של דגירה CCK-8. כפי שמוצג באיור3, מניעת גלוקוז מופחתת הכדאיות של תאים SH-SY5Y ± 44.1 2.6% לעומת זו של קבוצת הביקורת (התאים בדרך כלל תרבותי RPMI 1640 בינוני המכיל 15% FBS). הטיפול APPJ גדל באופן משמעותי תא הכדאיות באופן תלוי מינון במינון האופטימלית של s 8/טוב, והגיע הכדאיות תא 62.27 ± 3.1%. זרימת גז לא היתה השפעה על גלוקוז בתא הנוצרות על-ידי מניעת ירידת ערך (טבלה 1).
איור 1: האחיות המוסמכות אופייני תגובות ROS פליטת APPJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סכימטי של ההתקנה ניסיוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ההשפעה המגנה של APPJ על גלוקוז הנוצרות על-ידי מניעת פגיעה בתאי SH-SY5Y. התאים היו מטופלים עם APPJ, נתון גלוקוז מניעת לשעה לאחר מכן נקבע את הכדאיות התא באמצעות וזמינותו CCK-8. קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± SD. * * * P < 0.001 לעומת שליטה; #P < 0.05 ו- ##P < 0.01 מול הקבוצה מניעת גלוקוז (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| קבוצות | תא הכדאיות (% שליטה) | |||
| שליטה | ± 100 3.7% | |||
| מניעת גלוקוז | 44.1 ± 2.6% * * * | |||
| טיפול APPJ + מניעת גלוקוז | 1 s | 49.3 ± 2.8% | ||
| 2 s | 53.0 ± 2.7% | |||
| 4 s | ± 60.4 2.3%# | |||
| 8 s | ± 62.3 3.1%# | |||
| 12 s | 51.3 ± 2.7% | |||
| הוא זרימה + מניעת גלוקוז | 4 s | 45.4 ± 2.4% | ||
| 8 s | 44.1 ± 3.1% | |||
טבלה 1: אחוז הכדאיות נתונים של SH-SY5Y תאים לאחר חוסר גלוקוז עם או בלי טיפול APPJ. P < 0.001 לעומת שליטה; #P < 0.05 ו- ##P < 0.01 מול הקבוצה מניעת גלוקוז (n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SH-SY5Y התאים הם קו תא אנושי נגזר נוירובלסטומה, נמצאים בשימוש נרחב כמודל תאים מתאים עבור מחקרים במבחנה על neurotoxicity או neuroprotection12. שורת התאים SH-SY5Y היה רגיש לתנאי מחסור גלוקוז. תא הכדאיות ירד כמעט 50% לאחר מניעת גלוקוז 1 h, אשר הוא מצב הכדאיות תא אופטימלית ללימודי pharmacodynamics. יתר על כן, ריאגנט CCK-8 יש cytotoxicity אין תאים, התאים היו מודגרות עם ריאגנט CCK-8 במשך עוד 4 שעות בתנאי קיפוח גלוקוז לאחר טיפול APPJ כדי לבדוק את הכדאיות התא. במחקר הנוכחי, אנו מספקים נתונים היסטוריים במבחנה פרוטוקול הטיפול בנוגע ליישומים neuroprotective של APPJ על הפגיעה הנוצרות על-ידי מניעת גלוקוז של תאים SH-SY5Y.
שינויים ופתרון בעיות
זמן הדגירה CCK-8 יכול להיות קצר יותר אם הצבע בכל טוב משמעותית משתנה. אך אם SH-SY5Y תא צפיפות מתחת עונה 1 פרק 10 תאים4 לכל טוב, התאים יהיו אחרי גלוקוז מניעת וטיפול APPJ. כמו כן מומלץ להקטין את קצב זרימת גז, תוך הבטחת כי קרן פלסמה יכול לגעת השטח של המדיום תרבות. APPJ יכול לשמש גם כסוכן cytoprotective אחרים שורות תאים עצביים הקשורים (HT-22, נוירו-2A או נוירונים העיקרי אפילו) עם מגבלות שונות (היפוקסיה, סטרס חמצוני, וכו '), אבל תרבית תאים והתנאים טיפול APPJ צריך להיות והשתלב, מינון הטיפול חייב להיות נמוך יחסית. ניסינו להפחית מהמרחק בפרמטר זה הדור APPJ, ומצאנו כי המטוס פלזמה ישפיע ישירות ההחזקה של תאים SH-SY5Y אשר עלולה לגרום פציעות תא (SH-SY5Y התאים היו בקלות מנותקת מדינתם חסיד). אנו מאמינים כי המרחק הטיפול צריך להיות מבוסס על המאפיינים תא וסובלנות לטיפול פלזמה סילון.
מגבלות של הטכניקה
בפרוטוקול הנוכחי התמקד רק במבחנה neuroprotective השפעת APPJ על גלוקוז נפגע-מניעת SH-SY5Y תאים. מחקר קודם הראה כי שאיפת פלזמה יכול לשפר תפקודי לב אוטם שריר הלב מודל של עכברוש13. עדיין נדרשת עוד עבודה כדי לחקור את שיטת הטיפול ויוו כדי להגן על המוח.
משמעות לגבי שיטות קיימות
מחקרים קודמים על פלזמה רפואה שילם יותר תשומת לב איון הקיבולות של חיידקים, תאי סרטן רקמות בגלל הלחץ חמצוני ו/או nitrative המושרה על ידי טיפול APPJ14. פרוטוקול שלנו בשימוש טיפול במינון נמוך פלזמה ליישומים neuroprotective ללא ההשלכות של פציעות מופרז פלזמה-induced, המציין כי הטיפול APPJ שעלול לשמש בתור רומן "סם לא תורם" למחקר עתידי, אפילו לתרגום קליניים.
שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול
השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא לוודא שמינון הטיפול APPJ הוא נמוך יחסית, מאז על הטיפול עם APPJ להחמיר פציעות תא ישירות לגרום מוות של תאים. עוד צעד קריטי כדי לקבוע את משך הזמן של מניעת גלוקוז או התאים ימותו, השפעת cytoprotective APPJ יקטן באופן משמעותי. הליום טהור, במקום הליום מעורבב עם כמות קטנה של O2 או באוויר, היה בשימוש. כאשר הליום מעורבב עם כמות קטנה של O2 או באוויר משמשת, תגדיל כמות ROS ב הפלזמה. . זה קשה מאוד לבצע אבחון כאשר פלזמה מסובך תגובות כימיות מתרחשות.
יישומים עתידיים
זה גם ראוי לציין כי הטיפול APPJ היה מוחל לאחר אינדוקציה של מניעת גלוקוז בתאים SH-SY5Y, המציין כי APPJ שעלול לשמש כשיטת טיפול גלוקוז הקשורות מניעת מחלות במערכת העצבים המרכזית, שבץ איסכמי במיוחד. לכן, זה הכרחי ללימודים בעתיד להעריך את תנאי הטיפול של השפעת neuroprotective APPJ גם לבד וגם בשילוב עם סוכנים אחרים neuroprotective בתקופות שונות לאחר חוסר גלוקוז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי עניינים הוכרזו ביחס הנייר הזה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן החדשנות של המכון נוירוכירורגיים בייג'ינג (2014-11), הלאומית למדע הטבע של סין (' קט ' 11475019 ו- 81271286) וקרן מדעי הטבע בייג'ינג (מספר 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
- Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
- Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
- Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339 (2015).
- Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005 (2012).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
- Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049 (2016).
- Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
- Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401 (2017).
- Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309 (2014).
- Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).
