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プラズマ医学 - セルを液体からスループット アプローチの基礎的研究

doi: 10.3791/56331 Published: November 17, 2017

Summary

液体や細胞の高スループット低温物理プラズマ治療プロトコルが表示されます。プラズマ治療後プラズマの発光スペクトルと液体、細胞の活動の後の分析を測定プラズマ点火のため異なるフィード ガス組成の設定が含まれます。

Abstract

プラズマ医学、脊椎動物のシステムに近い温度で電離気体は、細胞や組織に適用されます。コールド プラズマ活性種を生成する酸化還元に知られている健康および病気の生物学的プロセスを調整します。前臨床試験と臨床証拠皮膚の慢性潰瘍の治癒過程におけるプラズマ治療の有益な効果を指します。プラズマがん治療など、他の新たなトピックは、注目を受けています。プラズマ医学研究には、物理学、化学、生物医学の学際的な専門知識が必要です。プラズマ研究の 1 つの目標は、特定のアプリケーションのさまざまなプラズマ処理した細胞を特徴付けることです。これが含まれます、たとえば、細胞数には、生存率、細胞の酸化、ミトコンドリア活性、細胞毒性、細胞死、細胞周期解析のモード細胞表面マーカーの発現とサイトカインのリリース。本研究では、重要な機器とのようなプラズマ生物医学研究に必要なワークフローについて説明します。大気圧アルゴン プラズマ ジェット、具体的にその基本的な発光スペクトルの監視とフィードの反応種の出力を調節するためのガスの設定の適切な操作をについて説明します。最大再現性のマイクロ メートル精度の 96 ウェル プレートの空洞上ジェットを高精度 xyz テーブルとコンピューターのソフトウェアを使用して、ミリ秒単位の精度で置いた。液体酸化還元活性分子の分析の下流の試金を記載しており、標的細胞はプラズマ処理しました。異なる連続試金が、同じ細胞を用いた効率的なシーケンスでメラノーマ細胞を分析する具体的には、: カルレティキュリンの重要な分子の表面マーカー式、総面積代謝活性の測定、癌細胞の免疫原性細胞死。これらの試金は、一枚の板からプラズマ効果に関するコンテンツが豊富な生体情報を取得します。完全に、本研究では、不可欠なステップとプラズマ医学研究のためのプロトコルについて説明します。

Introduction

反応種異常治癒1および癌を含む疾患における重要な酸化還元監督では。2重要なは、これらの種は、病理としてその治療解決に携わっています。3,4低温物理プラズマは多くの種類の活性種を追放する電離ガスです。5体温度6で動作するいわゆるコールド プラズマの出現で、以来冷たいプラズマは細胞や熱害がなく組織に適用できます。証明する効力と前臨床試験と臨床観察のプラズマ装置の安全アプリケーション、3 はドイツにおける医療機器として認定を受けています。7遺伝毒性安全性に関しては特にいくつかの研究は最初のデバイスは、大気圧アルゴン プラズマ ジェットを用いた変異原性イベントの不在を示しています。8,9,10その他の 2 つのデバイスは、いわゆる誘電体バリア放電 (DBD) プラズマ ジェットよりも異なる原理で動作します。具体的には、ジェットはサーフェスとキャビティのメスのような治療の使用できますが、DBD プラズマが大きいが、むしろフラット組織領域の治療に効果的。11をシグナル伝達細胞のレドックスを利用した、手法の目的は、生体用の反応種のプラズマ生成を利用します。12臨床血漿療法の特に有望なアプリケーションは、創傷治癒のサポートです。13,14,15また、プラズマは動物モデルで抗癌効果があると示されました。16,17,18

動物モデル、また更に人間のプラズマ応用の安全性を検証する前にプラズマ装置で実施される生体外で研究ニーズを標準化しました。これらの実験は、プラズマ応用を探索して職場のメカニズムを記述するに不可欠です。また、基礎研究は反応種と後続の生物学的効果の組成の影響を理解する必要です。本研究はプラズマをよりよく理解し、細胞への影響を制御する生物医学的研究に統合する方法について説明します。それは、供給ガスの組成、活性種出力の監視、結果の化学的・生物学的成果とティッシュ、細胞、液体にプラズマの応用のチューニングについて説明します。さらに、例は、96 ウェル プレートで行うプラズマ医学研究を重視プラズマ処理と下流の生物学的アッセイの標準化に関する指示が提供されます。この方法には明確な利点: 私) 条件、試薬コスト、およびサンプルごとの実践的な時間ごとに必要な細胞数の最小化ii) 帳票の写しのトリートメントは、容易を設定できます、結果の精度の向上の手当および iii) 96-well プレート リーダー、イメージング、および流れの cytometry の実験でシームレスな下流試金の円滑化。

Protocol

1. プラズマ種のモニタリングと治療のセットアップ

  1. プラズマ種モニタリング
    1. 大気圧プラズマ ジェットを使用して、2 つの標準リットル/分最大フィード ガス放出量。
    2. プルームの軸に対して垂直な位置発光分光光度計、前にジェットとレコードの光電子分光と波長 (200-1,000 nm) を使用して専用ソフト。
    3. 0.5% 窒素または乾燥や加湿 (5%) の供給ガスに酸素を混ぜます。
    4. ガス条件ごとに発光分光分析を繰り返します。
    5. データのグラフィカルな表示のために適切なソフトウェアを分析します。
  2. プラズマ治療セットアップ
    1. コンピューター駆動 xyz テーブルにジェットを修正します。
    2. 井戸の位置を特定し、各ウェルの中心の上、適切な治療時間で、テーブルに参加しているジェットを移動するコンピューターのスクリプトを生成します。
    3. 10 を追加4完全な細胞培養液を 100 μ l 添加で哺乳類の付着性のセルの任意の型 (10 %fcs、2% グルタミン 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと RPMI1640) いくつかの井戸層流フードの下に。
    4. 37 ° c 5% 二酸化炭素と加湿雰囲気で一晩で発生する細胞接着を許可します。
    5. 20 のプラズマ細胞を扱う 250 μ m 間隔でさまざまな高さ (z 軸) で s。
    6. 各ウェルに細胞培養液にヨウ化 propidium の 25 μ L を追加します。
    7. フィードによる細胞の壊死を誘発しない特定の高さを決定するために、顕微鏡下で細胞ガスわきの細胞の上に培養液を押すイメージ。
      注: 処理時間が長くなるためマイクロリットル doubledistilled を再確立に必要な水の量を識別するためにプラズマ治療前後プレートを秤量することによりプラズマとモードをオフにこの特定の高さで液体の蒸発を識別します。扱われた井戸で浸透圧の恒常性。
    8. それぞれの治療時間で xyz テーブルの最終議定書の準備 (ここで: 20 s、40 s、60 s プラズマ、60 s ガス制御) の位置をよくし、後続の試金の準備ができてマルチ チャンネル ピペットや 96 ウェルのプレートの液体ハンドリングの貯水池があります。

2. 反応性プラズマ処理による液体主成分の分析

  1. プラズマ処理による過酸化水素の分析
    1. フラット底 96 ウェル プレートで 3 通でリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) プラズマの 100 μ L を扱います。
    2. 10 西洋ワサビペルオキシダーゼの U に 100 μ L の PBS と過酸化水素検出試薬の 5 μ M をロードすることによってマスター ミックスを調製 (1 つの十分なまあ; それに応じてスケール アップ)。
    3. マスター ミックスの 95 μ L を各ウェルに追加します。
      注: 前の手順実行すべきクリーン ベンチの下かプラズマ源のそれと別の部屋で、大気中のオゾンは、アッセイの感度を減らすことができます。
    4. 別板でトップ濃度 100 μ L の PBS 100 μ M の PBS における過酸化水素の 2 倍希釈系列を準備します。
    5. 検出試薬の井戸にサンプルまたは過酸化水素基準の 5 μ L を追加します。
    6. 井戸、読み出し後背景差分のみ検出試薬を含むが含まれます。
    7. 室温で 15 分間暗闇の中板を孵化させなさい。
    8. Λex 535 nm、λem 590 nm で蛍光を測定するマイクロ プレート リーダーにプレートを配置します。
      注: 高い過酸化物濃度、サンプルの場合は、サンプル希釈を増加する必要があります。 またはアッセイの飽和を避けるために短い培養時間朗読をされる必要があります。
    9. すべてのサンプルからの空白の値を引く、過酸化物の標準曲線を計算してその基準曲線から未知のサンプルの過酸化物濃度を定量化します。
  2. プラズマ処理による亜硝酸イオンの分析
    1. 底が平らな 96well プレートの 3 通でプラズマに 100 μ L の PBS を扱います。
    2. 水 doubledistilled の 99 μ L に 1 μ L の定量試薬を追加して亜硝酸検出ソリューションのマスター ミックスを調製 (1 つの十分なまあ; それに応じてスケール アップ)。
    3. 明確な底が平らな 96well プレートに 100 μ L/ウェルを追加します。井戸の数に応じてスケール アップ。
    4. Doubledistilled 水の亜硝酸標準希釈系列を準備します。
    5. 96well 板のマスターの組合せに標準またはサンプルの 10 μ L を追加します。
    6. 室温で 10 分間暗闇の中板を孵化させなさい。
    7. 各ウェルに亜硝酸定量化開発者ソリューションの 5 μ L を追加します。
    8. マイクロ プレート リーダー λex 365 nm、λem 450 nm の蛍光を読み取る。
    9. すべてのサンプルからの空白の値を引く、亜硝酸の標準曲線を計算してその基準曲線から未知のサンプル亜硝酸濃度を定量化します。
  3. プラズマ処理によるスーパーオキシドの分析
    1. 酸化型シトクロム (1 mg/mL) のマスター ミックスを作るとカタラーゼ (20 μ g/mL) PBS。
    2. 明確な平底の 96 ウェル プレートの井戸にマスター ミックスの 100 μ L を追加します。
    3. 処理条件あたり 3 通でプラズマを用いたマスター ミックスを扱います。
    4. 550 で吸光度を読み nm; マイクロ プレート リーダーを使用してこのデータをグラフ化します。
    5. ウェル内でシトクロム C のモル吸光係数と液体の光路長を使用して生成された活性酸素の量を計算します。

3. プラズマ細胞の生物学的応答

  1. プラズマ処理による細胞の多次元読み出し: 代謝活性
    1. 次の手順のすべての層流フードを使用します。
    2. シード 104細胞 (マウス B16 メラノーマ) 100 μ L は完全にフラット下 96-ウェル プレートのウェルあたりの細胞培養液を補った。
    3. 37 ° c 5% 二酸化炭素とインキュベーターの加湿雰囲気で一晩細胞接着を許可します。
    4. Xyz テーブルを使用して、プラズマまたは定義済みスキームに従って単独でガス井を治療し、20 h のためのインキュベーターにセルを追加します。
      注: 必要な場合後を取る清 20 h 細胞製品を分析するにはその後新鮮な媒体の 100 μ L を追加します。
    5. 各ウェルに 500 μ M レサズリン (最終濃度 100 μ M) を含む細胞培養液中の 25 μ L を追加します。レサズリン培背景差分の細胞なしで単独でを含む 3 つの井戸を準備します。
    6. 3 h、インキュベーターで孵化させなさい。
    7. Λex 535 nm とマイクロ プレート リーダーで λem 590 nm の蛍光を読み取る。
    8. すべてのサンプルからのバック グラウンド蛍光を減算し、コントロール値をデータを正規化します。
  2. プラズマ処理による細胞の多次元読み出し: 画像解析
    1. 3.1.7 からウェル プレートを使用し、上澄みを廃棄します。
    2. 1 μ G/ml propidium ヨウ化物イオンを含む新鮮な細胞培養液 100 μ L を追加します。
    3. 画像の各ウェルに電動ステージと顕微鏡下で板を置きます。
      注: 画像の詳細によって異なります実験の質問;ここでは、20 × 対物高コンテンツ イメージング デバイスで明るいフィールド チャネル、ディジタル位相コントラスト チャネル、および適切な励起光と発光を利用した蛍光 (propidium ヨウ) チャネルの各ウェルに 3 × 3 の視野を読み取るために使用されました。フィルター。
    4. ディジタル位相コントラスト画像ビューのすべてのフィールドの合計のゾル性細胞質領域を決定する使用定量画像解析ソフトウェアを各ウェルのイメージ。
      注: 分析、さらなるパラメーター、例えば、実行可能なおよび/または死んだ細胞や専用の汚れを使用してミトコンドリアの活動の数を必要な場合です。この仕事で述べられるより、その他の汚れを使用して、顕微鏡用蛍光汚れスペクトルと重複しない螢後続流フローサイトメトリー実験で使用していることを確認します。
    5. データをグラフ化、必要な場合は代謝活動で得られた値と相関をテストします。
  3. プラズマ処理による細胞の多次元読み出し: フローサイトメトリー
    1. この分析のステップ 3.2.5 からウェル プレートを使用します。
    2. 上澄みを廃棄し、200 μ L のカルシウムとマグネシウムを含む PBS で 2 回洗う (0.9 mM と 0.5 mM、それぞれ)。
      注: 修正および/またはさらに生物学的読み出しのこの貢献は、細胞内の抗原または細胞周期解析の染色などで取り上げられていないためこの段階でセルを permeabilize します。
    3. 各ウェルにカルシウムとマグネシウムが 50 ng/mL 抗マウス カルレティキュリン モノクローナル抗体を含む 50 μ L の PBS を追加します。
    4. インキュベーターで 15 分間インキュベートします。
    5. 200 μ L で 2 回洗浄は完全に細胞培養培地を添加し、プレート内の液体を破棄します。
    6. 各ウェルに細胞剥離液 100 μ L を追加し、インキュベーターで 20 分間インキュベートします。
    7. 流れフローサイトメトリーによる獲得プロトコルは、戦略と利益と受光素子の電圧をゲートに無染色の B16 細胞懸濁液中の別のセットを使用します。
    8. 96 ウェルのプレートの自動サンプラー搭載フローサイトにプレートをロードします。
    9. フォワードの 1000 個の細胞および実行可能なセルに通常関連付けられている側散布人口の最小値を取得します。
    10. フローサイトメトリー、興味の人口をゲートに .fcs ファイルの解析のための専用のソフトウェアを使用し、カルレティキュリンの平均蛍光強度を決定します。
    11. グラフ データ、必要な場合は代謝活動、イメージング、および/または酸化蒸着法で得られた値と相関をテストします。

Representative Results

本研究では、プラズマの効果に医学研究のため合理化されたワークフローを述べた。活用する学際的なアプローチは、プラズマ ジェット、液体の主な反応性コンポーネントの基本的な発光プロファイルを分析し、プラズマ (図 1) 処理した細胞の生物学的反応。

このワークフローを実施するには、部品数はプラズマ ソース (図 2) を正しく設定する必要でした。異なるガス (ここで主にアルゴンや酸素や窒素) に供給され、いくつかの質量流量コント ローラーによって制御されます。中央のパネルは、あらかじめ決められたフィード フラックスにマスフロー コント ローラーをデジタル調整に使用されました。ガスは特定フィード ガス組成を生成するため、いくつかマスフロー コント ローラー (図 2A) からガスを組み合わせたバルブのパネルを利用したを物理的に混合しました。プラズマ ソースをつけとプラズマの排水は、USB-分光光度計 (図 2B) 200 の光学範囲で前面に設置された 1,000 nm nm。液体や細胞の治療のため効率的なワークフローは、96 ウェルのプレートを使用して記述されました。ウェルの料理は、その刻印の穴 (図 2C) に一致する挿入とベース プレートに固定されたプラスチック フレームを使ってその場で開催されました。全体のセットアップは、層流フード (図 2D) 下に置かれました。このセットアップには、xyz テーブル プラズマ ジェットの手持ち部分はマウントされているにはが含まれています。後者が十分な大きさのケーブル ポートからおよび xyz テーブル、ベンチ外モータ制御要素を配置できます。重要なは、表はコンピューター制御された、ジェット マイクロメータ精度の各ウェルのセンターを合わせる時間の必要な量のするようにプログラムすることができます。さらに、(我々 のセットアップでは、よく A1) のように開始位置は、(図 2E) を自由に選ばれました。プラスチック プレート ホルダーと共にこれは液体および生物学的実験のセットアップに関連するだけどの日常的なパターンと再現可能なプラズマ処理の許可。

発光分光 (OES) は、異なるフィード ガス条件 (図 3A) で反応性プラズマ コンポーネントにリンクされている明確なピークに使用されました。330 からピークを持つ窒素の 2 番目の肯定的なシステムなど、nm 〜 380 nm 表される活性窒素種 309 nm 表されるヒドロキシラジカル (図 3Aの矢印) でピーク。アルゴン ガスだけを比べると、窒素種の存在は酸素や湿度の減少かそれぞれ低下したかに対し供給ガスに窒素の混合物と増加。対照的に、水酸基の存在は酸素や窒素の減少しますが、加湿アルゴン供給ガスとして使用していた場合に著明に増加しました。液体のプラズマ治療、アルゴンのガスやアルゴン プラズマによる蒸発を求めた最初 (図 3B)。重要なは、プラズマも温度で効果を発揮するので、両方の条件によって同様の結果は出なかった。ヒドロキシラジカルの OES 結果に沿って過酸化水素沈着は大幅減少酸素または窒素の混合したが、加湿供給ガス (図 3C) で増加します。さらに、供給ガスに窒素の添加は、アルゴン プラズマ処理による液体 (図の 3D) と比較して亜硝酸濃度が高かったにつながった。このワークフローは、組成の異なる液体プラズマの影響を調査するも採用があります。たとえば、過酸化水素濃度は、PBS と RPMI1640 細胞培養液 (図 3E) の牛胎児血清の存在の独立したように見えた。同じサンプルでは、血清の存在は、PBS と細胞培養培地の血清非含む対応 (図 3F) と比較して亜硝酸濃度を減少しました。ほとんどの活性酸素は、著しく焼入れ加湿酸素-アルゴン プラズマ (図 3G) 以外の活性酸素生成酸素または窒素の混和材料を用いた乾燥アルゴン ガス条件で生産されました。

ウェルの料理の細胞のプラズマ治療のためプレート含む細胞播種前日にインキュベーターから除去し、プラスチック製のホルダーに追加。プログラムされた治療パターンが適用された、蒸発が補償、20 h. 注、このインキュベーション後細胞培養上清が新しい、空の 96 ウェル プレートに収集され格納されている-のためのインキュベーターに置かれたプレート興味の蛋白質の評価のための 80 ° C。次に、各ウェルの細胞にレサズリンが追加されました。蛍光らに非蛍光レサズリンの売り上げ高は NADPH 生成活性の酵素によって促進されただけと全体的な代謝活動 (図 4A) と相関していた。蛍光強度はプレートの視覚認知に類似していた、長期プラズマ治療 (図 4B) の細胞毒性を示します。加湿ガス条件だった乾燥ガス条件よりも有害。さらに下流アッセイ用プレートの同じセル活かされています。プレートの細胞が顕微鏡 (図 4C) を検討しました。イメージング ソフトウェアを使用して、プレートのいくつかの井戸の定性的な比較 (図 4D) を調べた.総面積の数量が各ウェルに買収視野内のセルで覆われて、それぞれコントロール (図 4E) に正規化された結果のデータを許可するソフトウェア。加湿供給ガス条件で特に、血漿の治療で合計のセル領域の減少を見た。イメージング後、細胞洗浄、カルレティキュリン抗マウス抗体で染色、戸建、, フローサイトメトリー (図 4F) による分析.蛍光カルレティキュリン生菌 (図 4G) の染色強度算出し、(図 4H) のサンプル間比較を意味します。プラズマ処理は、カルレティキュリン乾燥ガス条件で適用されるプラズマ処理時間に相当するマウス メラノーマ細胞表面での発現を誘発しました。加湿供給ガス条件、20 の s と 40 s 治療の誘発より致命的な 60 秒の処理時間と比較して強いカルレティキュリン露出。これは、セルに導入された酸化剤の量に関してカルレティキュリン露出の非線型規制があった示唆しています。

Figure 1
図 1: プラズマ物理学から生物学医学研究のワークフロー 。大気圧アルゴン プラズマ ジェットの反応種の出力は、供給ガスを調節することによって調整されます。分光法を用いたプラズマ気相選択した分子が監視されます。プラズマは、液体を扱うし、酸化沈着を調査に使用されます。マイクロ プレートで培養した細胞がプラズマ処理や生物学的読み出しが行われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: プラズマ研究ベンチのセットアップ。(A) ガス ステンレス パイプは、中央のパネルを介して制御されるいくつかの質量流量コント ローラーに駆動されます。個別供給ガスの組成は、その後バルブのパネルを使用してミックスされます。(B) 様々 な供給ガス組成の違いを調査する発光分光法を用いたプラズマの一部の反応性コンポーネントを監視できます。(C) 高速プラズマ研究、96 ウェル マイクロ プレートを使用します。プログラマブル ・自動化されたプラズマ治療の出発点の定数を確保するため、プレートは、プレートの絶対位置を同じ日を保証するフレームに追加されます。(D) プラズマ ジェットは xyz-テーブルのコンピューター制御の層流フードの下で位置に固定されています。すべての 96 の正確な場所とそれぞれの上プラズマの滞留時間もプラズマ源の動きをガイドするプログラム ファイルに書き込まれます。モーターの制御と同様、プラズマ ジェット装置の主な住宅が近くにあります。(E) 96 ウェル プレートのプラズマ処理を自動化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: プラズマ ジェットと液体分析します。(A) 異なるフィード ガス条件の発光分光が表示されます。窒素の 2 番目の肯定的なシステム (330 nm 380 から nm) 欠席混和剤酸素、窒素の混合と増加され加湿アルゴン (左側パネル) と著しく減少しています。309 でヒドロキシラジカルのピーク nm (矢印) は窒素と酸素の条件で減少したが、加湿アルゴン アルゴン ガスだけと比較して著しく増加します。(B) ガス液体の露出は蒸発をもたらします。プラズマとアルゴン ガス単独での治療に 96well プレートのウェルあたりの蒸発量はだった罰金のスケールを使用して治療の前後にプレートの重さによって決まります。Plasmatreated サンプルの蒸発アルゴン gastreated サンプルにすると高くなって。(C) (A) の水酸基の 309 nm ピークとある程度相関 plasmatreated 液体における過酸化水素の生成。加湿 (5%) アルゴン プラズマは、過酸化物濃度約 4fold を増加しました。(D) 亜硝酸は、供給ガスに窒素を追加しました、この効果は、加湿のアルゴン プラズマとともに増加したときに上昇した.酸素添加減少亜硝酸生成が大幅。(E, F)水素過酸化物と亜硝酸濃度は異なる種類の液体、すなわち RPMI1640 培 (R10F) と、「(R0F) なし PBS 牛胎児血清 (FCS) と同様。血清の存在下で亜硝酸濃度が有意に減少したに対し、過酸化水素レベルは異なるメディア (E) 間差はなかった。(G) スーパーオキ サイド産生だった最も高い乾燥アルゴンのガス供給ガス加湿アルゴンや酸素、窒素の混合は、液体の低活性酸素析出を与えた。(B G) を示すデータは、平均 + 2、3 の実験の SEM です。統計解析実行 (C D) は、それぞれのコントロールに対して供給ガスの乾燥や湿気の多い条件的にグループ全体を比較する一方向の分散分析を使用していた (* * p < 0.01; * * * p < 0.001)。また、アルゴン ガス専用のプラズマ条件は、グループ全体の平均値と t 検定を用いて比較した (### p < 0.001)。さらに統計分析 (F) を t テストそれぞれのプラズマ処理と FCS と FCS のサンプルの中の条件の値を比較することを使用して行った (* p < 0.05; * * p < 0.01);また、FCS や FCS 非含有溶液を t 検定を用いて各プラズマ治療時間内で比較した (# p < 0.05; # p < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: プラズマ治療と細胞への影響。(A) 細胞がプラズマにさらされ、レサズリンが代謝活性を評価するために 20 h 後に追加されました。(B) 活動 plasmatreated 試料ガスのコントロールと比較して有意に減少しました。酸素や窒素の添加は両方の乾燥・湿潤のアルゴン ガス条件で毒性につながるに対し、供給ガスの加湿とマーク付きの減少が見られました。(C) 培 propidium ヨウ化 (PI) を追加しました。(D) 概要は、死んだ細胞を識別する (緑) ディジタル位相コントラスト (オレンジ) 各セルと PI の細胞質画分を表すプレートの井戸の表示されます。イメージング ツールは、セルで覆われてもそれぞれ視界にある総面積の定量化を許可しました。(F) 細胞その後洗浄され抗体またはフローサイトメトリーを使用して生物学的プラズマ効果を特徴付ける他のセル マーカーと孵化させます。(G) ゲーティング戦略が採用され、マーカー解析は実行され、サンプル間比較します。(B, E, H) を示すデータを示す平均 + SEM の 1 つの代表を 3 つの独立実験の。スケール バー = 200 μ m (D)。ガス条件ごとにそれぞれのガス制御にそれぞれのプラズマ処理を比較して、差異 (B、H) の双方向の解析に基づく統計的比較を行った (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001)。さらに、窒素や酸素の混和材料の各状態の値がドライのアルゴン プラズマの値と比較し、別々 に湿気のある条件 (双方向による差異; ### p < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

基礎研究は、有効性および前臨床・臨床研究におけるプラズマ医学を支えるメカニズムの理解を開発するための基本です。基礎的研究はまた、治療のための新しいアプリケーションの調査を促進します。それはプラズマが活性酸素および窒素種19の世代を介して自分の生物学的作用を仲介する確立は、間まだフィールドに 3 つの主要な課題があります。まず、どの種が重要ですこれは部分的光学診断と生物学的読み出しプラズマの供給ガスの組成を調節することによって答えることができます。20第二に、どのような効果に見られる細胞などの生物学的ターゲットか。これは少なくとも部分的に、細胞培養実験と数の試金を使用して扱われます。真核細胞の効果はサポートと同様、多面含む細胞周期停止21、アポトーシス22、壊死23、および皮膚細胞刺激24,25,26, または細胞の減少運動や代謝活動27,28,29。これらの多面的効果に関わる、三度目の挑戦は、異なる種類の細胞でよく見かけるさまざまな効果を説明するためのオキシダントの血漿由来細胞の応答を決定する重要分子を識別するためにです。これを行うことができますをおよび/またはオミックス技術30,31,32またはターゲット遺伝子の siRNA (レドックス) 信号の変調と同様、阻害剤、抗酸化物質、抗酸化酵素を使用してのプラズマの反応種出力。33,34,35したがって、合理化された試金のプロトコルは多数のイテレーションの大きいサンプル セットをテストするが必要です。

本研究は、前述の課題に関してプラズマ医学研究のための生物物理学からの効率的な実験的ワークフローを例証します。プラズマ源とプラズマ生成の工学側面の詳細については、前に記載されています。36,37,38これらの試金のすべては利点の数を持っている 96well プレートで実行されます。例えば、細胞培養上清などのサンプル コレクション板、たとえば、酵素結合抗体法によるタンパク質濃度を調査するために、簡単に分析から実行できます。96 ウェルから直接読み取ることが科学的な装置を使用できる場合このようなアプローチはサンプルと handsontime あたりのコストを最小限に抑え、同じサンプルから別の試金を多重化して結果を最大化します。マルチ チャネルの使用のピペットさらにサンプル処理を高速化。原則としてここで説明アッセイも行なえます大きい井戸径ウェル プレート フォーマットを使用して他の管と下流の試金のための船に分注の追加の手順が必要だろうこれも。ただし、小さいプレート 384well プレートなどにはジオメトリ生体プラズマ研究ジェットを用いた大規模な供給ガスのフラックスに適したはありません。具体的には、1 つだけが隣接していない井戸は、治療中に影響を受ける保証できません。

液体分析は、プラズマによる成膜種を調べることが不可欠です。専門家の分析で異なるアッセイの並列可能な段取りは、同時に異なる酸化物質に関して plasmatreated 液体を特徴付けることができます。この多重化するには、plasmaderived 種の区別された映像を開発することができます。記述されているアプローチは、必要がない常にプラズマ効果を説明するのに十分でよくある過酸化水素濃度39の調査に非常に敏感です。40,41,42生物学的関連のある効果も評価できます液体のグルタチオンの試金は含まないと。43特定亜硝酸の試金は 10fold の高いアッセイ感度 (データは示されていない) のための従来グリースを試金を強く推奨します。Plasmatreated 液体は、DTNB アッセイを用いた次亜塩素酸の形成を調べることができます。まだ、以前の結果は、当社のプラズマ源とその種の形成を示しませんでした。19,39,44プラズマ処理が完了した後種劣化起こる時間をかけて。亜硝酸が硝酸; に反応します。また、過酸化物は、時間の経過とともに消費されます。しかし、これらのプロセスはいくつかの時間を取る。35シトクロム c の吸収は安定して数時間もかけて。したがって、治療後最初の 30 分以内のプロセスが発生した場合、ここで説明した長命種の濃度変化は無視されます.1 h (データは示されていない) 内の 90% の過酸化を清掃できる成分として特定タイプのメディア (例えば、ダルベッコ変更イーグル培地) を調査するときに心配が取られなければならないただし、プラズマに過酸化物法の過小評価につながる液体。

マルチプレックス アッセイは、細胞表面マーカー発現にセル領域 (形態) に代謝活動を調査することからの範囲が提示されます。これらのアッセイの組み合わせは、興味深い結果を明らかにするかもしれない。たとえば、我々 は以前に THP1 単球で、代謝活性と細胞数はプラズマへの露出に続く直線的に低下はしません。45ではなく、プラズマ処理時間の増加とともに細胞が観察されたは、サイズが増加したし、percell 的に代謝率が高いにつながる、高いミトコンドリア質量を持っていた。基本的に、フローサイトメトリー、顕微鏡、マルチ プレート リーダーの組み合わせは、プラズマ処理、次の細胞に情報を多重送信します。メラノーマ細胞で我々 はここで細胞毒性とカルレティキュリンを介したその免疫原性に焦点を当てます。46は、原則として他の多くの質問はイメージングと流れの cytometry 結果と代謝活性をリンクこの方法で対処できます。たとえばに細胞の分化 (例えばマクロファージ偏波)、ミトコンドリアの膜電位、細胞周期解析、細胞運動、バイオメカニクス、または遺伝毒性の解析の小核形成はで調査するもプラズマ処理による細胞。フローサイトメトリー マルチ カラーは、同時に異なる細胞集団でさらに多くのアプリケーションのことができます。これは、たとえば、シグナル伝達転写因子 mRNA の定量、細胞内サイトカインの測定および/または単一セルのレベルの合計の減少チオールの評価などタンパク質のリン酸化状態の解析を含まれます。それぞれのサンプルに使用される生物学的に関連する追加の情報は、現在および将来のプラズマ応用を理解するプラズマ酸化還元効果の画像の更なる発展に役立ちます。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

ドイツ連邦教育省研究から資金 (BMBF 許可番号 03Z22DN11 と 03Z22DN12) は感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 

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References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11, (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3, (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45, (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82, (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4, (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11, (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18, (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19, (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59, (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29, (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29, (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167, (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7, (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8, (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3, (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40, (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12, (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3, (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112, (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49, (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3, (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38, (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26, (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3, (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13, (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1, (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25, (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47, (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46, (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13, (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49, (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48, (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100, (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6, (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3, (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10, (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13, (1), 54-61 (2007).
プラズマ医学 - セルを液体からスループット アプローチの基礎的研究
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Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).More

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).

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