Summary
Høy gjennomstrømming kaldt fysiske plasma behandling protokollen væske og celler vises. Det innebærer å sette opp forskjellige feed gass komposisjoner for plasma tenning, måling plasma's utslipp spectra, og påfølgende analyse av væsker og cellular aktivitet etter plasma behandling.
Abstract
I plasma medisin, er ionisert gass med temperatur nær som virveldyr systemer brukt på celler og vev. Kalde plasmas generere reaktive arter kjent for redoks regulere biologiske prosesser i helse og sykdom. Prekliniske og kliniske bevis peker til gunstige effekter av plasma behandling i helbredelse av kroniske sår på huden. Andre nye emner, som plasma kreftbehandling, får stadig oppmerksomhet. Plasma medisinsk forskning krever tverrfaglig kompetanse innen fysikk, kjemi og biomedisin. Ett mål av plasma forskning er å karakterisere plasma-behandlet celler i en rekke spesifikke applikasjoner. Dette omfatter for eksempel celletall og levedyktighet, cellulære oksidasjon, mitokondrie aktivitet, cytotoksisitet og modus for celledød, celle syklus analyse, cellen overflaten markør uttrykket og cytokin utgivelsen. Denne studien beskriver det nødvendige utstyret og arbeidsflyter kreves for slik forskning i plasma biomedisin. Den beskriver riktig drift av en atmosfærisk trykk argon plasma jet, spesielt overvåke sine grunnleggende utslipp spectra og feed gass for å modulere reaktive arter utgang. Bruker en høy presisjon xyz-bord og programvare, er jet svevde i millisekund presisjon over i hulrom i 96-brønnen plater i mikrometer presisjon for maksimal reproduserbarhet. Nedstrøms analyser for flytende analyse av redoks-aktiv molekyler vises målcellene er plasma-behandlet. Spesielt melanom celler blir analysert i en effektiv sekvens av ulike påfølgende analyser men bruker de samme cellene: måling av metabolsk aktivitet, total-celle området og overflate markør uttrykk for calreticulin, et molekyl som er viktig for den immunogenic celledød av kreftceller. Disse analyser hente innholdsrike biologiske informasjon om plasma effekter fra en enkelt plate. Helt, denne studien beskriver de grunnleggende trinnene og protokoller for plasma medisinsk forskning.
Introduction
Reaktiv arter er viktig redoks regulatorer i sykdom, inkludert unormal sårheling1 og kreft. 2 viktigere, disse artene er involvert i patologi samt terapeutiske oppløsningen. 3 , 4 kalde fysiske plasma er en ionisert gass som utvisning reaktive arter av mange slag. 5 siden advent av såkalte kaldt plasmas som opererer på kropp temperatur6, kaldt plasmas kan bli brukt på celler og vev uten termisk skade. Ved å demonstrere effekt og trygg bruk av plasma enheter i prekliniske og kliniske observasjoner, fått tre akkreditering som medisinsk utstyr i Tyskland. 7 spesielt med tanke på gentoksisk sikkerhet, flere studier har vist at mutagene hendelser ved hjelp av enheten med en atmosfærisk trykk argon plasma jet. 8 , 9 , 10 andre to enheter er såkalte dielektrisk barriere utslipp (DBD), som opererer via en annen prinsipp enn plasma jet. Jets tillate spesielt skalpell-lignende behandling av overflater og hulrom mens DBD plasmas er effektiv i behandling av større, men ganske flat vev områder. Utnytte mobilnettet redoks signalering11, er målet med teknikken å utnytte plasma-generert reaktive arter for biomedisinsk programmer. 12 en særlig lovende anvendelse av klinisk plasma terapi er støtte fra sårtilheling. 13 , 14 , 15 videre plasma ble vist å ha anticancer effekter i dyremodeller. 16 , 17 , 18
Før validering effekt og sikkerhet av plasma programmer i dyremodeller eller aften human, standardisert i vitro oppslagsbehov utføres med plasma-enheter. Disse eksperimentene er avgjørende å utforske plasma programmer og avgrense mekanismer på jobben. Videre er grunnleggende forskning nødvendig for å forstå virkningen av sammensetningen av reaktive arter og påfølgende biologiske effekter. Denne studien viser hvordan plasma kan integreres i biomedisinsk forskning å forstå og kontrollere dens virkning på celler. Den beskriver tuning feed gass komposisjon, overvåking av reaktive arter, programmer plasma væsker, celler og vev og resulterende kjemiske og biologiske resultatene. Videre nedenfor eksemplene som instruerer på standardisering av plasma behandling og nedstrøms biologiske metoder, med hovedvekt på plasma medisinsk forskning gjort i 96-brønnen plater. Denne tilnærmingen har forskjellige fordeler: jeg) minimering av antall celler nødvendig per betingelse, reagens kostnader og hands-on tid per prøve; II) godtgjørelse av større nøyaktighet resultater som to og tre eksemplarer behandlinger kan defineres med letthet; og iii) tilrettelegging av sømløs nedstrøms assaying i 96-brønnen format plate leseren, bildebehandling og flyt cytometri eksperimenter.
Protocol
1. plasma arter overvåking og behandlingen oppsett
-
Plasma arter overvåking
- Bruke en atmosfærisk trykk plasma jet og maksimalt to standard liter per minutt feed gass flux.
- Vinkelrett på skyen aksen, plasser jet foran en optisk utslipp spektrofotometer, og registrere photoemission og bølgelengde (200-1000 nm) bruker dedikert programvare.
- Bland 0,5% av nitrogen eller oksygen til tørr eller fuktet (5%) feed gass.
- Gjenta optisk utslipp spektroskopi for hver gass tilstand.
- Analysere med programvare passer for grafisk fremstilling av dataene.
-
Plasma behandlingen oppsett
- Fastsette jet til en datamaskin-drevet xyz-tabell.
- Identifisere plasseringen av brønnene og generere et datamaskiner for å flytte jet sluttet i tabellen, med riktig behandlingstider, over midten av hver brønn.
- Legge 104 type tilhenger pattedyrceller i 100 µL av komplett celle kultur medium (RPMI1640 med 10% FCS, 2% glutamin og 1% penicillin/streptomycin) i flere brønner under laminær strømning hette.
- Tillate mobilnettet vedheft skje over natten på 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% karbondioksid.
- Behandle cellene med plasma for 20 s ved ulike høyder (z-akse) med 250 µm intervaller.
- Legg til 25 µL av propidium iodide i celle kultur medium i hver brønn.
- Bilde cellene under mikroskop for å bestemme spesifikke høyden som ikke brekning celle nekrose på grunn av fôret gass presser kultur medium øverst i celler til side.
Merk: For lengre behandlingstider, identifisere flytende fordampning på denne bestemt høyde, i plasma, slått av og ved veiing platen før og etter plasma behandling å identifisere hvor mange microliters doubledistilled vann nødvendig å gjenopprette osmotisk homeostase i behandlet brønnene. - Forberede en endelig protokoll xyz-tabellen med respektive behandlingstider (her: 20 s, 40 s, 60 s plasma og 60 s gass kontroll) og vel posisjoner, og har klar flerkanals Pipetter og reservoarer for flytende håndtering av 96-brønns plater i påfølgende analyser.
2. analyse av reaktive hovedkomponentene i Plasma-behandlet væsker
-
Analyse av Plasma-behandlet hydrogenperoksid
- Behandle 100 µL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) med plasma i tre eksemplarer i flat bunn 96-brønns plater.
- Forberede en master blanding av lasting 100 µL av PBS med 10 U av pepperrotperoksidase og 5 µM av Hydrogenperoksid oppdagelsen reagensen (tilstrekkelig for en vel, skalere opp tilsvarende).
- Legge til 95 µL av master mix i hver brønn.
Merk: Forrige trinn skal utføres i et rom som er atskilt fra at av plasma eller under en ren benk som luften ozon kan redusere følsomheten til analysen. - I en separat plate, Forbered en todelt fortynning rekke Hydrogenperoksid i PBS med en topp konsentrasjon av 100 µM i 100 µL PBS.
- Legge til 5 µL av prøver eller hydrogenperoksid standarder brønner som inneholder gjenkjenning reagensen.
- Inkluder brønner som inneholder gjenkjenning reagens bare for bakgrunnen subtraksjon etter den lese-out.
- Inkuber platen i mørket i 15 min ved romtemperatur.
- Plass platen i microplate leseren måle fluorescens λex 535 nm og λem 590 nm.
Merk: Hvis høye peroxide konsentrasjoner er ventet i prøvene, prøve fortynning må økes eller avlesninger må gjøres med kortere inkubasjon tid å unngå metning til analysen. - Trekke fra tomme verdier fra alle prøver, beregne peroxide standardkurven og kvantifisere ukjent eksempel peroxide konsentrasjoner fra det opprinnelige kurven.
-
Analyse av Plasma-behandlet nitritt
- Behandle 100 µL av PBS med plasma i tre eksemplarer i flatbottom 96well plater.
- Forberede en master blanding av nitritt oppdagelsen løsning ved å legge til 1 µL av kvantifisering reagensen 99 µL av doubledistilled vann (tilstrekkelig for en vel, skalere opp tilsvarende).
- Legg 100 µL per brønn til en klar, flatbottom 96well plate. Skalere opp etter behov for antall brønner.
- Forberede en fortynning rekke nitritt standarder i doubledistilled vann.
- Legge 10 µL av standarder eller prøver til master mix i 96well plater.
- Inkuber platen i mørket 10 min ved romtemperatur.
- Legge til 5 µL nitritt kvantifisering utvikler løsning i hver brønn.
- Les fluorescens i en microplate leser λex 365 nm og λem 450 nm.
- Trekke fra tomme verdier fra alle prøver, beregne nitritt standardkurven og kvantifisere ukjent eksempel nitritt konsentrasjoner fra det opprinnelige kurven.
-
Analyse av Plasma-behandlet Superoxide
- Gjøre en master blanding av oksidert cytochrome (1 mg/mL) og catalase (20 µg/mL) i PBS.
- Legg 100 µL av master mix fordelt av en klar, flat bunn 96-brønns plate.
- Behandle master mix med plasma i tre eksemplarer per behandling betingelse.
- Lese absorbans ved 550 nm likner en microplate; vise disse dataene.
- Beregne mengden superoxide generert ved hjelp av molar utryddelse koeffisient cytochrome C og hvor lett bane væske i en brønn.
3. biologisk respons celleområde utsatt for Plasma
-
Flerdimensjonale avlesing av Plasma-behandlet celler: metabolsk aktivitet
- Bruk laminær strømning hette for alle av følgende fremgangsmåter.
- Frø 104 celler (B16 murine melanom) i 100 µL supplert fullt celle kultur medium per brønn i flat bunn 96-brønns plater.
- Tillate mobilnettet vedheft natten på 37 ° C i inkubator med 5% karbondioksid fuktet atmosfære.
- Bruker xyz-tabellen, behandle brønner med plasma eller gass alene i henhold til et forhåndsdefinert oppsett, og legge cellene tilbake i inkubator 20 h.
Merk: Hvis du vil, ta av supernatants etter 20 h å analysere ekstracellulære produkter; legge til 100 µL av fersk medium etterpå. - Hver brønn, legge til 25 µL av celle kultur medium som inneholder 500 µM resazurin (siste konsentrasjon 100 µM); forberede tre brønner som inneholder resazurin alene i celle kultur medium uten celler for bakgrunnen subtraksjon.
- Inkuber for 3t i inkubator.
- Les fluorescens λex 535 nm og λem 590 nm i en microplate-leser.
- Trekke fra bakgrunnen fluorescens fra alle prøvene, og normalisere data kontrollverdier.
-
Flerdimensjonale avlesing av Plasma-behandlet celler: bildeanalyse
- Bruke godt platen fra 3.1.7 og kast nedbryting.
- Legg 100 µL av fersk celle kultur medium som inneholder 1 µg/mL propidium iodide.
- La platen under et mikroskop med en motorisert scene å image hver brønn.
Merk: Bildebehandling detaljer avhenger det eksperimentelle spørsmålet; her, ble en 20 X mål brukt i en høyt innhold bildeenheten lese 3 x 3 synsfelt i hver brønn i en lysende felt kanal, digital fase kontrast kanal og fluorescens (propidium iodide) kanal, passende eksitasjon lys og utslipp filtre. - Bruk kvantitativ analyseprogramvare å bestemme det totale cytosolic området i digital fase kontrast bilder av alle synsfelt avbildes i hver brønn.
Merk: Analysere videre parametere hvis ønskelig, for eksempel antall levedyktige og/eller døde celler eller mitokondrie aktivitet ved hjelp av dedikert flekker. Hvis bruker andre flekker enn beskrevet i dette arbeidet, kontroller at fluorescens flekker brukes til mikroskopi ikke spectrally overlapper med fluorochromes brukes i påfølgende flyt cytometri eksperimenter. - Graf dataene, og eventuelt test sammenheng med verdiene hentes for metabolsk aktivitet.
-
Flerdimensjonale avlesing av Plasma-behandlet celler: Flow cytometri
- For denne analysen, kan du bruke godt platen fra trinn 3.2.5.
- Forkaste nedbryting og vaske to ganger med 200 µL av PBS inneholder kalsium og magnesium (0,9 mM og 0,5 mM, henholdsvis).
Merk: Fikse og/eller permeabilize celler i denne fasen for ytterligere biologiske readouts ikke dekkes i denne bidrag, som flekker av intracellulær antigen eller cellen syklus analyse. - I hver brønn, legger du til 50 µL av PBS med kalsium og magnesium som inneholder 50 ng/mL anti-musen calreticulin monoklonale antistoffer.
- Inkuber i 15 min i inkubator.
- Vask to ganger med 200 µL av fullt supplert celle kultur medium og kast væsken i platen.
- Legg 100 µL av cellen avdeling løsning i hver brønn, og ruge for 20 min i inkubator.
- Bruke et annet sett med unstained kvinne B16 celler i suspensjon sette flyt cytometric oppkjøpet protokollen, gating strategi, og gevinster og spenninger til photodetectors.
- Legg platen i en flyt cytometer utstyrt med en automatisk sampler 96-brønns plater.
- Få minst 1000 celler i Videresend og siden scatter befolkningen vanligvis forbundet med levedyktige cellers.
- Bruk programvare plikttro for analyse av flowcytometri, .fcs filer til gate befolkningen av interesse, og bestemme mener fluorescens intensiteten av calreticulin.
- Grafisk data, og eventuelt test sammenheng med verdiene hentes for metabolsk aktivitet, imaging eller oksiderende deponering.
Representative Results
I denne studien var en strømlinjeformet arbeidsflyt beskrevet for medisinsk forskning på virkningene av plasma. Den tverrfaglige tilnærmingen benyttes her analyserer grunnleggende optisk utslipp profilen til plasma jet, reaktive hovedkomponentene i væsken, og de biologiske responser cellene behandlet med plasma (figur 1).
For å gjennomføre denne arbeidsflyten, var en rekke komponenter nødvendig for å riktig konfigurert plasma kilde (figur 2). Gassene (her hovedsakelig argon, oksygen og nitrogen) ble levert til og kontrolleres av flere masse flow-kontrollere. En sentral panel ble brukt digitalt justere massen flyt kontrollerne til forhåndsbestemt feed gass flukser. For å gi spesifikke feed gass komposisjoner, ble gassene fysisk blandet utnytte et panel av ventiler som kombinert gasser fra flere masse flow-kontrollere (figur 2A). Plasma kilden ble slått på, og plasma avløpsvann ble satt foran et USB-spektrofotometer (figur 2B) med en optisk rekke 200 nm til 1000 nm. For behandling av væske og celler, ble en effektiv arbeidsflyt beskrevet med 96-brønns plater. Flere godt retter ble holdt på plass med en plast ramme som var fast på bunnplate innsettinger tilpasset trykt hullene (figur 2C). Hele oppsettet ble satt under laminær strømning hette (figur 2D). Dette oppsettet inkludert en xyz-tabell som håndholdt stykke plasma jet var montert. Motorstyring elementene kan plasseres utenfor benken, hvis sistnevnte har tilstrekkelig store kabel-porter fra og til xyz-tabellen. Viktigere, bordet var datastyrt og kan programmeres til å sveve jet over midten av hver brønn med mikrometer presisjon for ønsket mengde tid. Videre var startposisjonen (som vår oppsett, godt A1) fritt valgt (figur 2E). Sammen med plast plate holderen tillatt dette for en reproduserbar plasma behandling med alle daglige variasjoner utelukkende knyttet til oppsettet av flytende og biologiske eksperimenter.
Optisk utslipp spektroskopi (OES) ble brukt til å følge forskjellige topper knyttet til reaktive plasma komponenter i forskjellige feed gass forhold (Figur 3A). For eksempel den andre positive systemet av nitrogen topper fra 330 nm 380 nm representert reaktivt nitrogen arter, og en topp på 309 nm representert hydroksylradikaler (pil i Figur 3A). Sammenlignet med argongass alene, tilstedeværelsen av nitrogen arter økt med en blanding av nitrogen i feed gassen, mens tillegg av oksygen eller fuktighet redusert eller reduseres, henholdsvis. Derimot ble tilstedeværelsen av hydroksylradikaler redusert med oksygen eller nitrogen men markert økt hvis fuktet argon ble brukt som fôr gass. Plasma behandling av væsker, fordampning førte argongass og argon plasma ble bestemt første (Figur 3B). Betydelig, gi begge betingelsene ikke lignende resultater fordi plasma utøver også effekter på temperaturen. I tråd med OES resultatene av hydroksylradikaler, hydrogenperoksid deponering betydelig redusert med oksygen eller nitrogen blanding men økt med fuktet feed gass (Figur 3C). Videre tillegg av nitrogen feed gassen førte til betydelig høyere nitritt konsentrasjoner sammenlignet med argon plasma-behandlet væsker (Figur 3D). Denne arbeidsflyten kan også benyttes til å undersøke virkningen av plasma på væsker med forskjellige komposisjoner. For eksempel syntes hydrogenperoksid konsentrasjoner å være uavhengig av tilstedeværelse av fetal kalv serum i PBS og RPMI1640 celle kultur medium (Figur 3E). I samme utvalgene redusert tilstedeværelsen av serum nitritt konsentrasjoner i PBS og celle kultur medium forhold til sine ikke-serum inneholder kolleger (Figur 3F). De fleste superoxide ble produsert i tørr argon gass forhold med oksygen og/eller nitrogen tilsetningsstoffer betydelig slukke superoxide generasjon, unntatt fuktet argon oksygen plasma (Figur 3G).
Plasma behandling av celler i flere godt retter, platen inneholder celler seeded dagen før ble fjernet fra inkubator og lagt til plast holderen. En programmert behandling mønster ble brukt fordampning ble kompensert for og platen ble plassert tilbake i inkubator for 20 h. oppmerksom på at etter denne inkubasjon celle kultur supernatants kunne har vært samlet inn en ny, tom 96-brønns plate og lagret på- 80 ° C for vurdering av proteiner av interesse. Deretter ble resazurin lagt til celler i hver brønn. Omsetning av ikke-fluorescerende resazurin å fluorescerende resorufin var bare tilrettelagt av aktive NADPH-generering enzymer og var korrelert med samlede metabolsk aktivitet (Figur 4A). Fluorescens intensiteter var lik den visuelle oppfatningen av platen, og markert cytotoksiske effekten av langvarig plasma behandling (Figur 4B). Fuktet gass forholdene var mer skadelig enn tørrgass forhold. De samme cellene i platen ble benyttet for ytterligere nedstrøms analyser. Celler i platen ble mikroskopisk undersøkt (Figur 4C). Bruke bilderedigeringsprogrammer, ble flere brønner av platen undersøkt for kvalitativ sammenligning (Figur 4D). Programvare tillatt kvantifiseringen området dekket av celler i synsfelt som i hver brønn og resultatdataene var normalisert til respektive kontroller (Figur 4E). En reduksjon av totale celle området ble sett i behandling plasmaprøver, spesielt med fuktet feed gass betingelsene. Etter bildebehandling, var cellene vasket, beiset med anti-musen calreticulin antistoffer, frittliggende og analysert med flowcytometri (Figur 4F). Mener fluorescens intensiteter av calreticulin farging i levedyktige cellers (Figur 4G) var beregnes og sammenlignes mellom eksempler (Figur 4H). Plasma behandling indusert en oppregulering av calreticulin på murine melanom celleoverflaten, noe som tilsvarte plasma behandling tid brukt med feed tørrgass forhold. For fuktet feed gass forhold, 20 s og 40 s behandling indusert en sterkere calreticulin eksponering forhold til de mer dødelige 60 s behandling tid. Dette tyder på det var en ikke-lineær regulering av calreticulin eksponering med hensyn til pengebeløpet oksidanter introdusert til cellene.
Figur 1 : Arbeidsflyt plasma medisinsk forskning fra fysikk til biologi. Reaktiv arter utdataene for lufttrykk argon plasma jet er innstilt ved modulerende feed gassen. Utvalgte molekyler i gassform plasma overvåkes ved hjelp av spektroskopi. Plasma brukes til å behandle væsker og undersøke oksiderende deponering. Cellene kultivert i microplates plasma-behandlet, og biologiske readouts utføres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Oppsett av plasma forskning benken. (A) gasser i rustfritt stål rør drives i flere masse flow-kontrollere som styres via en sentral panel. Individuelle feed gass sammensetningen er blandet etterpå ved hjelp av et panel av ventiler. (B) noen av plasma reaktive komponentene kan overvåkes ved hjelp av optisk utslipp spektroskopi undersøke forskjellene mellom ulike feed gass komposisjoner. (C) For høy gjennomstrømming plasma forskning, 96-brønnen microplates brukes. For å sikre en konstant utgangspunkt for programmerbare og automatisert plasma behandling, er platen lagt pynteborder garanterer samme absolutt posisjon av plater fra dag til dag. (D) plasma jet er festet til en datastyrt xyz tabell ligger under laminær strømning hette. Alle 96 presis plassering og holdetiden verre over hver er godt skrevet i en programfil å lede bevegelsen av plasma kilden. Hovedhuset plasma jet apparatet samt motor kontrollene ligger i nærheten. (E) automatisert plasma behandling av en 96-brønns plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Plasma jet og væske analyse. (A) optisk utslipp spektroskopi av forskjellige feed gass vises. Den andre positive systemet av nitrogen (330 nm-380 nm) ble økt med blanding av nitrogen, fraværende i oksygen blanding, og markert redusert med fuktet argon (venstre panel). Toppen av hydroksylradikaler på 309 nm (pil) redusert i nitrogen og oksygen men markert økt med fuktet argon sammenlignet med argongass alene. (B) gass eksponering av væsker fører til fordampning. Mengden av fordampning per brønn i en 96well plate på behandling med plasma og argon gass alene ble bestemt av veier platen før og etter behandling med en fin skala. Fordampning i plasmatreated prøver var høyere sammenlignet i argon gastreated prøver. (C) generasjon av Hydrogenperoksid i plasmatreated væsker korrelert til dels med 309 nm toppen av hydroksylradikaler i (A). Fuktet (5%) argon plasma økt peroxide konsentrasjoner om 4fold. (D) nitritt ble hevet når nitrogen ble lagt til feed gassen, og denne effekten ble økt med fuktet argon plasma. Tillegg av oksygen redusert nitritt generasjon men ikke vesentlig. (E, F) Hydrogen peroxide og nitritt konsentrasjoner vises i ulike væsker, nemlig RPMI1640 celle kultur medium med (R10F) og uten (R0F) samt PBS med og uten fosterets kalv serum (FCS). Peroxide nivåer skiller ikke mellom ulike medier (E) mens nitritt nivåer ble betydelig redusert i nærvær av serum. (G) Superoxide produksjon var høyest for tørr argongass feed gass; blanding av nitrogen, oksygen eller fuktet argon ga lavere superoxide avsettelse i væsken. Dataene (B-G) er det bety + SEM to til tre eksperimenter. Statistisk analyse var utført (C, D) bruker veis variansanalyse sammenligne hele gruppen middel for tørr eller fuktig feed gass forholdene mot respektive kontrollen (** p < 0.01; *** p < 0,001). I tillegg argon gass-bare plasma betingelser ble sammenlignet med hele gruppen mener og t-test (### p < 0,001). Videre statistisk analyse (F) ble utført ved å bruke t-tester sammenligner verdiene for hver plasma behandling og middels tilstand i prøvene med FCS og uten FCS (* p < 0,05; ** p < 0,01); også FCS eller ikke-FCS som inneholder løsninger ble sammenlignet innen hver plasma behandling tid ved hjelp av t-test (# p < 0,05; ## p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Plasma behandling og dens innvirkning på celler. (A) celler ble utsatt for plasma og resazurin ble lagt etter 20 h å vurdere metabolsk aktivitet. (B) aktivitet ble betydelig redusert i plasmatreated prøver i forhold til gass kontroller. En markant nedgang ble sett luftfukting feed gassen mens tillegg av oksygen og/eller nitrogen fører til toksisitet i begge tørr og fuktig argon gass betingelsene. (C) Medium som inneholder propidium iodide (PI) ble lagt til. (D) en oversikt vises av av platen med digitale fase kontrast (oransje) representerer cytosolic brøkdel av hver celle og PI (grønn) å identifisere døde celler. Bildebehandling verktøy tillatt kvantifisere området innenfor synsfelt av hver godt dekket med celler. (F) celler ble deretter vasket og inkubert med antistoffer eller andre cellen markører som karakteriserer biologiske plasma effekter ved hjelp av flowcytometri. (G) Gating strategier ble ansatt og markør analyse var utført og forhold mellom eksempler. Dataene (B, E, H) betegne den betyr + SEM av en representant for tre uavhengige eksperimenter. Skala bar = 200 µm (D). Statistisk sammenligning ble utført toveis analyse av avvik (B, H) sammenligne, for hver gass tilstand, hver plasma behandling respektive gass kontrollen (* p < 0,05; ** p < 0.01; *** p < 0,001). I tillegg verdiene for hver tilstand av nitrogen og/eller oksygen tilsetningsstoffer ble sammenlignet med verdier argon gass plasma for tørr og fuktig betingelser separat (toveis analyse av variansen; ### p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Grunnleggende forskning er grunnleggende for å utvikle en forståelse av virkningen av og mekanismer underbygger plasma medisin i preklinisk og klinisk forskning. Grunnforskning fremmer også etterforskningen av nye programmer for behandlinger. Mens det er godt etablert at plasmas megle deres biologiske effekter via generasjon reaktive oksygen og nitrogen arter19, er det fortsatt tre viktigste utfordringer til feltet. Først hvilke arter er viktig? Dette kan delvis besvares ved modulerende feed gass sammensetningen av plasmas med optisk diagnostikk og biologiske readouts. 20 andre, hvilke effekter kan sees i biologiske mål som celler? Dette er minst delvis løst med cellekulturer eksperimenter og en rekke analyser. I eukaryote celler, effekter er pleiotropic inkludert celle syklus arrestasjon21, apoptose22, nekrose23, og huden celle stimulering24,25,26, samt en støtte eller reduksjon av cellen motilitet eller metabolsk aktivitet27,28,29. Tredje utfordringen knyttet til disse pleiotropic effekter, er å identifisere viktige molekyler som bestemmer cellulær respons på plasma-avledet oksidanter å forklare ulike effekter ofte sett i forskjellige celletyper. Dette kan gjøres av Omika teknikker30,31,32 og/eller opp eller downregulation av målet gener bruker siRNA (redoks) signalering hemmere, antioksidanter og antioksidant enzymer, samt modulering av den plasma er reaktiv arter utgang. 33 , 34 , 35 derfor strømlinjeformet analysen protokoller er nødvendig å teste større Prøvesett med store antall gjentakelser.
Denne studien eksemplifiserer en effektiv eksperimentelle arbeidsflyt, fra fysikk til biologi, for plasma medisinsk forskning med hensyn til nevnte utfordringene. Detaljer om de tekniske aspektene ved plasma kilden og plasma generasjon har blitt beskrevet før. 36 , 37 , 38 alle disse analyser utføres i 96well plater, som har en rekke fordeler. For eksempel kan utvalgene for eksempel celle kultur supernatants enkelt transporteres fra analysen til samling plater å undersøke, for eksempel protein konsentrasjoner via enzym-koblet-immunosorbent-analysen. Hvis vitenskapelig utstyr kan lese direkte fra 96-brønner tilgjengelig, slik tilnærming minimerer kostnadene per eksempel og handsontime og maksimerer resultatene av multipleksing ulike analyser fra samme eksempel. Bruken av flerkanals Pipetter i tillegg hastigheter opp eksempel behandling. I prinsippet kan analysen beskrevet her også gjennomføres med godt plate formater med større godt diameter, men dette vil kreve flere pipettering trinn i andre rør og fartøy for nedstrøms analyser. Mindre plate typer som 384well plater, men presentere ikke geometrien egnet for biomedisinsk plasma forskning jets med store feed gass flukser. Spesielt kan ikke det garanteres at bare én, men ikke tilstøtende brønner påvirkes under behandling.
Flytende analyse er avgjørende for å undersøke arter deponering av plasma. I ekspert analyser, kan en parallell installasjon av ulike analyser beskrive plasmatreated væske med hensyn til ulike oksidanter samtidig. Denne multipleksing kan utvikle en differensiert bilde av plasmaderived. Beskrevet tilnærmingen er svært følsom for undersøker hydrogen peroxide konsentrasjoner39, som er ofte nødvendig, men ikke alltid tilstrekkelig å forklare plasma effekter. 40 , 41 , 42 biologisk relevante effekter kan også vurderes i væsker med en glutation analysen ikke inkludert her. 43 bestemt nitritt analysen anbefales sterkt over konvensjonelle Griess-analyser på grunn av 10fold høyere analysen følsomhet (data ikke vist). Plasmatreated væsker kan også undersøkes for dannelsen av subsyrer med DTNB-analysen. Likevel, tidligere resultater ikke tyder dannelsen av at arter med våre plasma-kilde. 19 , 39 , 44 etter plasma behandlingen er ferdig, arter forverring foregår over tid. Nitritt reagerer nitrat; peroxide brukes også over tid. Men ta disse prosessene flere timer. 35 cytochrome c absorpsjon er stabil over flere timer også. Derfor hvis prosesser oppstå innen de første 30 min etter behandling, variasjon i konsentrasjoner av varige arter beskrevet her er ubetydelig. Imidlertid må utvises ved undersøker visse typer medier (f.eksDulbeccos endret Eagle Medium) som ingredienser kan renovere opp til 90% peroxide innen 1 h (data ikke vist) fører til en undervurdering av plasma peroxide avsettelse i væsker.
En multiplex analysen presenteres varierer fra undersøker metabolsk aktivitet over cellen område (morfologi) til cellen overflaten markør uttrykk. En kombinasjon av disse analyser kan avdekke interessante resultater. For eksempel har vi tidligere vist i THP1 monocytter at metabolsk aktivitet og celle teller ikke redusere i et lineært etter eksponering for plasma. 45 heller, med økende plasma behandling tid, celler ble observert som økte i størrelse og hadde en høyere mitokondrie masse, dermed fører til høyere metabolske priser på percell basis. I hovedsak multiplexes kombinasjonen av multiplate leseren, mikroskopi og flowcytometri informasjon om mobilnettet svar etter plasma behandling. I melanom celler fokuserer vi her på cytotoksiske effekter og deres immunogenisitet formidlet av calreticulin. 46 i prinsippet mange andre spørsmål kan rettes med denne tilnærmingen koble metabolsk aktivitet med bildebehandling og flyt cytometri resultater. For eksempel kan celledifferensiering (f.eks macrophage polarisering), mitokondrie membran potensialet, celle syklus analyse, celle motilitet, biomekanikk eller micronucleus formasjon for analyse av gentoksisitet også undersøkes i plasma-behandlet celler. Flerfarget flowcytometri gir enda mer programmer i ulike celle populasjoner samtidig. Dette omfatter for eksempel analyse av statusen fosforylering signalnettverk proteiner som transkripsjonsfaktorer, mRNA kvantifisering, måling av intracellulær cytokiner, og/eller vurdering av total redusert thiols på en enkelt celle-nivå. Flere biologisk relevant informasjon som er tilgjengelig for hvert utvalg hjelpemidler i videreutvikle bildet av plasma redoks effekter for bedre å forstå gjeldende og fremtidige plasma programmer.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Finansiering fra tysk Federal Utdannings- og forskning (BMBF gi tall 03Z22DN11 og 03Z22DN12) er takknemlig anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| accutase | BioLegend | 423201 | |
| amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
| argon gas | Air Liquide | N50 | |
| B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
| catalase | Sigma | C30 | |
| cell culture incubator | Binder | CB210 | |
| cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
| cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
| data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
| fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
| fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
| flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
| flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
| Glutamine | Sigma | G7513 | |
| imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
| laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
| mass flow controller | MKS | G-series | |
| Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
| microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
| optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
| penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
| pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
| plate reader | Tecan | M200pro | |
| propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
| resazurin | VWR | B21187.06 | |
| RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
| xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |
References
- Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11 (6), 431-438 (2003).
- Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3 (1), 23-34 (2010).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
- Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16 (11), 1212-1214 (2012).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82 (6), 1223-1237 (2010).
- Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4 (1), 19-28 (2016).
- Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
- Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11 (9), 0160667 (2016).
- Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18 (4), 868 (2017).
- Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19 (13), 1539-1605 (2013).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29 (1), 52-56 (2012).
- Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29 (1), 148-155 (2015).
- Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167 (2), 404-410 (2012).
- Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7 (12), 52653 (2012).
- Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
- Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8 (12), 81576 (2013).
- Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3 (2), 42-52 (2015).
- Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40 (11), 2986-2993 (2012).
- Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12 (12), 1354-1363 (2015).
- Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3 (1-2), 71-80 (2013).
- Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112 (9), 1536-1545 (2015).
- Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (3), 0120041 (2015).
- Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49 (3), 035401 (2016).
- Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
- Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3 (1), 24-31 (2015).
- Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38 (3), 748-757 (2010).
- Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26 (2), 156-162 (2017).
- Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3 (1-2), 81-95 (2013).
- Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13 (12), 1179-1188 (2016).
- Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1 (1), 55-63 (2011).
- Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
- Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25 (9), 1523-1531 (2014).
- Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47 (28), 285401 (2014).
- Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46 (43), 435203 (2013).
- Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13 (11), 1120-1127 (2016).
- Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49 (9), 631-640 (2009).
- Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48 (5), 542-549 (2014).
- Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
- Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100 (4), 791-799 (2016).
- Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6 (82), 78457-78467 (2016).
- Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3 (4), 267-278 (2013).
- Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10 (2), 029518 (2015).
- Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13 (1), 54-61 (2007).
