Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Grundforskning i Plasma medicin - en genomströmning strategi från vätskor till celler

doi: 10.3791/56331 Published: November 17, 2017

Summary

En hög genomströmning kall fysiska plasma behandlingsprotokoll av vätskor och celler visas. Det handlar om att sätta upp olika gastillförseln kompositioner för plasma tändning, mäta plasma's utsläpp spectra, och efterföljande analys av vätskor och cellulär aktivitet efter plasmabehandling.

Abstract

I plasma medicin tillämpas joniserat gaser med temperaturer nära ryggradsdjur system på celler och vävnader. Kall plasmor generera reaktiv arter kända redox reglera biologiska processer vid hälsa och sjukdom. Prekliniska och kliniska bevis pekar på positiva effekter av plasmabehandling i läkning av kroniska sår i huden. Andra framväxande ämnen, såsom plasma cancerbehandling, får allt större uppmärksamhet. Plasma medicinsk forskning kräver tvärvetenskaplig kompetens inom fysik, kemi och biomedicin. Ett mål av plasmaforskning är att karakterisera plasma-behandlade celler i en rad specifika program. Detta omfattar till exempel celltal och livskraft, cellulära oxidation, mitokondriell aktivitet, cytotoxicitet och läge av celldöd, cellcykeln analys, cell surface markör uttryck och cytokinfrisättning. Denna studie beskriver viktig utrustning och arbetsflöden som krävs för sådan forskning i plasma biomedicin. Det beskriver funktionsduglighet i ett atmosfäriskt tryck argon plasma jet, särskilt övervaka dess grundläggande utsläpp spectra och foder gas inställningar för att modulera reaktiva arter utdata. Med en hög precision xyz-tabell och datorprogramvara, är jet svävade i millisekund precision över hålrum av 96 brunnar i mikrometer precision för maximal reproducerbarhet. Nedströms analyser för flytande analys av redox-aktiva molekyler visas, och målceller är plasma-behandlade. Specifikt, melanomceller analyseras i en effektiv sekvens av olika på varandra följande analyser men använder samma celler: mätning av metabolisk aktivitet, summacell område och ytan markör uttryck för calreticulin, en molekyl som är viktigt för den immunogent celldöd av cancerceller. Dessa analyser hämta innehåll-rika biologiska information om plasma effekter från en enda skylt. Sammantaget beskriver denna studie de grundläggande stegen och protokoll för plasma medicinsk forskning.

Introduction

Reaktiva arter är viktiga redox tillsynsmyndigheter i sjukdom, inklusive onormal sårläkning1 och cancer. 2 ännu viktigare, dessa arter är involverade i patologi samt dess terapeutiska beslut. 3 , 4 kalla fysiska plasma är en joniserad gas att fördriver reaktiva arter av många slag. 5 sedan tillkomsten av så kallade kalla plasmor som verkar på kroppen temperaturen6, kall plasma kan tillämpas på celler och vävnader utan termisk skada. Genom att påvisa effekt och säker tillämpning av plasma enheter i prekliniska och kliniska observationer, har tre fått ackreditering som medicintekniska produkter i Tyskland. 7 särskilt när det gäller genotoxiska säkerhet, har flera studier visat avsaknad av mutagena händelser med hjälp av den första enheten, ett atmosfäriskt tryck argon plasma jet. 8 , 9 , 10 de andra två enheterna är så kallade dielektrisk barriär utsläpp (DBD), som verkar via en annan princip än plasma jet. Specifikt, möjliggör jets skalpell-liknande behandling av ytor och håligheter DBD plasmor är effektiv vid behandling av större men ganska platt vävnad områden. Att utnyttja cellulära redox signalering11, är syftet med tekniken att utnyttja plasma-genererade reaktiva arter för biomedicinska tillämpningar. 12 en särskilt lovande tillämpning av kliniska plasma terapi är stöd av sårläkning. 13 , 14 , 15 vidare plasma visade sig ha cancer effekter i djurmodeller. 16 , 17 , 18

Innan du validerar effekt och säkerhet av plasma applikationer i djurmodeller, eller även människor, standardiserade in vitro- forskning måste utföras med plasma enheter. Dessa experiment är nödvändigt att utforska plasma applikationer och att avgränsa mekanismerna i arbetet. Dessutom behövs grundläggande forskning att förstå effekterna av sammansättningen av reaktiva arter och efterföljande biologiska effekter. Denna studie visar hur plasma kan integreras i biomedicinsk forskning för att bättre förstå och kontrollera dess effekter på celler. Det beskriver trimning av gastillförseln sammansättning, övervakning av reaktiva arter utdata, tillämpningar av plasma att vätskor och vävnader, celler, och de resulterande kemiska och biologiska utfall. Dessutom finns exempel som instruera om standardisering av plasmabehandling och nedströms biologiska analyser, med en betoning på plasma medicinsk forskning görs i 96 brunnar. Detta tillvägagångssätt har tydliga fördelar: jag) minimering av antalet celler som behövs per skick, reagens kostnader och praktiska tid per prov; (II) avdrag på större noggrannhet av resultat som dubbletter eller tre exemplar behandlingar kan ställas in med lätthet; och iii) underlättande av sömlösa nedströms testmetoder i Plattläsare med 96 brunnar format, imaging och flöde flödescytometri experiment.

Protocol

1. plasma arter övervakning och behandling Setup

  1. Plasma arter övervakning
    1. Använda ett atmosfäriskt tryck plasma jet och högst två standard liter per minut foder gas flux.
    2. Vinkelrät plume axel, placera jet framför en optisk utsläpp spektrofotometer och rekord photoemission och våglängd (200-1000 nm) använder dedikerade programvara.
    3. Blanda 0,5% av kvävgas eller syrgas till antingen torr eller fuktad (5%) gastillförseln.
    4. Upprepa optiska utsläpp spektroskopi för varje gas villkor.
    5. Analysera med programvara för grafisk visning av data.
  2. Plasma behandling setup
    1. Fixa jet till en dator-driven xyz-tabell.
    2. Identifiera placeringen av brunnarna och skapa ett dator-skript för att flytta jet anslöt sig till tabellen, med lämplig behandling tiden, ovanför mitten av varje brunn.
    3. Lägg till 104 av någon typ av vidhäftande däggdjursceller i 100 µL av komplett cellodlingsmedium (RPMI1640 med 10% FCS, 2% glutamin och 1% penicillin/streptomycin) i flera brunnar under en LAF.
    4. Tillåta cellular friktion att uppstå över natten vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 5% koldioxid.
    5. Behandla cellerna med plasma för 20 s på olika höjder (z-axel) 250 µm mellanrum.
    6. Tillsätt 25 µL av propidium jodid i cellodlingsmedium till varje brunn.
    7. Bilden cellerna i Mikroskop för att fastställa specifika höjden som inte inducerar cell nekros på grund av fodret gas driver odlingssubstratet ovanpå cellerna åt sidan.
      Obs: För längre behandlingstider, identifiera vätskeavdunstning på detta viss höjd, i plasma på och off-läge genom vägning plattan före och efter plasmabehandling att identifiera mängden mikroliter doubledistilled vatten nödvändigt att återupprätta osmotic homeostasis i behandlade brunnarna.
    8. Förbereda en slutprotokollet xyz-tabellen med respektive behandlingstider (här: 20 s, 40 s, 60 s plasma och 60 s gaskontroll) väl positioner och ha redo multikanal pipetter och reservoarer för vätskehantering av 96 brunnar i efterföljande analyser.

2. analys av större reaktiva komponenter i Plasma-behandlade vätskor

  1. Analys av Plasma-behandlade väteperoxid
    1. Behandla 100 µL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med plasma i tre exemplar i platt-bottenplåtar med 96 brunnar.
    2. Förbereda en master mix av lastning 100 µL av PBS med 10 U av pepparrotsperoxidas och 5 µM väteperoxid upptäckt reagens (tillräckligt för en väl; skala upp med detta).
    3. Tillsätt 95 µL av master mix till varje brunn.
      Obs: Föregående steg bör utföras under en ren bänk eller i ett rum som är skild från plasma källan som luften ozon kan minska känsligheten för analysen.
    4. I en separat plåt, förbereda en två-faldig utspädning serie av väteperoxid i PBS med en högsta koncentration av 100 µM i 100 µL PBS.
    5. Tillsätt 5 µL prov eller väteperoxid standarder brunnar innehållande upptäckt reagensen.
    6. Inkludera brunnar innehållande upptäckt reagens endast för bakgrunden subtraktion efter avläsning.
    7. Inkubera plattan i mörkret under 15 minuter vid rumstemperatur.
    8. Placera plattan i microplate reader mäta fluorescens på λex 535 nm och λem 590 nm.
      Obs: Om peroxid kickkoncentrationer förväntas i proven, provspädningen behöver ökas eller avläsningar behöver göras med kortare inkubationstider att undvika mättnad i analysen.
    9. Subtrahera tomma värden från alla prover, beräkna peroxid standardkurvan och kvantifiera okänt prov peroxid koncentrationer från den baslinje-kurvan.
  2. Analys av Plasma-behandlade nitrit
    1. Behandla 100 µL av PBS med plasma i tre exemplar i flatbottom 96well plattor.
    2. Förbereda en master mix av nitrit upptäckt lösning genom att lägga till 1 µL kvantifiering reagens 99 µL av doubledistilled vatten (tillräckligt för en väl; skala upp med detta).
    3. Tillsätt 100 µL per brunn till en tydlig, flatbottom 96well tallrik. Skala upp som behövs för antalet brunnar.
    4. Förbereda en utspädning serie nitrit standarder i doubledistilled vatten.
    5. Tillsätt 10 µL av standarder eller prover till huvudmixen i 96well plattor.
    6. Inkubera plattan i mörkret under 10 minuter vid rumstemperatur.
    7. Tillsätt 5 µL av nitrit kvantifiering utvecklare lösning till varje brunn.
    8. Läs fluorescens i en microplate reader på λex 365 nm och λem 450 nm.
    9. Subtrahera tomma värden från alla prover, beräkna standardkurvan nitrit och kvantifiera okänt prov nitrit koncentrationer från den baslinje-kurvan.
  3. Analys av Plasma-behandlade superoxid
    1. Gör en master mix av oxiderade cytokrom (1 mg/mL) och katalas (20 µg/mL) i PBS.
    2. Tillsätt 100 µL av master mix till brunnarna i en tydlig, platt botten plattan med 96 brunnar.
    3. Behandla huvudmixen med plasma i tre exemplar per behandling skick.
    4. Läs absorbansen vid 550 nm med en microplate reader; Detta Diagramdata.
    5. Beräkna mängden superoxid genereras med den molära extinktionskoefficient av cytokrom C och i ljuset väglängd av vätska inom en brunn.

3. biologiskt svar av celler utsätts för Plasma

  1. Flerdimensionella avläsning av Plasma-behandlade celler: metabolisk aktivitet
    1. Använd en LAF för alla av följande procedurer.
    2. Utsäde 104 celler (B16 murina melanom) i 100 µL kompletteras fullt cellodlingsmedium per brunn i platt-bottenplåtar med 96 brunnar.
    3. Tillåta cellulär adhesion över natten vid 37 ° C i den befuktade atmosfären i inkubatorn med 5% koldioxid.
    4. Med hjälp av xyz-tabellen, behandla brunnar med plasma eller gas ensam enligt ett fördefinierat schema, och lägga cellerna tillbaka i inkubatorn för 20 h.
      Obs: Om du vill ta bort supernatanterna efter 20 h att analysera extracellulära produkter; Tillsätt 100 µL av färskt medium efteråt.
    5. I varje brunn, tillsätt 25 µL cellodlingsmedium innehållande 500 µM resazurin (slutlig koncentration 100 µM); Förbered tre brunnar innehållande resazurin ensam i cellodlingsmedium utan celler för bakgrunden subtraktion.
    6. Inkubera under 3 h i inkubatorn.
    7. Läs fluorescens på λex 535 nm och λem 590 nm i en microplate reader.
    8. Subtrahera bakgrunden fluorescens från alla prover och normalisera data till kontrollvärden.
  2. Flerdimensionella avläsning av Plasma-behandlade celler: bildanalys
    1. Använd väl Skyltens 3.1.7 och Kassera supernatanten.
    2. Tillsätt 100 µL av färska cellodlingsmedium innehållande 1 µg/mL propidium jodid.
    3. Satte plattan under ett Mikroskop med en motoriserad scen till bild varje brunn.
      Observera: Imaging Detaljer beroende med experimentella frågan; här, användes ett 20 X-objektiv i en hög-innehåll bildenhet för att läsa 3 x 3 synfält i varje brunn i en ljusa fältet kanal, digital fas kontrast kanal och fluorescens (propidium jodid) kanal, utnyttja lämpliga excitation ljus och utsläpp filter.
    4. Använd kvantitativa analys bildbehandlingsprogram att bestämma den totala cytosoliska arealen i digital fas kontrast bilder till alla fält avbildas i varje brunn.
      Obs: Analysera ytterligare parametrar om så önskas, exempelvis antalet livskraftiga och/eller döda celler eller mitokondriell aktivitet med dedikerad fläckar. Om du använder andra fläckar än beskrivs i detta arbete, se till att fluorescens fläckar används för mikroskopi inte spektralt överlappar med de fluorokromer som används i efterföljande flöde flödescytometri experiment.
    5. Den Diagramdata och om så önskas, testa för korrelation med de värden som erhålls för metabolisk aktivitet.
  3. Flerdimensionella avläsning av Plasma-behandlade celler: flödescytometri
    1. Använd väl plattan från steg 3.2.5 för denna analys.
    2. Avlägsna supernatanten och tvätta två gånger med 200 µL av PBS som innehåller kalcium och magnesium (0,9 mM och 0,5 mM, respektive).
      Obs: Fixa eller permeabilize celler i detta skede för ytterligare biologiska utläsningar inte omfattas i detta bidrag, till exempel färgningen av intracellulära antigen eller cellcykeln analys.
    3. I varje brunn, tillsätt 50 µL av PBS med kalcium och magnesium som innehåller 50 ng/mL antimus calreticulin monoklonala antikroppar.
    4. Inkubera i 15 min i inkubatorn.
    5. Tvätta två gånger med 200 µL fullt kompletteras cellodlingsmedium och kassera vätskan i plattan.
    6. Tillsätt 100 µL av cell avlossning lösning till varje brunn och inkubera i 20 min i inkubatorn.
    7. Använda en annan uppsättning ofärgade B16 celler i suspension för att ställa flödet flödescytometrisk förvärv protokollet, gating strategi, och vinster och spänningar av photodetectors.
    8. Fyll plattan i en flödescytometer utrustad med en automatisk provtagare för plattor med 96 brunnar.
    9. Förvärva minst 1000 celler i framåt och side scatter befolkningen vanligtvis förknippas med viabla celler.
    10. Använda programvara avsedd för analys av flödescytometri, .fcs filer till gate befolkningen av intresse, och bestämma medelvärdet fluorescensintensiteten hos calreticulin.
    11. Diagramdata och om så önskas, testa för korrelation med de värden som erhålls för metabolisk aktivitet, imaging eller oxidant nedfall.

Representative Results

I denna studie beskrevs ett smidigt arbetsflöde för medicinsk forskning om effekterna av plasma. Den tvärvetenskaplighet som utnyttjas här analyserar grundläggande optiska utsläpp profilen av plasma jet, reaktiva huvudkomponenterna i vätskan, och de biologiska svar av celler behandlas med plasma (figur 1).

För att genomföra detta arbetsflöde, behövdes ett antal komponenter för att korrekt ange källa för plasma (figur 2). De olika gaserna (här huvudsakligen argon, syre och kväve) levererades till och kontrolleras av flera massflödet registeransvariga. En central panel användes digitalt justera massa flödesregulatorerna till förutbestämda gastillförseln flussmedel. För att ge specifika gastillförseln kompositioner, blandades fysiskt gaserna utnyttja en panel av ventiler som kombinerade gaser från flera massflödet registeransvariga (figur 2A). Plasma källan var påslagen och plasma utflödet sattes upp framför en USB-spektrofotometer (figur 2B) med en optisk rad 200 nm till 1000 nm. För behandling av vätskor och celler, var ett effektivt arbetsflöde beskrivs med 96 brunnar. Flera rätter hölls på plats med en plastram som var fast på bottenplattan med infogningar matchas till dess präglade hål (figur 2C). Hela installationen placerades under en LAF (figur 2D). Denna installation ingår en xyz-tabell som handhållna lappa av plasma jet var monterad. Motorisk kontrollelementen kan vara placerade utanför bänken, om den senare har tillräckligt stor kabelanslutningen från och till i xyz-tabell. Ännu viktigare, bordet var datorstyrda och kan programmeras att hover jet över centrum av varje brunn med mikrometer precision för önskad mängd tid. Dessutom valdes fritt startposition (som i våra setup, väl A1) (figur 2E). Tillsammans med innehavaren av plast plattan tillåts detta för en reproducerbar plasmabehandling dagliga variationer enbart relaterade till installationen av de flytande och biologiska experiment.

Optiska utsläpp spektroskopi (OES) användes för att följa distinkta toppar kopplade till reaktiva plasma komponenter i olika gastillförseln förhållanden (figur 3A). Till exempel det andra positiva systemet av kväve med toppar från 330 nm till 380 nm representerade reaktivt kväve arter, och toppen vid 309 nm representerade hydroxylradikaler (pilen i figur 3A). Jämfört med argongas ensam, förekomsten av kväve arter ökat med en blandning av kväve i gastillförseln, medan tillägg av syre eller fukt minskade eller minskat det, respektive. Däremot var förekomsten av hydroxylradikaler minskade med syre eller kväve men ökat markant om befuktade argon användes som foder gas. För plasmabehandling av vätskor, avdunstningen orsakad av argongas och argon plasma fastställdes första (figur 3B). Ännu viktigare, ger båda villkoren inte liknande resultat eftersom plasma utövar också effekter på temperatur. I linje med OES resultaten av hydroxylradikaler, väteperoxid nedfall betydligt minskade med syre eller kväve inblandning men ökade med befuktade gastillförseln (figur 3C). Dessutom tillägg av kväve till gastillförseln ledde till betydligt högre nitrit koncentrationer jämfört med argon plasma-behandlade vätskor (figur 3D). Arbetsflödet kan också användas för att undersöka effekterna av plasma på vätskor med olika sammansättningar. Exempelvis tycktes väteperoxid koncentrationer vara oberoende av förekomsten av fetalt kalvserum i PBS och RPMI1640 cellodlingsmedium (figur 3E). I samma prover minskade förekomsten av serum nitrit koncentrationer i PBS och cell odlingsmedium jämfört med jämnåriga icke-serum innehållande (figur 3F). De flesta superoxid producerades i torr argon gas förhållanden med syre eller kväve admixtures avsevärt dämpar superoxid generation, med undantag av den befuktade argon-syre plasman (figur 3G).

För plasmabehandling av celler i flera rätter, plattan som innehåller celler seedade dagen innan var bort från inkubatorn och läggas till plasthållare. En programmerad behandling mönster tillämpades, avdunstning kompenserades och plattan placerades tillbaka in i inkubatorn för 20 h. Observera att efter denna inkubation, cell cellkulturer kunde har samlats in i en ny, Tom plattan med 96 brunnar och lagras vid- 80 ° C för bedömning av proteiner av intresse. Sedan lades resazurin till cellerna i varje brunn. Omsättningen av icke-fluorescerande resazurin till fluorescerande resorufin underlättades endast av aktiva NADPH-genererande enzymer och korrelerade med övergripande metabolisk aktivitet (figur 4A). Fluorescens stödnivåer liknade den visuella uppfattningen av plattan, och indikerade cytotoxiska effekter av långvarig plasmabehandling (figur 4B). Befuktade gas förhållandena var mer skadliga än torr gas villkor. Samma celler i plattan utnyttjades för ytterligare nedströms analyser. Celler i plattan var mikroskopiskt undersökt (figur 4C). Med programvara för bildåtergivning, undersöktes flera brunnar i plattan för kvalitativ jämförelse (figur 4D). Programvara får kvantifiering av den totala arealen som omfattas av celler inom de synfält som förvärvats i varje brunn och resulterande data var normaliserade till respektive kontroller (figur 4E). En minskning av totala cell området sågs i plasma behandling proven, särskilt med villkor som befuktade gastillförseln. Efter imaging, var cellerna tvättas, färgas med antimus calreticulin antikroppar, fristående och analyseras med flödescytometri (figur 4F). Menar fluorescens stödnivåerna calreticulin färgning i viabla celler (figur 4G) var beräknas och jämförs mellan prover (figur 4H). Plasmabehandling inducerade en uppreglering av calreticulin på murina melanom cellyta, vilket motsvarade plasma behandlingstiden appliceras med torr foder gas villkor. För tilluften gastillförseln villkor, 20 s och 40 s behandling inducerade en starkare calreticulin exponering jämfört med den mer dödliga 60 s behandlingstid. Detta tyder på fanns det en icke-linjär förordning calreticulin exponering när det gäller mängden oxidanter introducerade till cellerna.

Figure 1
Figur 1 : Arbetsflöde plasma medicinsk forskning från fysik till biologi. Reaktiva arter produktionen av atmosfärstryck argon plasma jet är inställd genom att modulera gastillförseln. Markerade molekyler i gasfas plasma övervakas med hjälp av spektroskopi. Plasma används för att behandla vätskor och undersöka oxidant nedfall. Celler odlade i mikroplattor finns plasma-behandlade, och biologiska utläsningar utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Inställning av plasma forskning bänken. (A) olika gaser i rostfritt stål rör drivs in flera massflödet registeransvariga som styrs via en central panel. De enskilda foder gassammansättning blandas därefter med hjälp av en panel av ventiler. (B) vissa reaktiva komponenter av plasman kan övervakas med hjälp av optiska utsläpp spektroskopi för att undersöka skillnader mellan olika gastillförseln kompositioner. (C) för hög genomströmning plasmaforskning, 96 brunnar mikroplattor används. För att säkerställa en konstant som startpunkt för programmerbara och automatiserad plasmabehandling, läggs plattan till en ram som garanterar samma absoluta position av plattor från dag till dag. (D) plasma jet är fast i en datorstyrd xyz-tabell ligger under en LAF. Alla 96 exakta platser och dwell-tiden av plasman över vart är väl skriven i en programfil att styra rörelsen av plasma källan. Den huvudsakliga bostäder av plasma jet apparaten samt motorstyrningar ligger i närheten. (E) automatiserad plasmabehandling av en plattan med 96 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Plasma jet och vätska analys. (A) optisk utsläpp spektroskopi av olika gastillförseln villkor visas. Det andra positiva systemet av kväve (330 nm till 380 nm) ökades med inblandning av kväve, frånvarande när det gäller syre tillsatsmedel, och markant minskat med befuktade argon (vänstra paneler). Toppen av hydroxylradikaler på 309 nm (pil) minskade i kväve och syre villkor men ökat markant med befuktade argon jämfört med argongas ensam. (B) Gas exponering av vätskor leder till avdunstning. Den avdunstning per brunn i en 96well platta vid behandling med plasma och argon gas ensam fastställdes genom vägning plattan före och efter behandling med en fin skala. Avdunstning i plasmatreated prover var högre jämfört med argon gastreated prover. (C) generering av väteperoxid i plasmatreated vätskor korrelerade till viss del med 309 nm toppen av hydroxylradikaler (a). Befuktade (5%) argon plasma ökade peroxid koncentrationer omkring 4fold. (D) nitrit upphöjdes när kväve lades till gastillförseln och denna effekt ökades med befuktade argon plasma. Tillsats av syre minskade nitrit generation men inte signifikant. (E, F) Väte peroxid och nitrit koncentrationer visas i olika typer av vätskor, nämligen RPMI1640 cellodlingsmedium med (R10F) och utan (R0F) samt PBS med och utan fetalt kalvserum (FCS). Peroxid nivåer skilde sig inte mellan olika medier (E) medan nitrit nivåer var betydligt minskade i närvaro av serum. (G) superoxid produktion var högst för torr argongas gas; inblandning av kväve, syre eller befuktade argon gav lägre superoxid nedfall i vätskan. Data som visas (B-G) är den genomsnittliga + SEM av två till tre experiment. Statistisk analys utförs (C, D) var och med envägs variansanalys jämföra hela gruppen medel för torra eller fuktiga gastillförseln betingelser mot respektive kontroll (** p < 0,01; *** p < 0,001). Dessutom var argon gas-bara plasma villkor jämfört med hela gruppen medelvärde och t-test (### p < 0,001). Ytterligare statistisk analys (F) utfördes med hjälp av t-tester jämföra värdena för varje plasmabehandling och medelstora skick i proverna med FCS och utan FCS (* p < 0,05; ** p < 0,01); också, FCS eller icke-FCS innehållande lösningar jämfördes inom varje plasma behandlingstid använder t-test (# p < 0,05; ## p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Plasmabehandling och dess effekter på celler. (A) celler utsattes för plasma och resazurin lades efter 20 h att bedöma metabolisk aktivitet. (B) aktivitet minskade avsevärt i plasmatreated prover jämfört med gas kontroller. En markant minskning sågs med befuktning av gastillförseln tillsats av syre eller kväve leder till toxicitet i både torrt och fuktigt argon gas villkor. (C) Medium innehållande propidium jodid (PI) lades till. (D), en översikt visas av brunnarna av plattan med digital faskontrast (orange) som representerar den cytosoliska delen av varje cell och PI (grön) att identifiera döda celler. Imaging verktyg får den kvantifiering av den totala arealen inom synfältet av varje väl täckt med celler. (F) celler var därefter tvättas och inkuberas med antikroppar eller andra cell markörer att karakterisera biologiska plasma effekter med flödescytometri. (G) Gating strategier var anställda och markör analys utfördes och jämfört mellan prover. Data som visas (B, E, H) betecknar den medelvärdet + SEM av en företrädare för tre oberoende experiment. Skalstapeln = 200 µm (D). Statistiska jämförelser utfördes med hjälp av tvåvägs analys av avvikelser (B, H) jämföra, för varje gas villkor, varje plasmabehandling till dess respektive gaskontroll (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). Dessutom värden för varje villkor av kväve och syre admixtures jämfördes med värden av argon gasplasma för torra och fuktiga förhållanden separat (tvåvägs analys av avvikelser; ### p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Grundforskning är grundläggande för att utveckla en förståelse för effekten av och mekanismer som underbygger plasma medicin i preklinisk och klinisk forskning. Grundläggande forskning främjar också utredning av nya applikationer för behandlingar. Medan det är väletablerat att plasmor medla deras biologiska effekter via generation av reaktivt syre och kväve arter19, finns det fortfarande tre huvudsakliga utmaningar till fältet. Vilka arter är det första viktiga? Detta kan delvis besvaras genom att modulera plasmor med optisk diagnostik och biologiska utläsningar gastillförseln sammansättning. 20 för det andra, vilka effekter kan ses i biologiska mål såsom celler? Detta är, åtminstone delvis, adresseras med cell kultur experiment och ett antal analyser. I eukaryota celler, effekter är pleiotropiska inklusive cellcykeln gripandet21, apoptos22, nekros23, och huden cell stimulering24,25,26, samt ett stöd eller minskning av cell motilitet eller metabolisk aktivitet27,28,29. Den tredje utmaningen, avser dessa pleiotropiska effekter, är att identifiera viktiga molekyler som avgör den cellulära svaren på plasmaderiverade oxidanter att förklara olika effekter ses ofta i olika celltyper. Detta kan göras genom omics tekniker30,31,32 och/eller upp eller nedreglering av målgener med siRNA (redox) signalering-hämmare, antioxidanter och antioxidativa enzymer, samt modulering av den plasma's reaktiva arter utdata. 33 , 34 , 35 därför strömlinjeformad assay protokoll behövs för att testa större provningssatser med stort antal iterationer.

Denna studie exemplifierar ett effektivt experimentella arbetsflöde, från fysik till biologi, för plasma medicinsk forskning när det gäller de nämnda utmaningarna. Information om de tekniska aspekterna av plasma källan och plasma generation har beskrivits tidigare. 36 , 37 , 38 som alla av dessa analyser utförs i 96well pläterar, som har ett antal fördelar. Exempelvis kan prover, såsom cell cellkulturer enkelt transporteras från analys till samlingsplattor att utreda, till exempel protein koncentrationer via enzym-länkade--immunosorbentanalys. Om det finns vetenskapliga utrustning som kan läsa direkt från 96-wells en sådan strategi minimerar kostnader per prov och handsontime och maximerar resultat genom multiplexing olika analyser från samma prov. Användning av multikanal pipetter dessutom påskyndar provhantering. I princip kan analysen beskrivs här också utföras med hjälp av väl platta format med större väl diametrar, även om detta skulle kräva ytterligare pipettering steg in i andra rör och fartyg för nedströms analyser. Mindre tallrik typer såsom 384well tallrikar, dock utgör inte geometri passar biomedicinsk plasmaforskning med jets med stora gastillförseln flussmedel. Specifikt, kan det inte garanteras att endast enstaka men inte intilliggande brunnar påverkas under en behandling.

Flytande analys är viktigt att undersöka arter nedfall av plasma. I expertanalyser, kan en parallell installation av olika analyser karakterisera plasmatreated vätskor när det gäller olika oxidanter samtidigt. Detta multiplexing kan utveckla en differentierad bild av plasmaderived arter. Den beskrivna metoden är mycket känslig för undersöka väteperoxid koncentrationer39, vilket ofta är nödvändigt men inte alltid tillräckligt att förklara plasma effekter. 40 , 41 , 42 biologiskt relevanta effekter kan också bedömas i vätskor med en glutation-analys som inte ingår här. 43 den specifika nitrit-test rekommenderas starkt över konventionella Griess-analyser på grund av 10fold högre analysens känslighet (inga data anges). Plasmatreated vätskor kan också undersökas för bildandet av hypokloritsyra med DTNB-analys. Ändå tidigare resultat tyder inte bildandet av arten med vår plasma källa. 19 , 39 , 44 efter plasma behandlingen har avslutats, arter försämring sker över tid. Nitrit reagerar på nitrat; också, peroxid förbrukas över tiden. Men ta dessa processer flera timmar. 35 cytokrom c absorption är stabil över flera timmar också. Därför, om processer inträffar inom de första 30 min efter behandling, variation i koncentrationer av de långlivade arter som beskrivs här är försumbar. Men man måste vara försiktig när undersöka vissa typer av media (t.ex., Dulbeccos den Eagle Medium) som ingredienser kan rensa upp till 90% peroxid inom 1 h (inga data anges) leder till en underskattning av plasma peroxid nedfall i vätskor.

En multiplex assay presenteras som sträcker sig från att utreda metabolisk aktivitet över cellområde (morfologi) till cell surface markör uttryck. En kombination av dessa analyser kan avslöja intressanta resultat. Exempelvis har vi tidigare visat i THP1 monocyter att metaboliska aktivitet och cell räknas inte minskar linjärt efter exponering för plasma. 45 snarare, med ökande plasma behandlingstid, celler sågs som ökade i storlek och hade en högre mitokondriemassa, vilket leder till högre ämnesomsättning priser på basis av percell. Kombinationen av multiplate läsare, mikroskopi och flödescytometri multiplexer i huvudsak information om cellulära svar efter plasmabehandling. I melanomceller fokuserar vi här på cytotoxiska effekter och deras immunogenicitet medieras av calreticulin. 46 i princip många andra frågor kan ställas med detta synsätt som förbinder metabolisk aktivitet med imaging och flöde flödescytometri resultat. Till exempel kan celldifferentiering (e.g. makrofag polarisering), mitokondriella membranet potential, cellcykeln analys, cell motilitet, biomekanik eller mikrokärntest bildandet för analys av genotoxicitet också undersökas i plasma-behandlade celler. Multicolor flödescytometri möjliggör ännu mer applikationer i olika cellpopulationer samtidigt. Detta omfattar till exempel analys av phosphorylation status signalering proteiner som transkriptionsfaktorer, mRNA kvantifiering, mätning av intracellulära cytokiner, eller bedömning av total minskad tioler på en enda cell-nivå. Ytterligare biologiskt relevant information som är tillgänglig för varje prov hjälpmedel ytterligare utveckla bilden av plasma redox effekter att bättre förstå nuvarande och framtida plasma applikationer.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Finansiering från tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF bevilja nummer 03Z22DN11 och 03Z22DN12) är erkänt tacksamt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11, (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3, (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45, (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82, (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4, (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11, (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18, (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19, (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59, (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29, (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29, (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167, (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7, (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8, (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3, (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40, (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12, (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3, (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112, (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49, (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3, (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38, (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26, (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3, (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13, (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1, (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25, (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47, (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46, (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13, (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49, (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48, (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100, (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6, (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3, (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10, (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13, (1), 54-61 (2007).
Grundforskning i Plasma medicin - en genomströmning strategi från vätskor till celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).More

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter