Summary
En høj overførselshastighed kolde fysiske plasma behandling protokol af væsker og celler er vist. Det indebærer oprettelse af forskellige feed gas kompositioner for plasma tænding, måling af plasma emissionen spektre, og den efterfølgende analyse af væsker og cellulære aktivitet efter plasma behandling.
Abstract
I plasma medicin, der ioniserede gasser med temperaturer tæt på hvirveldyr systemer anvendes på celler og væv. Kolde plasmaer generere reaktive arter kendt til redox regulere biologiske processer i sundhed og sygdom. Prækliniske og kliniske beviser peger på gavnlige virkninger af plasma behandling i heling af kroniske sår i huden. Andre nye emner, såsom plasma kræftbehandling, får stadig større opmærksomhed. Plasma medicinsk forskning kræver tværfaglig ekspertise i fysik, kemi og biomedicin. Ét mål af plasma forskning er at karakterisere plasma-behandlede celler i en række specifikke applikationer. Dette omfatter for eksempel, celletal og levedygtighed, cellulære oxidation, mitokondrie-aktivitet, cytotoksicitet og tilstand af celledød, celle cyklus analyse, celle overflade markør udtryk og cytokin frigivelse. Denne undersøgelse beskriver arbejdsgange kræves til sådan forskning i plasma biomedicin og vigtigt udstyr. Det beskriver den korrekte funktion af en atmosfærisk tryk argon plasma jet, specifikt overvågning dens grundlæggende emission spectra og feed gas indstillinger for at modulere reaktive arter output. Ved hjælp af en høj præcision xyz-tabel og computersoftware, er jet svævede i millisekund-præcision over hulrum i 96-brønd plader i mikrometer-præcision for maksimal reproducerbarhed. Downstream assays til flydende analyse af redox-aktive molekyler er vist, og target-cellerne er plasma-behandlet. Specifikt, melanom cellerne analyseres i en effektiv sekvens af forskellige på hinanden følgende assays, men ved hjælp af de samme celler: måling af metaboliske aktivitet, cellen total område og overflade markør udtryk for calreticulin, et molekyle, der er vigtige for den immunogen celledød af kræftceller. Disse assays hente indholdsrige biologiske oplysninger om plasma effekter fra en enkelt plade. Helt, denne undersøgelse beskriver de væsentlige skridt og protokoller for plasma medicinsk forskning.
Introduction
Reaktive arter er vigtigt redox lovgivere i sygdom, herunder abnorm sårheling1 og kræft. 2 vigtigere, disse arter er involveret i patologi samt dens terapeutiske opløsning. 3 , 4 kolde fysiske plasma er en ioniseret gas, der ekskluderer reaktive arter af mange slags. 5 siden fremkomsten af såkaldte kolde plasmaer, der opererer på krop temperatur6, kolde plasmaer kan anvendes på celler og væv uden termisk skade. Ved at demonstrere effektiviteten og sikker anvendelse af plasma-enheder i prækliniske og kliniske observationer, har tre modtaget akkreditering som medicinsk udstyr i Tyskland. 7 især vedrørende genotoksiske sikkerhed, flere undersøgelser har vist fravær af mutagene begivenheder ved hjælp af den første enhed, en atmosfærisk tryk argon plasma jet. 8 , 9 , 10 de andre to enheder er såkaldte dielektrisk barriere udledninger (Bel), som opererer via et andet princip end plasma jet. Specifikt, jets giver mulighed for en skalpel-lignende behandling af overflader og hulrum Bel plasmaer er effektiv i behandling af større, men temmelig flad væv områder. At udnytte cellulære redox signalering11, er formålet med teknikken at udnytte plasma-genereret reaktive arter for biomedicinske programmer. 12 et særligt lovende program af kliniske plasma terapi er støtten til sårheling. 13 , 14 , 15 i øvrigt plasma blev vist at have kræft effekter i dyremodeller. 16 , 17 , 18
Før validering af effekten og sikkerheden af plasma applikationer i dyremodeller, eller endog mennesker, standardiseret in vitro- forskningsbehov skal udføres med plasma-enheder. Disse eksperimenter er afgørende at udforske plasma programmer og at afgrænse mekanismer på arbejdspladsen. Desuden grundlæggende forskning er nødvendig for at forstå virkningen af sammensætningen af reaktive arter og efterfølgende biologiske virkninger. Denne undersøgelse viser, hvordan plasma kan integreres i biomedicinsk forskning til bedre at forstå og kontrollere dens virkninger på celler. Det beskriver tuning af feed gas sammensætning, overvågning af reaktive arter output, anvendelser af plasma til væsker, celler og væv og de deraf følgende kemiske og biologiske resultater. Desuden angivet eksempler som instruere på standardisering af plasma behandling og downstream biologiske assays, med en vægt på plasma medicinsk forskning udført i 96-brønd plader. Denne tilgang har klare fordele: Jeg) minimering af antallet af celler nødvendige pr. betingelse, reagens omkostninger og hands-on tid pr. prøve; II) justering af større nøjagtighed af resultater som dobbelt eller tredobbelt behandlinger kan sættes op med lethed; og iii) lettelse af sømløse downstream boltpistoler i 96-brønds format Pladelæser, billedbehandling og flow flowcytometri eksperimenter.
Protocol
1. plasma arter overvågning og behandling Setup
-
Plasma arter overvågning
- Brug en atmosfærisk tryk plasma jet og to standard liter pr. minut maksimalt gas flux.
- Vinkelret på aksen plume Placer jet foran en optisk emission Spektrofotometer, og registrere photoemission og bølgelængde (200-1000 nm) ved hjælp af dedikeret software.
- Bland 0,5% af nitrogen eller oxygen til enten tør eller fugtig (5%) feed gas.
- Gentag optical emission spektroskopi for hver gas betingelse.
- Analysere med software til grafisk visning af data.
-
Plasma behandling setup
- Fix jet til en computer-drevet xyz-tabel.
- Identificere placeringen af brøndene og generere en computer script for at flytte jet kom på bordet, med passende behandling gange, over midten af hver brønd.
- Tilføje 104 af enhver form for vedhængende pattedyrsceller i 100 µL af komplet cellekulturmedium (RPMI1640 med 10% FCS, 2% glutamin og 1% penicillin/streptomycin) i flere brønde under en laminar flow hætte.
- Tillad cellulære vedhæftning til sker natten over ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% kuldioxid.
- Behandling af celler med plasma for 20 s i forskellige højder (z-aksen) på 250 µm intervaller.
- Tilsæt 25 µL af propidium Iodid i cellekulturmedium til hver brønd.
- Billede celler under mikroskop for at fastslå den specifikke højde, der ikke inducerer celle nekrose som følge af foderet gas skubbe næringssubstratet på toppen af celler til side.
Bemærk: For længere behandling gange, identificere flydende fordampning ved denne særlige højden i plasma og slukke tilstanden, ved vejning pladen før og efter plasma behandling til at identificere mængden af microliters doubledistilled vand nødvendig for at genoprette osmotisk homøostase i de behandlede brønde. - Forberede en slutprotokollen til xyz-tabel med respektive behandling gange (her: 20 s, 40 s, 60 s plasma og 60 s gas kontrol) og godt positioner, og har klar multikanals pipetter og reservoirer for flydende håndtering af 96-brønd plader i efterfølgende assays.
2. analyse af reaktive hovedkomponenter i Plasma-behandlede væsker
-
Analyse af Plasma-behandlede hydrogenperoxid
- Behandle 100 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med plasma i tre eksemplarer i 96-brønd-bundpladerne.
- Forberede en master mix ved at indlæse 100 µL af PBS med 10 U af peberrodsperoxidase og 5 µM hydrogenperoxid påvisning reagens (tilstrækkelig for et godt; skala oppe i overensstemmelse hermed).
- Tilføje 95 µL af master mix til hver brønd.
Bemærk: De forrige trin skal udføres under en ren bænk eller i et rum adskilt fra plasma kilde som luften ozon kan mindske følsomheden af analysen. - I en separat plade, tilberedes en tofolds af hydrogenperoxid i PBS med en top koncentration af 100 µM i 100 µL PBS.
- Tilføj 5 µL af prøver eller hydrogenperoxid standarder brønde indeholdende påvisning reagens.
- Omfatte wells indeholdende påvisning reagens kun til baggrund subtraktion efter den læse-out.
- Inkuber plade i mørke i 15 min. ved stuetemperatur.
- Pladen anbringes i mikrotiterplade læseren måling fluorescens på λex 535 nm og λem 590 nm.
Bemærk: Hvis høje peroxid koncentrationer forventes i prøverne, prøveopløsning skal øges eller aflæsninger skal ske med kortere inkuberingstider at undgå mætning af analysen. - Subtrahere tomme værdier fra alle prøver, beregne peroxid standardkurven og kvantificere ukendt prøve peroxid koncentrationer fra den oprindelige kurve.
-
Analyse af Plasma-behandlede nitrit
- Behandle 100 µL af PBS med plasma i tre eksemplarer i flatbottom 96well plader.
- Forbered en master mix af nitrit påvisning løsning ved at tilføje 1 µL af kvantificering reagens til 99 µL af doubledistilled vand (nok til en godt; skala oppe i overensstemmelse hermed).
- Tilføje 100 µL pr. brønd til et klart, flatbottom 96well plade. Skalere, som er nødvendig for antallet af brønde.
- Forberede en fortyndingsrække af nitrit standarder i doubledistilled vand.
- Tilføje 10 µL standarder eller prøver til master mix i 96well plader.
- Inkuber plade i mørke i 10 min ved stuetemperatur.
- Tilsæt 5 µL af nitrit kvantificering udvikleren løsning til hver brønd.
- Læs fluorescens i en mikrotiterplade læser på λex 365 nm og λem 450 nm.
- Subtrahere tomme værdier fra alle prøver, beregne nitrit standardkurven og kvantificere ukendt prøve nitrit koncentrationer fra den oprindelige kurve.
-
Analyse af Plasma-behandlede superoxid
- Gøre en master mix af oxideret cytokrom (1 mg/mL) og katalase (20 µg/mL) i PBS.
- Tilføj 100 µL af master mix brønde i en klar, flad bund 96-brønd plade.
- Behandle den master mix med plasma i tre eksemplarer pr. behandling tilstand.
- Læse absorbans ved 550 nm ved hjælp af en mikrotiterplade læser; grafikdata.
- Beregne mængden af superoxid genereret ved hjælp af molær ekstinktion af cytokrom C og lys sti længden af væske i en brønd.
3. den biologiske respons af celler udsat for Plasma
-
Flerdimensionale udlæsning af Plasma-behandlede celler: metaboliske aktivitet
- Bruge en laminar flow hætte til alle de følgende procedurer.
- Frø 104 celler (B16 murine melanom) i 100 µL suppleret fuldt cellekulturmedium pr. brønd i 96-brønd-bundpladerne.
- Tillad cellulære vedhæftning natten over ved 37 ° C i den fugtig atmosfære i kuvøse med 5% kuldioxid.
- Hjælp af xyz-tabellen, behandle brønde med plasma eller gas alene efter et foruddefineret ordning, og tilføje cellerne tilbage i inkubatoren for 20 h.
Bemærk: Hvis det ønskes, tage ud analysere efter 20 h til at analysere ekstracellulære produkter; Tilsæt 100 µL af frisk medium bagefter. - Til hver brønd, tilføje 25 µL af cellekulturmedium indeholdende 500 µM resazurin (slutkoncentration 100 µM); forberede tre brønde, der indeholder resazurin alene i cellekulturmedium uden celler for baggrunden subtraktion.
- Inkuber i 3 h i rugemaskinen.
- Læs fluorescens på λex 535 nm og λem 590 nm i en mikrotiterplade læser.
- Subtrahere baggrund fluorescens fra alle prøver, og normalisere data til kontrolværdier.
-
Flerdimensionale udlæsning af Plasma-behandlede celler: billede analyse
- Bruge den godt plade fra 3.1.7 og kassér supernatanten.
- Tilsæt 100 µL af frisk cellekulturmedium indeholdende 1 µg/mL propidium Iodid.
- Sætte pladen under et mikroskop med en motoriseret fase til billede hver brønd.
Bemærk: Imaging detaljer afhænger af den eksperimentelle spørgsmål; her, blev en 20 X mål brugt i en høj-indhold imaging enhed til at læse 3 x 3 felter af visningen i hver brønd i en lysfelt kanal, digital fase kontrast kanal og fluorescens (propidium Iodid) kanal, udnytte passende excitations lys og emission filtre. - Bruge kvantitative billede analyse software til at bestemme den samlede cytosole område i digital fase kontrast billeder af alle felter i visningen afbildet i hver brønd.
Bemærk: Analysere yderligere parametre, hvis det ønskes, for eksempel antallet af levedygtige og/eller døde celler eller mitokondrie-aktivitet ved hjælp af dedikerede pletter. Hvis du bruger andre pletter end beskrevet i dette arbejde, Sørg for, at fluorescens pletter bruges til mikroskopi ikke spektralt overlapper med fluorokromer efterfølgende flow flowcytometri forsøgsdyr. - Diagram over dataene, og hvis det ønskes, teste for sammenhængen med de værdier, der er opnået for metaboliske aktivitet.
-
Flerdimensionale udlæsning af Plasma-behandlede celler: Flow flowcytometri
- Denne analyse, at bruge godt pladen fra trin 3.2.5.
- Supernatanten fjernes og vaskes to gange med 200 µL af PBS, som indeholder calcium og magnesium (0,9 mM og 0,5 mM, henholdsvis).
Bemærk: Fix og/eller permeabilize celler på dette stadium for yderligere biologisk udlæsninger ikke er omfattet af dette bidrag, såsom farvning af intracellulære antigen eller cellecyklus analyse. - Tilføje 50 µL af PBS med calcium og magnesium, som indeholder 50 ng/mL anti-mus calreticulin monoklonale antistoffer til hver brønd.
- Inkuber i 15 min i rugemaskinen.
- Vaskes to gange med 200 µL af fuldt suppleret cellekulturmedium og kassér væske i pladen.
- Tilsæt 100 µL af celle detachement løsning til hver brønd og Inkuber i 20 min. i rugemaskinen.
- Bruge et andet sæt af unstained B16 celler i suspension setup flow cytometric erhvervelse protokol, gating strategi, og gevinster og spændinger i fotodetektor.
- Læg pladen i et flow Flowcytometret udstyret med en automatisk prøveudtager til 96-brønd plader.
- Erhverve mindst 1.000 celler i forreste og side scatter befolkning som regel forbundet med levedygtige celler.
- Brug software dedikeret til analyse af flowcytometri, .fcs filer til gate befolkningens interesse, og bestemme middelværdi fluorescens-intensiteten af calreticulin.
- Grafikdata, og hvis det ønskes, teste for sammenhængen med de værdier, der er opnået for metaboliske aktivitet, billedbehandling, og/eller oxidant deposition.
Representative Results
I denne undersøgelse, blev en strømlinet arbejdsproces beskrevet for medicinsk forskning i virkningerne af plasma. Den tværfaglige tilgang udnyttet her analyserer de grundlæggende optiske emission profil af plasma jet, de reaktive hovedkomponenter i væsken, og de biologiske svar af celler behandles med plasma (figur 1).
For at gennemføre denne arbejdsproces, var en række komponenter nødvendige til korrekt sat op plasma kilde (figur 2). De forskellige gasser (her primært argon, ilt og kvælstof) blev leveret til og kontrolleret af flere massestrøm controllere. En central panel blev brugt til digitalt justere massestrøm controllere til forudbestemt feed gas strømme. For at give specifikke feed gas kompositioner, var gasserne fysisk blandet udnytter et panel af ventiler, der kombineret gasser fra flere massestrøm controllere (fig. 2A). Plasma kilde var tændt, og plasma spildevandet blev sat foran et USB-Spektrofotometer (figur 2B) med en optisk række 200 nm til 1.000 nm. Til behandling af væsker og celler, blev en effektiv arbejdsgang beskrevet ved hjælp af 96-brønd plader. Multi godt retter var holdt på plads ved hjælp af en plastik ramme, der blev fastsat på bundpladen med indsætninger matches til sin påtrykt huller (figur 2C). Hele opsætningen var henført under en laminar flow hætte (figur 2D). Denne opsætning inkluderet en xyz-tabel som plasma jet håndholdte stykke var monteret. Motorisk kontrolelementerne kan være placeret uden for bænken, hvis sidstnævnte har tilstrækkeligt store kabel havne fra og til tabellen xyz. Vigtigere, bordet var computer-kontrollerede og kan programmeres til at svæve jet over midten af hver brønd med mikrometer præcision i det ønskede tidsrum. Startposition (som i vores setup, godt A1) var desuden frit valgt (figur 2E). Sammen med indehaveren af plastik plade tilladt dette for en reproducerbar plasma behandling med daglige variationer udelukkende relateret til opsætning af de flydende og biologiske eksperimenter.
Optical emission spektroskopi (OES) blev brugt til at følge forskellige toppe knyttet til reaktiv plasma komponenter i forskellige feed gas betingelser (fig. 3A). For eksempel, den anden positive system af kvælstof med toppe fra 330 nm til 380 nm repræsenteret reaktive nitrogen arter, og peak på 309 nm repræsenteret hydroxylradikaler (pil i fig. 3A). I forhold til argon gas alene, tilstedeværelsen af nitrogen arter steget med en blanding af nitrogen i den tilførte gas, mens tilsætning af ilt eller fugtighed formindsket eller reduceret det, henholdsvis. Derimod var tilstedeværelsen af hydroxylradikaler faldt med oxygen eller nitrogen men markant øget hvis befugtet argon blev brugt som foder gas. Plasma behandling af væsker, fordampning forårsaget af argon gas og argon plasma var bestemt første (fig. 3B). Vigtigere, begge betingelser ikke give lignende resultater, fordi plasma også udøver virkning på temperatur. I overensstemmelse med OES resultaterne af hydroxylradikaler, hydrogenperoxid deposition betydeligt faldt med oxygen eller nitrogen blanding men steg med befugtet feed gas (figur 3C). Derudover tilsætning af kvælstof til den tilførte gas førte til betydeligt højere nitrit koncentrationer sammenlignet med argon plasma-behandlede væsker (figur 3D). Denne arbejdsproces kan også anvendes til at undersøge virkningen af plasma på væsker med forskellige kompositioner. For eksempel, syntes hydrogenperoxid koncentrationer at være uafhængig af tilstedeværelsen af føtal kalveserum PBS og RPMI1640 celle dyrkningsmedium (figur 3E). I de samme prøver faldt forekomsten af serum nitrit koncentrationer i PBS og celle kultur medium i forhold til deres ikke-serum indeholdende modparter (figur 3F). De fleste superoxid var produceret i de tørre argon gas betingelser med ilt og/eller nitrogen Tilslagsstoffer betydeligt dæmper superoxid generation, undtagen befugtet argon-ilt plasma (figur 3G).
Plasma behandling af celler i flere godt retter, pladen indeholder celler seedede dagen før var fjernet fra rugemaskinen og tilføjede at plastik holderen. En programmeret behandling mønster blev anvendt, fordampning blev kompenseret for, og pladen blev sat tilbage i inkubatoren for 20 h. bemærke, at efter denne inkubation, celle kultur analysere kunne have opsamlet i et nyt, tomt 96-brønd plade og opbevares ved- 80 ° C for vurdering af proteiner af interesse. Næste, resazurin blev tilføjet til celler i hver brønd. Omsætning på ikke-fluorescerende resazurin til fluorescerende resorufin var kun lettere aktiv NADPH-genererende enzymer og var korreleret med samlede metaboliske aktivitet (figur 4A). Fluorescens intensiteter lignede den visuelle opfattelse af pladen, og oplyste cytotoksiske virkninger af langvarig plasma behandling (fig. 4B). Befugtet gas betingelser var mere skadelig end tør gas betingelser. De samme celler i pladen blev udnyttet for videre downstream assays. Celler i pladen var mikroskopisk undersøgt (fig. 4C). Ved hjælp af software til billedbehandling, blev flere huller i pladen undersøgt for kvalitativ sammenligning (figur 4D). Software mulighed for kvantificering af det samlede areal er omfattet af celler i visningen felter af erhvervet i hver brønd og de resulterende data var normaliseret til respektive kontrolelementer (figur 4E). Et fald i cellen total område blev set i behandling plasmaprøver, især med befugtet feed gas betingelser. Efter imaging, blev cellerne vaskes, farves med anti-mus calreticulin antistoffer, løsrevet og analyseret med flowcytometri (figur 4F). Betyde fluorescens intensiteter af calreticulin farvning i levedygtige celler (figur 4G) var beregnes og sammenlignes mellem prøver (figur 4H). Plasma behandling induceret en opregulering af calreticulin på murine melanom cell overflade, hvilket svarede til plasma behandling tid anvendt med tørt foder gas betingelser. For fugtet feed gas betingelser, 20 s og 40 s behandling induceret en stærkere calreticulin eksponering i forhold til den mere dødbringende 60 s behandling tid. Dette tyder på der var en ikke-lineær regulering af calreticulin eksponering med hensyn til mængden af oxidanter introduceret til cellerne.
Figur 1 : Workflow af plasma medicinsk forskning fra fysik til biologi. Reaktive arter output af atmosfærisk tryk argon plasma jet er indstillet af modulerende den tilførte gas. Valgte molekyler i gasfasen plasma overvåges ved hjælp af spektroskopi. Plasmaet, der bruges til behandling af væsker og undersøge oxidant deposition. Celler dyrkes i mikroplader er plasma-behandlet, og biologiske udlæsninger udføres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Opsætning af plasma forskning bænk. (A) forskellige gasser i rustfrit stål rør er drevet ind i flere massestrøm controllere, der styres via en central panel. Enkelte feed gas sammensætning er blandet, derefter ved hjælp af et panel af ventiler. (B) visse reaktive komponenter af plasma kan overvåges ved hjælp af optisk emission spektroskopi til at undersøge forskelle mellem forskellige feed gas kompositioner. (C) For høj overførselshastighed plasma forskning, 96-brønd mikroplader bruges. For at sikre en konstant udgangspunkt for programmerbare og automatiseret plasma behandling, er pladen føjet til en ramme, der sikrer den samme absolutte position af plader fra dag til dag. (D) plasma jet er fastgjort til en computer-styrede xyz-tabel placeret under en laminar flow hætte. Alle 96 nøjagtige placeringer og hviletiden af plasma over hver er godt skrevet i en programfil til at guide bevægelsen af plasma kilde. De vigtigste indkapsling af plasma jet apparater samt den motoriske kontrol er beliggende i umiddelbar nærhed. (E) automatiseret plasma behandling af en 96-brønd plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Plasma jet og væske analyse. (A) Optical emission spektroskopi af forskellige feed gas betingelser er vist. Det andet positive system af kvælstof (330 nm til 380 nm) var steget med blanding af nitrogen, fraværende for ilt blanding, og markant reduceret med befugtet argon (lefthand paneler). Toppen af hydroxylradikaler på 309 nm (pil) faldt i kvælstof og ilt betingelser men markant øget med befugtet argon sammenlignet med argon gas alene. (B) Gas eksponering af væsker fører til fordampning. Mængden af fordampning pr. brønd i en 96well plade på behandling med plasma og argon gas alene var bestemmes ved vejning pladen før og efter behandling med et finskala. Fordampning i plasmatreated prøver var højere i forhold til det i argon gastreated prøver. (C) Generation af hydrogenperoxid i plasmatreated væsker korreleret til en vis grad med 309 nm toppen af hydroxylradikaler i (A). Fugtig (5%) argon plasma øget peroxid koncentrationer omkring 4fold. (D) nitrit var forhøjet når kvælstof blev føjet til den tilførte gas, og denne effekt var øget med befugtet argon plasma. Tilsætning af ilt faldt nitrit generation, men ikke signifikant. (E, F) Hydrogen Peroxid og nitrit koncentrationer er vist i forskellige typer af væsker, nemlig RPMI1640 cellekulturmedium med (R10F) og uden (R0F) samt PBS med og uden føtalt kalveserum (FCS). Peroxid niveauer afviger ikke mellem forskellige medier (E) mens nitrit niveauer var faldt betydeligt i tilstedeværelse af serum. (G) superoxid produktion var højest for tør argon gas feed gas; blanding af nitrogen, ilt eller befugtet argon gav lavere superoxid deposition i væsken. Data, der vises (B-G) er mean + SEM af to til tre forsøg. Statistiske analyser blev udført (C, D) ved hjælp af en-vejs variansanalyse sammenligne hele gruppen middel til tørt eller fugtigt foder gas vilkår mod de respektive kontrol (** p < 0,01; *** p < 0,001). Derudover argon gas-kun plasma betingelser blev sammenlignet ved hjælp af hele gruppen betyder og t-test (### p < 0,001). Yderligere statistisk analyse (F) blev udført ved hjælp af t-tests sammenligner værdierne for hver enkelt plasma behandling og medium tilstand i prøver med FCS og uden FCS (* p < 0,05; ** p < 0,01); også, FCS eller ikke-FCS indeholdende løsninger sammenlignet inden for hver enkelt plasma behandling tid ved hjælp af t-test (# p < 0,05; ## p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Plasma behandling og dens indvirkning på celler. (A) celler blev udsat for plasma og resazurin blev tilføjet efter 20 h at vurdere metaboliske aktivitet. (B) aktivitet var faldt betydeligt i plasmatreated prøver i forhold til gas kontrol. Et markant fald blev set med befugtning af den tilførte gas der henviser til, at tilsætning af ilt og/eller nitrogen fører til toksicitet i både tørre og fugtige argon gas betingelser. (C) Medium indeholdende propidium Iodid (PI) blev tilføjet. (D) en oversigt er vist af pladens huller med digital fasekontrast (orange) der repræsenterer det cytosole brøkdel af hver celle og PI (grøn) til at identificere døde celler. Tænkelig værktøj mulighed for kvantificering af det samlede areal inden for synsfeltet af hver godt dækket med celler. (F) celler blev efterfølgende vasket og inkuberes med antistoffer eller andre celle-markører til at karakterisere biologiske plasma effekter ved hjælp af flowcytometri. (G) Gating strategier blev ansat og markør analyse blev udført og sammenlignet mellem prøver. Data, der vises (B, E, H) betegne betyder + SEM af en repræsentant for tre uafhængige forsøg. Skalalinjen = 200 µm (D). Statistisk sammenligning blev udført ved hjælp af to-vejs analyse af varians (B, H) for hver gas betingelse, at sammenligne hver plasma behandling til sin respektive gas kontrol (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). Derudover værdier for hver betingelse af kvælstof og/eller ilt Tilslagsstoffer blev sammenlignet med værdierne af argon gasplasma for tørre og fugtige betingelser separat (tovejs-analyse af varians; ### p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Grundforskning er af afgørende betydning for at udvikle en forståelse af effekten af og mekanismer bag plasma medicin i prækliniske og kliniske forskning. Grundlæggende forskning fremmer også undersøgelse af nye ansøgninger for behandlinger. Mens det er godt etableret, at plasmaer mægle deres biologiske virkninger via generation af reaktive oxygen og nitrogen arter19, er der stadig tre vigtigste udfordringer til feltet. Først, hvilke arter er vigtige? Dette kan delvist besvaret af modulerende feed gas sammensætning af plasma-tv med optisk diagnostik og biologiske udlæsninger. 20 for det andet, hvilke virkninger kan ses i biologiske mål såsom celler? Dette behandles i det mindste delvis, ved hjælp af celle kultur eksperimenter og en række af assays. Eukaryote celler, virkninger er pleiotrope herunder celle cyklus anholdelse21, apoptose22, nekrose23, og hud celle stimulation24,25,26, såvel som en støtte eller nedsættelse af celle motilitet eller metaboliske aktivitet27,28,29. Den tredje udfordring, vedrører disse pleiotrope virkninger, er at identificere centrale molekyler, der bestemmer den cellulære reaktion på plasmaafledte oxidanter til at forklare forskellige virkninger ses ofte i forskellige celletyper. Dette kan gøres ved omik teknikker30,31,32 og/eller op eller downregulation af mål gener ved hjælp af siRNA (redox) signalering hæmmere, antioxidanter og antioxidant enzymer samt modulering af den plasma's reaktive arter output. 33 , 34 , 35 derfor, strømlinet assay protokoller for at teste større stikprøve sæt med stort antal gentagelser.
Denne undersøgelse er et eksempel på en effektiv eksperimentelle arbejdsgang, fra fysik til biologi, for plasma medicinsk forskning med hensyn til de førnævnte udfordringer. Detaljer om de tekniske aspekter af plasma kilde og plasma generation har været beskrevet før. 36 , 37 , 38 alle disse analyser er udført i 96well plader, som har en række fordele. For eksempel, kan prøver såsom celle kultur analysere nemt transporteres fra assay samling plader at efterforske, for eksempel, protein koncentrationer via enzym-forbundet-immunosorbent-assay. Hvis videnskabelige udstyr i stand til at læse direkte fra 96-brønde er tilgængelige, en sådan fremgangsmåde minimerer omkostningerne pr. sample og handsontime og maksimerer resultater af multiplexing forskellige assays fra samme prøve. Brugen af multikanal-din pipetter desuden hastigheder op prøve håndtering. I princippet kan analysen beskrives her også foretages ved hjælp af godt plade formater med større godt diametre, selv om dette ville kræve yderligere pipettering trin i andre rør og fartøjer til downstream assays. Mindre plade typer såsom 384well plader, dog fremlægge ikke geometri egnet til biomedicinsk plasma forskning ved hjælp af jetfly med store feed gas strømme. Specifikt, kan ikke det garanteres, at kun enkelt men ikke tilstødende brønde er berørt under en behandling.
Flydende analyse er afgørende for at undersøge arter deposition af plasma. I ekspertanalyser, kan en parallel installation af forskellige assays karakterisere plasmatreated væsker med hensyn til forskellige oxidanter på samme tid. Denne multiplexing giver mulighed for at udvikle et differentieret billede af plasmaderived arter. Den beskrevne fremgangsmåde er meget følsom over for undersøge hydrogenperoxid koncentrationer39, som er ofte nødvendig, men ikke altid tilstrækkelig til at forklare plasma effekter. 40 , 41 , 42 biologisk relevante virkninger kan også vurderes i væsker med en glutathion assay ikke inkluderet her. 43 specifikke nitrit assay anbefales kraftigt over konventionelle Griess-Assays på grund af 10fold højere assay følsomhed (data ikke vist). Plasmatreated væsker kan også undersøges for dannelsen af hypochlorsyrling ved hjælp af DTNB-analysen. Endnu, tidligere resultater ikke tydede dannelsen af denne art med vores plasma kilde. 19 , 39 , 44 efter plasma behandling er afsluttet, arter forringelse finder sted over tid. Nitrit reagerer på nitrat; også, peroxid er forbrugt over tid. Men disse processer tage flere timer. 35 cytokrom c absorption er stabil over flere timer så godt. Derfor, hvis processer forekomme inden for de første 30 min. efter behandling, variation i koncentrationerne af langlivede arter beskrevet her er ubetydelig. Dog skal udvises forsigtighed ved at undersøge visse former for medier (f.eks.Dulbeccos modificerede Eagle Medium) som ingredienser kan skyllepumpetab op til 90% peroxid inden for 1 h (data ikke vist) fører til en undervurdering af plasma peroxid deposition i væsker.
En multiplex assay er præsenteret som spænder fra undersøger metaboliske aktivitet over celle område (morfologi) til celle overflade markør udtryk. En kombination af disse assays kan afsløre interessante resultater. For eksempel, har vi tidligere vist i THP1 monocytter, metaboliske aktivitet og celle tæller ikke falde i et lineært efter udsættelse for plasma. 45 snarere, med stigende plasma indvirkningstid, celler blev observeret, blev øget i størrelse og havde en højere mitokondrie masse, hvilket fører til højere stofskifte på grundlag af percell. Det væsentlige, kombinationen af multiplate læser, mikroskopi og flowcytometri multiplex oplysninger på cellulære svar efter plasma behandling. I melanom celler fokuserer vi her på cytotoksiske virkninger og deres immunogenicitet medieret af calreticulin. 46 i princippet, mange andre spørgsmål kan løses med denne fremgangsmåde forbinder metaboliske aktivitet med billedbehandling og flow flowcytometri resultater. For eksempel, kan Celledifferentiering (fx makrofag polarisering), mitokondrielle membran potentiale, celle cyklus analyse, celle motilitet, biomekanik eller mikronucleusundersøgelse dannelse for analyse af genotoksicitet også blive undersøgt i plasma-behandlede celler. Flerfarvet flowcytometri giver mulighed for endnu flere ansøgninger i forskellige cellepopulationer på samme tid. Dette omfatter for eksempel, analyse af fosforylering status signalering proteiner som transskriptionsfaktorer, mRNA kvantificering, måling af intracellulære cytokiner, og/eller vurderingen af samlede reducerede dithioler på en enkelt celle niveau. Yderligere biologisk relevante oplysninger, der er tilgængelige for hver prøve aids i videreudvikling af billedet af plasma redox effekter til bedre at forstå aktuelle og fremtidige plasma applikationer.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering fra de tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (BMBF tildele numre 03Z22DN11 og 03Z22DN12) er taknemmeligt erkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| accutase | BioLegend | 423201 | |
| amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
| argon gas | Air Liquide | N50 | |
| B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
| catalase | Sigma | C30 | |
| cell culture incubator | Binder | CB210 | |
| cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
| cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
| data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
| fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
| fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
| flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
| flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
| Glutamine | Sigma | G7513 | |
| imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
| laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
| mass flow controller | MKS | G-series | |
| Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
| microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
| optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
| penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
| pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
| plate reader | Tecan | M200pro | |
| propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
| resazurin | VWR | B21187.06 | |
| RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
| xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |
References
- Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11 (6), 431-438 (2003).
- Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3 (1), 23-34 (2010).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
- Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16 (11), 1212-1214 (2012).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82 (6), 1223-1237 (2010).
- Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4 (1), 19-28 (2016).
- Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
- Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11 (9), 0160667 (2016).
- Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18 (4), 868 (2017).
- Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19 (13), 1539-1605 (2013).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29 (1), 52-56 (2012).
- Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29 (1), 148-155 (2015).
- Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167 (2), 404-410 (2012).
- Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7 (12), 52653 (2012).
- Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
- Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8 (12), 81576 (2013).
- Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3 (2), 42-52 (2015).
- Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40 (11), 2986-2993 (2012).
- Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12 (12), 1354-1363 (2015).
- Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3 (1-2), 71-80 (2013).
- Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112 (9), 1536-1545 (2015).
- Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (3), 0120041 (2015).
- Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49 (3), 035401 (2016).
- Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
- Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3 (1), 24-31 (2015).
- Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38 (3), 748-757 (2010).
- Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26 (2), 156-162 (2017).
- Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3 (1-2), 81-95 (2013).
- Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13 (12), 1179-1188 (2016).
- Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1 (1), 55-63 (2011).
- Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
- Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25 (9), 1523-1531 (2014).
- Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47 (28), 285401 (2014).
- Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46 (43), 435203 (2013).
- Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13 (11), 1120-1127 (2016).
- Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49 (9), 631-640 (2009).
- Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48 (5), 542-549 (2014).
- Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
- Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100 (4), 791-799 (2016).
- Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6 (82), 78457-78467 (2016).
- Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3 (4), 267-278 (2013).
- Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10 (2), 029518 (2015).
- Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13 (1), 54-61 (2007).
