Summary
이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.
Abstract
종양 세포의 침입과 마이그레이션 능력 암 진행 및 재발 주 기여자입니다. 많은 연구는 새로운 치료 전략을 개발 하는 것을 목적으로, 암 세포 전파 하는 방법을 이해 하려면 마이그레이션 및 내 습 능력 탐험 있다. 이러한 능력의 세포질과 분자 기초의 분석 세포 이동성의 특성화 및 골격 및 세포 microenvironment의 물리 화학적 특성을 주도하 고 있다. 몇 년 동안, Boyden 챔버 분석 결과 스크래치 상처 분석 결과 표준 기술을 공부 셀 침공 및 마이그레이션 되었습니다 합니다. 그러나,이 두 기술에는 제한이 있습니다. Boyden 챔버 분석 결과 어렵고 시간 소모, 그리고 스크래치 상처 분석 결과 낮은 재현성. 현미경 검사 법에 특히 현대 기술의 개발은 스크래치 상처 분석 결과의 재현성을 증가 했다. 강력한 분석 시스템을 사용 하 여, 세포 이동과 내 습의 자동 및 실시간 분석을 제공 하는 "인큐베이터" 비디오 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 문서의 목표는 보고 하 고 셀 침공 및 마이그레이션 공부 하는 데 사용 하는 두 분석 비교: Boyden 챔버 분석 결과는 최적화 된 생체 외에서 비디오 현미경-기반 스크래치 상처 분석 결과.
Introduction
셀 침공 및 마이그레이션 저항 처리1 의 주요 원인, 암 세포의 보급에 참여 하 고 locoregional 또는 전이성 재발 암 치료2후 발생할 수 있습니다. 상피 엽 전환 (응급) 셀 침공-마이그레이션은 암에서 세포에서 전환 상피는 엽 형의 초기 과정입니다. E-Cadherin 상피 형3의 extracellular 마커 이며 N cadherin vimentin의 증가 식 엽 형4의 특징입니다. 또한 마이그레이션 매트릭스 metalloproteases5의 행동을 통해 기질 (ECM)을 침략 암 세포의 내장 용량에 의존 한다.
이 침공-마이그레이션 메커니즘, 머리와 목 암6특히 여러 위치에서 암에 대 한 설명 하고있다. 많은 연구원은 암 세포가이 지식 새로운 치료 전략으로 이어질 것입니다 희망에서 보급 하는 방법을 더 잘 이해 하려면 마이그레이션 및 내 습 프로세스에 집중 했다. 그것은 중요 이러한 연구 신뢰성 및 재현성 분석 실험을 사용 하 여 수행 됩니다.
체 외에서 세포 운동 성의 분석 전하실 수 있습니다. 몇 년 전 개발, Boyden 챔버 분석 결과 침공-마이그레이션 분석7에 대 한 표준으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 시간이 소요 이며 자주 정확 하지 않다. 두 번째 테스트는 상처 치유 분석 결과8, 세포 단층 배양에 스크래치를 하 고 세포 내 습 및 마이그레이션 고정된 시간 간격의 이미지를 캡처입니다. 이 기술은 두 개의 연속 된 테스트의 결과 사이 큰 변이 때문에 넓게 강평 되었다. 그러나, 현미경에서 특히 현대 기술의 응용 프로그램 스크래치 상처 분석 결과의 재현성을 개선 했다. 비디오 현미경 인큐베이터에서 쉽게 도입 될 수 있는 고 셀 이동의 실시간 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 소자는 현미경 데이터를 기록 하 고 시간이 지남에 상처 셀 합류의 자동 분석을 제공. 이 문서의 목표는 Boyden 챔버 분석 결과 최적화 된 스크래치 상처 분석 결과 설명 하 고 장점과 각 방식의 약점을 논의 하기 위해.
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Protocol
참고: ECM의 포함 없이 Boyden 챔버와 스크래치 분석 실험 이라고 마이그레이션 분석 결과, 그리고 ECM과 같은 분석을 침공 분석 결과 라고.
1. Boyden 챔버 분석 결과
참고:이 프로토콜은 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 후 두 암에서 파생 되 고 존에서 얻은 SQ20B의 셀 라인에 맞게 작은 (보스턴, 메사추세츠, 미국).
주 1
-
시드 셀
- 시드 2 106 SQ20B 175 cm2 플라스 크 하루 전에 72 h에에서 문화 매체 (CM)의 12 mL에서 세포 고 80% 셀 합류에 성장 하는 세포.
- SQ20B 셀에 대 한 CM을 준비, 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM)을 보충.
- 층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거 하 고 세척 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 셀 trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.5 g/L)의 2.5 mL을 추가. 37 ° C에서 5 분에 대 한 셀을 품 어 한 다음 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 12.5 mL을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
- 평가를 각 상태에 대 한 6 105 셀의 셀 밀도에서 25 cm2 플라스 크에 세포 씨앗 CM의 3 ml에서 24 h에 대 한 셀을 품 어.
- 시드 2 106 SQ20B 175 cm2 플라스 크 하루 전에 72 h에에서 문화 매체 (CM)의 12 mL에서 세포 고 80% 셀 합류에 성장 하는 세포.
주 2
-
셀 기아와 코팅된 챔버의 준비
- FBS 대신 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 매체의 3 mL와 함께 각 플라스 크에 매체를 대체 하 여 세포를 굶 어. 인큐베이터에서 24 h에 대 한 셀을 굶 어.
- 기아 CM (s-CM) 준비, 0.1 %BSA, 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 DMEM 보충.
- 마이그레이션 분석 결과 대 한 단계로 1.3 이동 합니다.
- 침공 분석 결과 대 한 3 년 전에 12 h 500 μ s-CM의 각 코팅된 챔버를 추가 하 여 코팅된 Boyden 챔버를 준비 합니다. 상업적으로 준비 된 코팅된 Boyden 챔버를 사용 하 고 사용 하기 전에 4 ° C에서 그들을 유지. 동반자 접시에 각 Boyden 챔버를 놓고 하룻밤 37 ° c 배양 기에서 그것을 설정 합니다.
- FBS 대신 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 매체의 3 mL와 함께 각 플라스 크에 매체를 대체 하 여 세포를 굶 어. 인큐베이터에서 24 h에 대 한 셀을 굶 어.
3 일
-
Boyden 챔버에 시드 셀
- 동반자 플레이트를 사용 하 여 준비 하는 chemoattractant. 각 채우기와 10 %FBS, 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린, 0.1 g/L 스 완전 한 매체의 750 μ와 24-잘 동반자 판의 잘.
- 각 셀 라인 및 각 치료 상태에 대 한 chemoattractant를 적응. Chemoattractant CM (ca-CM)를 준비 하려면 10 %FCS, 0.4 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린과 0.1 g/L 스 DMEM 보충.
- 거품을 피하기 위해 돌보는 prefilled 동반자 접시에 상단 챔버를 전송 합니다.
- 침공 분석 결과 대 한 조심 스럽게 각 Boyden 상공에서 450 μ M의 제거.
- 층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거, 살 균 PBS로 세포 세척, trypsin EDTA (0.5 g/L)의 0.5 mL을 추가 및 다음 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어 CM 37 ° c 예 열을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
- 6 104 셀/mL의 최종 희석 주는 0.1 %BSA 매체의 500 μ에 시드 3 104 SQ20B 셀.
참고: 셀 농도 각 셀 라인에 대 한 적응 한다. - 24 h에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 동반자 플레이트를 사용 하 여 준비 하는 chemoattractant. 각 채우기와 10 %FBS, 0.04 mg/mL 날린, 100 U/mL 페니실린, 0.1 g/L 스 완전 한 매체의 750 μ와 24-잘 동반자 판의 잘.
4 일
-
셀 고정 및 얼룩
- 셀 라인에 배 시간 전에 셀을 수정 합니다. 24 시간 전에 SQ20B 셀을 수정 합니다.
- 각 삽입 동반자 접시에서 제거 하 고 조심 스럽게 면봉을 사용 하 여 상단 챔버에서 셀을 제거. 그것은 특히 위 약 실에 있는 모든 셀을 제거 하는 것이 중요입니다.
- 수정 및 얼룩 얼룩 키트 제공을 사용 하 여 5 월 Grunwald Giemsa 채색9 를 개별적으로 삽입 합니다. 또는 30 분 고정을 위한 또 다른 동반자 접시에 4 %paraformaldehyde 사용.
- 각 약 실 건조 실험실 후드 빈 24 잘 동반자 플레이트 삽입 하십시오.
5 일째
-
현미경 분석
- 20 단계 대조 현미경에 삽입과 함께 동반자 플레이트를 삽입 하 고 막의 아래 부분에 마이그레이션된 각 셀을 계산. 상단, 하단에서 목표를 이동 하 여 오른쪽 초점 위치를 최적화 하 고 막의 하단 부분에 위치를 중지.
- 마이그레이션된 세포의 숫자와 시드 셀 사이의 비율을 계산 합니다. 3 중에서 각 치료 상태에 대 한 각 계산을 반복 합니다.
2. 스크래치 상처 분석 결과: 셀 마이그레이션
참고: 지침 셀의 각 유형에 적응 해야 합니다.
주 1
-
시드 셀
- 시드 2 x 106 SQ20B 175 cm2 플라스 크 하루 전에 72 h에에서 CM의 12 mL에서 세포 고 80% 셀 합류에 성장 하는 세포.
- 층 류 흐름 후드 셀 trypsinize. 매체를 제거 살 균 PBS로 세포 세척, trypsin EDTA (0.5 g/L)의 2.5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 12.5 mL을 추가 하 여 반응을 중지합니다 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
- 각 잘에서 100 μ 당 4 104 셀의 최종 밀도 주는 4 x 105/mL의 셀 밀도에서 prediluted 샘플을 생성 합니다. 이 농도 각 셀 라인에 맞게 조정 해야 합니다 그리고 1 x 104 6 104 셀의 범위에서 해야 한다.
- 2.1.2 단계에서 준비 하는 솔루션의 입금 100 μ에 의해 96 잘 접시의 각 음에 시드 셀.
- 우물의 바닥에는 셀을 균등 하 게 분산을 5 분 동안 실 온에서 접시를 남겨 주세요.
- 인큐베이터에 접시를 놓고 12 ~ 16 h (최대) 37 ° c.에 대 한 플레이트에 셀 수
주 2
-
스크래치 상처 분석 결과
- 인큐베이터에서 2.1 단계에서 준비 된 접시를 제거 합니다.
- 후드, 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 부상 장치를 사용 하 여 상처를 확인 합니다.
- 즉시 각 잘 사용 하는 피 펫을 상처를 건드리지 않도록 돌보는 적응 원추형 팁에서 매체를 제거 합니다.
- 포부를 반복 하 고 각 잘 37 ° C로 예 열 하는 CM의 100 μ를 사용 하 여 두 번 셀을 씻어.
- CM 세척 단계 후 적응 원추형 팁을 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.
- 각 잘 각 치료 조건에 대 한 특정 매체의 100 μ 추가.
- 우물에서 모든 거품을 만들지 않도록 하려고 합니다. 반대로 pipetting 기술은 여기 도움이 될 수 있습니다. 또는, 주사기 바늘으로 거품을 제거 합니다.
- 비디오 현미경의 적응 랙에 접시를 놓습니다.
- 이미지 품질을 개선 하기 위해 접시의 더 낮은 측에 응축을 피하기 위해 첫 번째 검사 전에 적어도 15 분 동안 따뜻한 접시 허용.
- 프로그램 잘 당 하나의 이미지에 비디오 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 검사의 일정. 2 h 간격 침공 마이그레이션 실험 필요 하다. 실험의 목표는 비디오를 생성 하는, 최대 30 분의 간격이 좋습니다.
- 실험의 끝에, 신중 하 게 부상 장치를 세척 하 고 각 제조 업체에 의해 표시 된 4 개의 세척 단계를 따르십시오.
3, 4, 및 5 일
-
비디오 현미경을 사용 하 여 마이그레이션 분석
- 24 h 및 최대 5 일의 최소, 모니터링 하 고 셀 마이그레이션을 확인 합니다.
- 각 셀 형식에 맞게 적절 한 셀 마스크를 사용 하 여 셀 마이그레이션 분석. 각 셀 라인에 맞게 셀 마스크를 얻기 위해 특정 셀 이미지 컬렉션을 사용 하 여 소프트웨어에서 정의 처리 하는 셀을 생성 합니다.
- 곡선을 추적 하 고 데이터를 분석 하 고 결과 비교 하 여 사용할 수 있는 스프레드시트를 내보낼.
3. 스크래치 상처 분석 결과: 셀 침공
참고: 지침 셀의 각 유형에 적응 해야 합니다.
주 1
-
시드 셀
- 동일한 프로토콜을 사용 하 여 셀 시드의 단계 2.1에에서 설명 된 대로.
주 2
-
ECM을 준비
- 4 ° c.에 사용 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 행렬에 서 리 없애다 없음 집계 표시는 다는 것을 확인 하십시오. 집계 표시 되는 경우는 집계 사라질 때까지 오랜 기간 동안 4 ° C에서 매트릭스를 유지. 얼음에 매트릭스를 유지. Precooled 피 펫 팁을 사용 합니다.
참고: 매트릭스 응고 됩니다 하지 않을 경우 4 ° c.에 유지 - 5 분 동안 얼음에 microcentrifuge 튜브를 진정.
- 받아 CM 냉장고에서 4 ° C에 냉각 그리고 300 μ g/mL의 최종 농도를 precooled microcentrifuge 관에 행렬을 희석.
- Prediluted 매트릭스 microcentrifuge 튜브 4 ° c.에 냉장고에 반환
참고: 냉각 랙 microcentrifuge 튜브에 대 한 적응은 실험을 통해 4 ° C에서 튜브를 유지 도움이 됩니다.
- 4 ° c.에 사용 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 행렬에 서 리 없애다 없음 집계 표시는 다는 것을 확인 하십시오. 집계 표시 되는 경우는 집계 사라질 때까지 오랜 기간 동안 4 ° C에서 매트릭스를 유지. 얼음에 매트릭스를 유지. Precooled 피 펫 팁을 사용 합니다.
주 2
-
스크래치 상처 분석 결과 및 ECM의 치료
- 인큐베이터에서 3.1 단계에서 준비 된 접시를 제거 합니다.
- 후드, 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 부상 장치를 사용 하 여 상처를 확인 합니다.
- 즉시 각 잘 사용 하는 피 펫을 상처를 건드리지 않도록 돌보는 적응 원추형 팁에서 매체를 제거 합니다.
- 열망 절차를 반복 하 고 37 ° c.로 예 열 하는 CM의 100 μ를 사용 하 여 두 번 셀을 씻어
- 두 번째 세척 후 5 분 동안 그것의 온도 equilibrate에 4 ° C 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 원추형 팁, 가장자리에서 신중 하 게 플라스틱을 상처를 만지지 마십시오 돌보는 포부 피펫으로 각 잘에서 차가운 매체를 제거 합니다.
- Prediluted 매트릭스의 50 μ를 4 ° c.에 precooled 원추형 팁을 사용 하 여 각 영역 추가
- 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
참고: 37 ° C에서 prewarmed 지원 랙 96 잘 접시의 온난화 가속 도움이 됩니다. - 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 각 치료 조건에 대해 표시 된 대로 각 잘 적응된 CM의 100 μ 추가.
- 우물에서 모든 거품을 만들지 않도록 하려고 합니다. 반대로 pipetting 기술은 여기 도움이 될 수 있습니다. 또는, 주사기 바늘으로 거품을 제거 합니다.
- 비디오 현미경에 맞게 선반으로 접시를 놓습니다.
- 이미지 품질을 개선 하기 위해 접시의 더 낮은 측에 응축을 피하기 위해 첫 번째 검사 전에 적어도 15 분 동안 따뜻한 접시 허용.
- 프로그램 스캔, 비디오 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 스크래치 상처 스캔 모드에서 잘 당 하나의 이미지에서의 일정. 2 h 간격 침공 마이그레이션 실험에 대 한 필요합니다. 실험의 목표는 비디오를 생성 하는, 최대 30 분의 간격이 좋습니다.
- 실험의 끝에, 신중 하 게 부상 장치를 세척 하 고 각 제조 업체에 의해 표시 된 4 개의 세척 단계를 따르십시오.
3, 4, 및 5 일
-
비디오 현미경을 사용 하 여 셀의 분석입니다.
- 2.3 단계를 반복 합니다.
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Representative Results
우리 보고 여기 셀 침공 및 마이그레이션 분석을 두 가지 방법. 그림 1 는 Boyden 챔버 실험을 보여준다. 셀은 CM에 시드와 삽입 chemoattractant 매체와 동반자 접시에 배치 됩니다. 막 코팅 수 (마이그레이션 분석 결과) 또는 코팅 (침공 분석 결과). 셀은 s c M에 상단 챔버로 시드. 낮은 챔버는 chemoattractant으로 CM으로 가득 합니다. 셀 2 배 시간 전에 고정 됩니다.
그림 2 는 셀 고정 후 Boyden 멤브레인을 보여준다. 그림 2A 는 차선의 결과, 막의 상부에 셀 클러스터를 보여 줍니다. 그림 2B 셀 고정 하 고 막에 청색으로 얼룩진 최적의 결과 보여줍니다.
그림 3 에 스크래치 상처 분석 결과의 최적의 결과 보여 줍니다. 그림 3A에서 선형 상처를 볼 수 있습니다. 셀은 상처, 관찰 하 고 30 h 이내 발생 한 상처 치유. 상처를 치유 하는 시간 셀 라인 50 h 24에서 범위에 따라 달라 집니다.
그림 3B 는 아래 4 가지 치료 상태를 치유 하는 상처의 그래픽 표현: 제어, ABT-199 (안티-Bcl-2), cetuximab (안티-EGFR), 및 ABT-199 + cetuximab. ABT-199 + cetuximab 조합 크게 감소 셀 마이그레이션. 곡선 시간 셀 이동의 강력한 데이터 분석을 제공 하는 비디오 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 오차 막대는 각 음에 대 한 표준 편차 (SD)를 나타냅니다.
90% 합류 상처 치유 분석 결과 대 한 최적의 셀 밀도입니다. 최적의 셀 시드 셀 라인에 의존 하 고 6 x 104 셀에 3 x 104 에서 범위. 그림 4A 최적의 셀 밀도 표시 하 고 그림 4C 낮은 세포 밀도 보여줍니다. 웰 스 그림 4B에서 같이 두 번을 셀 클러스터를 피하기 위해 세척 되어야 한다.
그림 1: Boyden 챔버 실험의 도식 대표. 셀은 CM에 시드와 삽입 chemoattractant 매체와 동반자 접시에 배치 됩니다. 막 코팅된 (A) 또는 코팅된 (B) 수 있습니다.
그림 2: 차선 및 최적의 현미경 결과 얻은 Boyden 챔버 실험. (A) 경우일 결과 고 막의 상부에 셀 클러스터와 차선 막. 눈금 막대 300 µ m. (B) 최적 막 파란색에서 스테인드 막의 아래 부분에 셀 수 있는 셀을 =. 눈금 막대 = 300 µ m.
그림 3: 최적의 결과 얻은 상처 치유 실험. (A) 상처 치유 0, 15, 및 30 h에서 표시 스크래치 상처 분석 결과에서 대표 이미지. 품질 실험에 대 한 기준을 선형 상처 아무 세포 파편 상처, 그리고 최적의 셀 합류에 관찰. 눈금 막대 = 300 µ m. (B)의 그래픽 표현을 상처 치유의 시간 (h)에 따라 상처 셀 합류 (백분율) 매개 변수의 정량화를 보여주는. 4 치료 조건 여기, 분석 하 고 데이터는 sd. 함께 표시 됩니다.
그림 4: 차선의 결과 얻은 상처 치유 실험. (A) 이상적인 셀 밀도입니다. (B) 문제 셀 펠 릿을 세척. (C) 낮은 세포 밀도입니다. 스케일 바 = 300 µ m
| 장점 | 단점 | |
| Boyden 챔버 실험 | -3D 셀 Chemotaxis | -소모 |
| -모두 내 습 및 코팅 및 비 코팅 층 매트릭스와 마이그레이션 | -낮은 재현성 | |
| -비싼 삽입 | ||
| -시간 경과 탐사 | ||
| -부착 세포의 필요 | ||
| 상처 치유 분석 결과 | -자동 매우 재생 가능한 상처 | -2D 세포 운동 성 |
| -모두 내 습 및 코팅 및 비 코팅 층 매트릭스와 마이그레이션 | -부착 세포의 필요 | |
| -세포 증식 분석에 포함 | ||
| -시간 경과 현미경 영상 분석 | ||
| -정확한 분석으로 상처 치유 통계의 데이터 수출 | ||
| -후 처리 셀 이동과 침략 곡선에 대 한 강력한 소프트웨어 |
표 1:는 Boyden의 장점 및 단점 챔버 실험 및 비디오 현미경 상처 치유 분석 결과. Boyden 챔버의 장단점 실험 그리고 스크래치 상처 분석 결과.
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Discussion
우리 보고 여기 두 다른 modalities 셀 침공 및 마이그레이션 과정을 공부 합니다. 이 프로세스의 분석은 암 줄기 세포10,11이라고 하는 암 세포의 부분 모집단의 증가 운동에 의해 설명 될 수 있는 전이성 재발에 관련 된 요소를 이해 해야 합니다.
Boyden 챔버 실험은 가장 자주 사용 되는 기술을 탐구 하 세포 내 습 및 마이그레이션. 이 기술은 높은 실험의 전문성에 의존 하지만이 방법의 장점 중 하나는 재현성 이다. 셀 계산 수동 이며 경험 사이 다를 수 있습니다. 많은 중요 한 단계 표준화 하 고 뒤에 각 셀 라인에 적절 한 chemoattractant 및 기아 매체의 사용을 보장 하는 등 주의 해야 합니다. 면봉으로 위 막에서 세포를 제거 하는 것이 또한 최적의 결과 보장 하 고 그림 2A에 표시 된 차선 결과 피하에 중요 합니다. 세포 운동 성, 침략, 및 3 차원 (3D) 다공성 멤브레인 통해 마이그레이션 용량이 분석이 결과 사용 하는 경우 추적 경과 실험을 통해 셀 수는. 또한, 다공성 막으로 상업 삽입 종종 비싼 있습니다.
여기에 제시 된 비디오 현미경-기반 스크래치 상처 분석 결과 셀 마이그레이션 및 침략을 평가 하는 강력한 기술입니다. 분석 결과 기계적 상처 메이커로 수행 되 고 치료 조건 재현 비교를 제공 합니다. 비디오 현미경 분석 시간 경과 실험을 통해 상처 치유 및 셀 합류에 대 한 정확한 양적 데이터를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다른 처리 조건의 시간 분석 현미경 관찰에 의해 뒷받침 될 수 있다. 이 분석 분석 결과 중 세포 증식을 통합 하 고 셀 배로 시간을 고려. 비디오 또는 원시 데이터 콘텐츠 셀 마이그레이션 곡선 그림 3B에서 같이 매우 시각적 결과를 내보낼 수 있습니다.
많은 중요 한 단계 해석할 결과 얻기 위해 필요 합니다. 시드 셀에 대 한 최적의 조건 셀 라인에 의존 하 고 다른 희석 우물에서 90% 셀 합류를 테스트 해야 합니다. 선형 상처를, 셀 도금 16 h을 초과 하지 않아야 합니다. 세척 단계 수행 되어야 합니다 두 번 빠르게 결과 변경할 수 있는 상처에 소개 하는 세포 파편을 피하기 위해. 침공 스크래치 상처에 대 한 적절 한 ECM 치료 또한 중요 한 단계가입니다. 냉각 속도 일정 해야 하 고 ECM를 냉장된 피 펫 팁 조작 4 ° c.에 유지 한다
이러한 기술은 표 1에 요약 되어 있는 많은 이점이 있다. 부착 세포가 기술이 필요 합니다. 셀에 원인 기계적 상해를 긁는 셀룰러 내용의 릴리스 주위 매체에 원인과 마이그레이션 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 스크래치 상처 분석 결과 셀 chemotaxis,이 기술을 사용 하 여 공부 될 수 없습니다 하지만 2D 셀 운동 성의 견적을 제공 합니다. 최근 상업 도금 시스템을 사용 하 여 비디오 현미경 chemotaxis 분석 결과 개발 했습니다. 이 분석 결과 앞에서 설명한12암 줄기 세포와 같은 높은 마이그레이션 능력을 가진 세포를 필요로 한다. 이 새로운 기술은 미래에 침공 마이그레이션 분석 실험에 대 한 황금 표준을 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 기술은 LabEx 소수 (ANR-11-LABX-0063), 뚜 (CPER 2009-2013 년), 그리고 서 정시 그랜트 잉카-DGOS-4664의 과학적 프레임 워크 내에서 성립 계획 Etat 지역 (CPER)의 지원으로 개발 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
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