Summary
המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.
Abstract
היכולות הפלישה והעברה של תאים סרטניים הם התורמים העיקריים התקדמות סרטן, מופע חוזר. מחקרים רבים בחנו את יכולות העברה ופלישה להבין איך להפיץ תאים סרטניים, במטרה לפתח אסטרטגיות טיפול חדשות. ניתוח של הבסיס תאית ומולקולרית של היכולות הללו הוביל אפיון תא ניידות ואת המאפיינים physicochemical של שלד התא, microenvironment הסלולר. במשך שנים רבות, וזמינותו קאמרית בוידן ואת וזמינותו פצע שריטה כבר הטכניקות רגיל ללמוד תא הפלישה והעברה. עם זאת, אלה שתי טכניקות יש מגבלות. וזמינותו קאמרית בוידן קשה וצורכת זמן, ויש וזמינותו פצע שריטה הפארמצבטית נמוכה. התפתחות הטכנולוגיות המודרניות, במיוחד במיקרוסקופ, הגבירה את הפארמצבטית של פצע שריטה וזמינותו. באמצעות מערכות ניתוח רב-עוצמה, מיקרוסקופ וידאו "בחממה" יכול לשמש כדי לספק וניתוח אוטומטי בזמן אמת של נדידת תאים, הפלישה. מטרת מאמר זה היא לדווח ולהשוות את מבחני שני חקר התא הפלישה והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן וטיוטה אופטימיזציה במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ פצע וזמינותו.
Introduction
תא הפלישה והעברה מעורבים להפצת תאים סרטניים, אשר מהווה את הגורם העיקרי של התנגדות טיפול1 והוא יכול להוביל locoregional או הישנות גרורתי לאחר סרטן טיפול2. המעבר אפיתל-mesenchymal (החובשים) הוא התהליך הראשוני של הפלישה-נדידת תאים שבה סרטן תאים להחליף בין אפיתל הפנוטיפ mesenchymal. E-קדהרין הוא סמן חוץ-תאי של פנוטיפ אפיתל3, ביטוי מוגבר של N-קדהרין, vimentin היא תכונה של פנוטיפ mesenchymal4. ההעברה תלויה גם הקיבולת מהותי של תאים סרטניים לפלוש מטריצות (ECM) דרך הפעולה של מטריקס metalloproteases5.
מנגנון ההעברה – הפלישה זה תואר לסרטן במקומות רבים, בפרט סרטן הראש והצוואר6. חוקרים רבים התמקדו תהליכי ההעברה ופלישה כדי להבין טוב יותר כיצד תאים סרטניים להפיץ בתקווה כי הידע הזה יוביל אסטרטגיות טיפול חדשות. זה הכרחי כי מחקרים אלה מבוצעות באמצעות מבחני לשחזור ואמין.
ניתוח במבחנה של תנועתיות התא יכול להיות מאתגר. שפותחה לפני שנים רבות, וזמינותו קאמרית בוידן נחשב להיות הסטנדרט עבור ניתוח הפלישה – הגירה7. עם זאת, זהו זמן רב והוא לעיתים קרובות לא מדויק. בדיקה נוספת היא ריפוי פצע assay8, אשר כרוך ביצוע שריטה על תרבות חד שכבתי תא לכידת תמונות של תא הפלישה והעברה במרווחי זמן קבועים. טכניקה זו ביקורת נרחב בגלל הווריאציות גדול בין התוצאות של שתי בדיקות רצופות. עם זאת, היישום של טכנולוגיות מודרניות, במיוחד במיקרוסקופ, השתפרה את הפארמצבטית של פצע שריטה וזמינותו. מיקרוסקופ וידאו יכול להיות בקלות הציג חממות, ניתן להפיק תמונות בזמן אמת של נדידת תאים. התקנים אלה להקליט נתונים מיקרוסקופיים, מספקים ניתוח אוטומטי של הפצע תא זרימה לאורך זמן. מטרת המאמר היא לתאר וזמינותו קאמרית בוידן ואת וזמינותו פצע שריטה ממוטבת, כדי לדון את היתרונות והחסרונות של כל גישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מבחני לשכת ולגרד בוידן ללא הכללת ECM מכונים וזמינותו ההעברה, מבחני אותו באמצעות ECM נחשבת וזמינותו הפלישה.
1. בוידן קאמרית Assay
הערה: פרוטוקול זה הוא מותאם הקו תא SQ20B, אשר נגזר חוזרים ונשנים הראש, הצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) סרטן בגרון היה המתקבלים ג'ון הקטן (בוסטון, שמימנה).
יום 1
-
תא זריעה
- זרע 2 106 SQ20B תאי ב 12 מ של תרבות בינוני (ס מ) בקבוקון2 175 ס' ' מ 72 h לפני היום הראשון ולאפשר לתאים לגדול 80% תא הנהרות.
- כדי להתכונן ס מ SQ20B תאים, תוספת בינוני נשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% עגל עוברית סרום (FCS), הידרוקורטיזון 0.04 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 0.1 g/L סטרפטומיצין.
- תחת תא למינארי, trypsinize את התאים. להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם סליין סטרילי באגירה פוספט (PBS) ולהוסיף 2.5 מ של טריפסין ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (0.5 g/L). דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולעצור את התגובה על-ידי הוספת מ"ל של ס מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. לספור את מספר תאים באמצעות מונה התא.
- זרע תאי בקבוקון2 25 ס מ- צפיפות התאים של 6 105 תאים עבור כל תנאי להערכה. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב- mL 3 ס מ.
- זרע 2 106 SQ20B תאי ב 12 מ של תרבות בינוני (ס מ) בקבוקון2 175 ס' ' מ 72 h לפני היום הראשון ולאפשר לתאים לגדול 80% תא הנהרות.
יום 2
-
תא הרעבה והכנה של צ'יימברס מצופה
- להרעיב את התאים על-ידי החלפת את בינוני את הבקבוק. כל 3 מ"ל של בינוני נמוך-עוברית סרום שור (FBS) באמצעות 0.1% אלבומין שור (BSA) במקום FBS. להרעיב את התאים עבור 24 שעות ביממה בחממה.
- כדי להכין הרעבה ס"מ (s-ס"מ), תוספת DMEM עם 0.1% BSA, הידרוקורטיזון 0.04 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 0.1 g/L סטרפטומיצין.
- עבור ההעברה וזמינותו, עבור לשלב 1.3.
- על הפלישה וזמינותו, 12 שעות לפני יום 3, להכין הצ'יימברס בוידן מצופה על-ידי הוספת μL 500 ס מ- s לכל תא מצופה. השתמש בכדורי צ'יימברס בוידן מצופה ולשמור אותם ב 4 ° C לפני השימוש. למקם כל חדר בוידן בצלחת לוויה ולהגדיר אותו בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להרעיב את התאים על-ידי החלפת את בינוני את הבקבוק. כל 3 מ"ל של בינוני נמוך-עוברית סרום שור (FBS) באמצעות 0.1% אלבומין שור (BSA) במקום FBS. להרעיב את התאים עבור 24 שעות ביממה בחממה.
יום 3
-
תא זריעה בבית הבליעה בוידן
- השתמש את הצלחת נלווה כדי להכין את chemoattractant. למלא כל אחד טוב של צלחת 24-ובכן לוויה עם 750 μL בינוני מלא עם 10% FBS, הידרוקורטיזון 0.04 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 ו- 0.1 g/L סטרפטומיצין.
- להתאים את chemoattractant עבור כל שורה התא ואת כל תנאי הטיפול. כדי להכין את chemoattractant ס"מ (ca-ס"מ), תוספת DMEM עם 10% FCS, הידרוקורטיזון 0.4 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 0.1 g/L סטרפטומיצין.
- העברה לתא העליון המשקולת לוויה שמולאו מראש, מקפיד להימנע בועות.
- על הפלישה וזמינותו, בזהירות הסר μL 450 ס מ בכל תא בוידן.
- תחת תא למינארי, trypsinize את התאים. להסיר המדיום, לשטוף את התאים עם PBS סטרילי, להוסיף 0.5 מ של טריפסין EDTA (0.5 g/L) ולאחר מכן דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה על ידי הוספת ס מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. לספור את מספר תאים באמצעות מונה התא.
- הזרע 3 104 SQ20B תאים μL 500 של 0.1% BSA בינוני, נותן לדילול הסופי של 6 104 תאים/מ ל....
הערה: ריכוז התא צריך להתאים עבור כל קו תא. - מקם את הצלחת לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- השתמש את הצלחת נלווה כדי להכין את chemoattractant. למלא כל אחד טוב של צלחת 24-ובכן לוויה עם 750 μL בינוני מלא עם 10% FBS, הידרוקורטיזון 0.04 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100 ו- 0.1 g/L סטרפטומיצין.
יום 4
-
קיבוע תא ולא מכתים
- לתקן את התאים לפני הזמן ההכפלה ספציפי לשורה הזו התא. לתקן תאים SQ20B לפני 24 שעות.
- הסר כל מהצלחת לוויה, הסר בזהירות את התאים מהתא העליון באמצעות מקלון צמר גפן. זה חשוב במיוחד להסיר את כל התאים ממוקם בחדר העליון.
- תיקון, הכתם הכנס בנפרד כדי להשיג מאי-גרונוולד Giemsa הגיוון9 באמצעות ערכת מכתימים מסופקים. לחלופין, השתמש 4% paraformaldehyde בצלחת לוויה נוספת עבור אובססיה 30 דקות.
- שמור את הכיסויים צלחת ריקה לוויה 24-ובכן תחת ברדס מעבדה להתייבש כל תא.
יום 5
-
ניתוח מיקרוסקופי
- הכנס את הצלחת לוויה עם התוספות על גבי מיקרוסקופ ניגודיות שלב 20 ולספור כל תא שהועברו על החלק התחתון של הקרום. למטב את מיקום המוקד הנכון על-ידי הזזת המטרה מלמטה למעלה, ולהפסיק את המיקום על החלק התחתון של הקרום.
- לחשב את היחס בין המספרים של תאים שהועברו ותאים הזריעה. חזור על כל ספירה עבור כל תנאי הטיפול דולר.
2. לגרד פצע Assay: נדידת תאים
הערה: ההוראות חייב להיות מותאם לכל סוג של תא.
יום 1
-
תא זריעה
- זרע 2 x 106 SQ20B תאים ב- mL 12 ס מ בבקבוקון2 175 ס' ' מ 72 h לפני היום הראשון ולאפשר לתאים לגדול 80% תא הנהרות.
- תחת תא למינארי, trypsinize את התאים. להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS סטרילי, להוסיף 2.5 מ של טריפסין EDTA (0.5 g/L), דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה על-ידי הוספת מ"ל של ס מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. לספור את מספר תאים באמצעות מונה התא.
- ליצור מדגם prediluted-צפיפות התאים של 4 x 105/mL, נותן צפיפות הסופי של 4 10 תאים4 לכל μL 100 לכל היטב. ריכוז זה חייב להיות מותאם עבור כל קו תא, צריך להיות בטווח של 1 x 104 6 104 תאים.
- תאי הזרע לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן, על ידי הפקדת μL 100 של הפתרון המוכן בשלב 2.1.2.
- להשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפזר את התאים באופן שווה על החלק התחתון של הבארות.
- למקם את הצלחת לתוך החממה ולאפשר את התאים לדבוק הצלחת. בשביל h 12 עד 16 (מכסימום) ב 37 º C.
יום 2
-
לגרד פצע assay
- להסיר את הלוחות המוכנים בשלב 2.1 מן החממה.
- מתחת למכסה המנוע, להפוך פצע באמצעות המכשיר wounding מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
- להסיר לאלתר את המדיום של כל טוב באמצעות פיפטה עם טיפ חרוט מותאם, מטפל לא לגעת את הפצע.
- לשטוף את התאים פעמיים על-ידי חזרה על השאיפה ושימוש μL 100 ס"מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס במשך כל.
- הסר את ס מ באמצעות פיפטה עם טיפ חרוט מותאם אחרי השלבים כביסה.
- להוסיף 100 μL בינוני ספציפיות עבור כל תנאי הטיפול בכל טוב.
- נסו להימנע מיצירת בועות בתוך הבארות. בטכניקה הפוכה-pipetting עשוי להיות שימושי כאן. לחלופין, להסיר בועות עם מחט מזרק.
- מקם את הצלחת לתוך המדף מותאם של מיקרוסקופ וידאו.
- כדי לשפר את איכות התמונה, לאפשר את הצלחת לחמם למשך לפחות 15 דקות לפני הסריקה הראשונה כדי למנוע עיבוי בצדו התחתון של הלוח.
- תוכנית לוח הזמנים של סריקות, שימוש בתוכנה מיקרוסקופ וידאו-תמונה אחת לכל טוב. מרווח זמן מירבי 2-h נדרש ניסוי הפלישה-העברה. אם מטרת הניסוי להפיק סרטון, בהפרשים של מקסימום 30 דקות היא עדיפה.
- בסוף הניסוי, לשטוף את המכשיר wounding בקפידה, בצע את כל השלבים כביסה ארבע שציין היצרן.
ימים 3, 4 ו-5
-
ניתוח של העברה באמצעות מיקרוסקופ וידאו
- עבור שהייה של 24 שעות ו עד 5 ימים, לפקח ולבדוק את נדידת תאים.
- להשתמש במסיכת תאים מתאים המותאמים לכל סוג התא כדי לנתח נדידת תאים. כדי להשיג מסכה תא הותאם עבור כל קו תא, ליצור תא עיבוד הגדרה מתוך התוכנה באמצעות אוסף תמונות תאים מסוים.
- לאתר. את העקומות ולייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני, אשר ניתן להשתמש כדי לנתח ולהשוות את התוצאות.
3. לגרד פצע Assay: הפלישה תא
הערה: ההוראות חייב להיות מותאם לכל סוג של תא.
יום 1
-
תא זריעה
- השתמש באותו הפרוטוקול עבור תא זריעה כפי שמתואר בשלב 2.1.
יום 2
-
הכנת את ה-ECM
- מפשירים את מטריצת לפחות 12 שעות לפני השימוש ב- 4 מעלות צלזיוס. ודא כי אין אגרגטים גלויים. אם אגרגטים גלויים, לשמור המטריצה ב 4 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן ארוך עד מצרפי להיעלם. שמור את המטריקס על קרח. השתמש בעצות פיפטה precooled.
הערה: המטריקס יחזק את אם לא שמרו ב 4 º C. - מקררים הצינורות microcentrifuge בקרח במשך 5 דקות.
- קח ס מ מקורר עד 4 ° C מהמקרר, לדלל את המטריצה את החצוצרות שלה precooled microcentrifuge בריכוז הסופי של 300 μg/mL.
- לחזור הצינורות microcentrifuge עם מטריקס prediluted המקרר ב 4 º C.
הערה: מתלה קירור מותאם microcentrifuge צינורות מועיל לשמירה על הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.
- מפשירים את מטריצת לפחות 12 שעות לפני השימוש ב- 4 מעלות צלזיוס. ודא כי אין אגרגטים גלויים. אם אגרגטים גלויים, לשמור המטריצה ב 4 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן ארוך עד מצרפי להיעלם. שמור את המטריקס על קרח. השתמש בעצות פיפטה precooled.
יום 2
-
פצע שריטה Assay וטיפול ה-ECM
- הסר את לוחית מוכן בשלב 3.1 מן החממה.
- מתחת למכסה המנוע, להפוך את הפצע באמצעות המכשיר wounding מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
- להסיר לאלתר את המדיום של כל טוב באמצעות פיפטה עם טיפ חרוט מותאם מטפל לא לגעת את הפצע.
- לשטוף את התאים פעמיים על-ידי חזרה על נוהל השאיפה ושימוש μL 100 ס"מ התחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר לשטוף את השניה, מניחים את הצלחת על החממה 4 ° C כדי equilibrate את הטמפרטורה שלו במשך 5 דקות.
- הסר את המדיום קר מכל קידוח עם פיפטה השאיפה עם טיפ חרוט, מטפל פיפטה בקפידה מהקצה וכדי להימנע מלגעת הפצע.
- להוסיף 50 μL של מטריקס prediluted מכל קידוח באמצעות טיפים חרוט precooled ב 4 º C.
- מקם את הצלחת בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: מתלה prewarmed תמיכה ב 37 מעלות צלזיוס שימושי להאיץ את ההתחממות של צלחת 96-ובכן. - הסר את הלוחית של החממה ולהוסיף μL 100 ס"מ להתאים כל טוב כפי שמצוין עבור כל תנאי הטיפול.
- נסו להימנע מיצירת בועות בתוך הבארות. בטכניקה הפוכה-pipetting עשוי להיות שימושי כאן. לחלופין, להסיר בועות עם מחט מזרק.
- מקם את הצלחת לתוך המדף מותאם במיקרוסקופ וידאו.
- כדי לשפר את איכות התמונה, לאפשר את הצלחת לחמם למשך לפחות 15 דקות לפני הסריקה הראשונה כדי למנוע עיבוי בצדו התחתון של הלוח.
- לתכנת את לוח הזמנים של סריקות, שימוש בתוכנה מיקרוסקופ וידאו-תמונה אחת לכל טוב, במצב סריקה לגרד פצע. מרווח זמן מירבי 2-h בנדרש עבור ניסוי הפלישה-העברה. אם מטרת הניסוי להפיק סרטון, בהפרשים של מקסימום 30 דקות היא עדיפה.
- בסוף הניסוי, לשטוף את המכשיר wounding בקפידה, בצע את כל השלבים כביסה ארבע שציין היצרן.
ימים 3, 4 ו-5
-
ניתוח של הפלישה התא באמצעות מיקרוסקופ וידאו.
- חזור על שלב 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. מדווחים כאן שתי שיטות שונות כדי לנתח תא הפלישה והעברה. איור 1 מציג בוידן קאמרית הניסוי. התוספות ממוקמים בתוך צלחת לוויה chemoattractant בינונית, התאים הם נזרע בס מ. הקרום יכול להיות ניטראלית (העברה assay) או מצופה (הפלישה assay). התאים הם נזרע לתא העליון ב- s-ס"מ. תא תחתון מלא ס מ כמו chemoattractant. התאים קבועים לפני הזמן ההכפלה.
איור 2 מציג את הקרום בוידן לאחר קיבוע תאים. איור 2A מראה תוצאה שיוצרת, עם תא אשכולות על הצד העליון של הקרום. איור 2B מראה תוצאה מיטבית עם תאים קבוע והמוכתמות בכחול על הקרום.
איור 3 מראה תוצאה מיטבית של פצע שריטה וזמינותו. הפצע לינארי ניתן לראות באיור 3 א. לא התאים שנצפו בפצע, ריפוי הפצע התרחש בתוך 30 אבני. הפעם כדי לרפא את הפצע היא תלויה שורת התאים והטווחים מ 24 ש 50.
איור 3B הוא ייצוג גרפי של ארבעה תחת תנאים טיפול ריפוי הפצע: שליטה, א-199 (anti-Bcl-2), ארביטוקס (anti-EGFR) וא-199 + ארביטוקס. א-199 + ארביטוקס בשילוב ירד באופן משמעותי נדידת תאים. העקומות מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ וידאו התוכנה, המספק ניתוח נתונים של נדידת תאים עם הזמן. קווי שגיאה לייצג סטיית התקן (אס די) עבור כל טוב.
תשעים אחוז הנהרות הוא הצפיפות תא אופטימלית של ריפוי פצע וזמינותו. האופטימלית תא זריעה תלוי שורת התאים, נע בין 3 x 104 6 x 104 תאים. 4A דמות מציג את צפיפות תא אופטימלית, ו איור 4C מציגה את צפיפות התאים נמוך. וולס צריך לרחוץ פעמיים כדי להימנע תא אשכולות, כפי שמוצג באיור 4B.
איור 1: ייצוג סכמטי של הניסוי קאמרית בוידן. מוסיף ממוקמים בתוך צלחת לוויה chemoattractant בינונית, התאים הם נזרע בס מ. הקרום יכול להיות ניטראלית (A) או מצופה (B).
איור 2: תוצאות מיקרוסקופיים שיוצרת של האופטימלית שהושגו בניסוי קאמרית בוידן. (א) ממברנה שיוצרת עם תא אשכולות על הצד העליון של הממברנה, תוצאות uninterpretable. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. (B) אופטימלי קרום עם אפשר לספור תאים בחלק התחתון של קרום צבעונית בצבע כחול. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר.
איור 3: תוצאות אופטימליות שהושגו בניסוי ריפוי פצע. (א) התמונה נציג מ וזמינותו פצע שריטה שמוצג ריפוי הפצע נצפו על 0, 15, ו- 30 h. הקריטריונים עבור ניסוי איכות הם פצע ליניארי, שברי תאים לא נצפתה הפצע, וכן זרימה אופטימלית בתא. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. (B) ייצוג גרפי של ריפוי הפצע מציג כימות פרמטרים של הפצע תא הנהרות (באחוזים) לפי הזמן (h). ארבעה תנאים טיפול מנותחים כאן, הנתונים מוצגים עם הגסטפו
איור 4: שיוצרת התוצאות שהתקבלו בניסוי ריפוי פצע. (א) תא אידיאלי צפיפות. בעיות (B) שטיפת בגדר התא. צפיפות התאים נמוך (C). גודל ברים = 300 מיקרומטר
| יתרונות | חסרונות | |
| ניסוי קאמרית בוידן | -3D-תא כימוטקסיס | -זמן רב |
| -הפלישה והן הגירה עם שכבת ציפוי וללא שאינו מצופה מטריקס | -הפארמצבטית נמוך | |
| -מוסיף יקר | ||
| . אין חקר זמן לשגות | ||
| -הצורך של תאים חסיד | ||
| פצע ריפוי Assay | -אוטומטיים מאוד לשחזור פצע | -תנועתיות 2D-תא |
| -הפלישה והן הגירה עם שכבת ציפוי וללא שאינו מצופה מטריקס | -הצורך של תאים חסיד | |
| -התפשטות תא כלולים בניתוח | ||
| -ניתוח ויזואלי מיקרוסקופיים בצילום מואץ | ||
| -נתונים exportation של מדדים ריפוי הפצע עם ניתוח מדויק | ||
| -תוכנות חזקה שלאחר הטיפול עבור עיקולים ההעברה ופלישה תא |
טבלה 1: היתרונות והחסרונות של בוידן הקאמרית הניסוי ואת וזמינותו ריפוי פצע מיקרוסקופ וידאו- היתרונות והחסרונות של התא בוידן ניסוי, לגרד פצע וזמינותו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. מדווחים כאן שתי שיטות שונות ללמוד הפלישה תא את תהליך ההעברה. הניתוח של תהליך זה חשוב להבנת הגורמים המעורבים הישנות גרורתי, אשר יכול להיות מוסבר על ידי תנועתיות מוגברת subpopulation של תאים סרטניים נקרא סרטן בתאי גזע10,11.
הניסוי קאמרית בוידן היא אחת הנפוצות ביותר בשימוש בטכניקות לחקור תא הפלישה והעברה. אחד היתרונות של גישה זו אמנם הפארמצבטית שלה, טכניקה זו תלויה מאוד המומחיות של הנסיין. תא ספירה ידנית, יכול להשתנות בין ניסויים. חייב להיות סטנדרטית, בעקבות טיפול, כגון הבטחת השימוש המתאים chemoattractant ורעב המדיום הספציפי בכל שורה תא שלבים קריטיים רבים. הסרת תאים קרום עליון באמצעות מקלון צמר גפן חיוני גם כדי להבטיח תוצאות אופטימליות והימנעות התוצאות שיוצרת שמוצג באיור 2A. אם זה וזמינותו משמש כדי להעריך את תנועתיות תא, הפלישה, ויכולות העברה דרך קרום נקבובי תלת מימדי (3D), זה לא אפשרי לעקוב אחר תאים באמצעות ניסוי זמן לשגות. יתר על כן, מוסיף מסחרי עם קרום נקבובי לעיתים קרובות יקר.
וזמינותו פצע שריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו המוצג כאן הוא טכניקה חזקה כדי להעריך את נדידת תאים, הפלישה. וזמינותו מתבצע באמצעות מכונת הפצע מכני ומספק לשחזור השוואה בין תנאי הטיפול. ניתוח מיקרוסקופי וידאו ניתן לייצר נתונים כמותיים מדויקים עבור זרימה ריפוי ותא הפצע באמצעות ניסוי זמן לשגות. -פעם ניתוח של תנאי טיפול שונה מהם מגובים על ידי תצפיות מיקרוסקופיות. ניתוח זה משלב התפשטות תאים במהלך וזמינותו, לוקח בחשבון את הזמן הכפלת התא. ניתן לייצא וידאו או נתונים גולמיים תוכן כדי לקבל ייצוג חזותי ברמה גבוהה של התוצאות, כפי שמוצג את פיתולי ההעברה תא איור 3B.
שלבים קריטיים רבים נדרשים כדי להשיג תוצאות interpretable. התנאים אופטימליים עבור תא זריעה התלויים על הקו תא, יש לבדוק אותו עם דילולים שונים כדי לקבל 90% הנהרות תא ב הבארות. כדי להשיג פצע ליניארי, יופיצ תא יחרוג מ- 16 h. הצעד כביסה חייב להיעשות פעמיים, במהירות כדי להימנע מהחדרה שאריות תאים לתוך הפצע שעלולים לשנות את התוצאות. על הפצע מאפס הפלישה, כיאות ECM הוא גם שלב קריטי. התעריפים הקירור להיות קבועים, ECM צריך להיות מניפולציות עם טיפים פיפטה צוננת ומתוחזק ב 4 º C.
טכניקות אלה יש יתרונות רבים, אשר מסוכמות בטבלה 1. תאים חסיד יש צורך בטכניקה זו. גירוד פגיעה מכנית גורם לתאים, אשר גורמת לשחרור תוכן סלולרי לתוך האמצעי שמסביב, עשויים להשפיע על תהליך ההעברה. וזמינותו פצע שריטה מספקת הערכה של תנועתיות תא 2D אבל לא של התא כימוטקסיס, אשר לא ניתן לחקור בעזרת טכניקה זו. לאחרונה פיתחנו וזמינותו כימוטקסיס מיקרוסקופיים וידאו באמצעות מערכת ציפוי מסחרי. Assay הזה זקוק תאים עם יכולת העברה גבוה, כגון תאי גזע סרטניים, כפי שתואר לעיל12. טכניקה חדשה זו עשויה להפוך תקן זהב עבור הפלישה-העברת מבחני בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
טכניקות אלה פותחו עם התמיכה של LabEx הראשוניים (ANR-11-LABX-0063), תוכנית Contrat-הינוממוקם-אזור (CPER) במסגרת מדעי אטואל (CPER 2009-2013), לירית גרנט האינקה-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
