Summary
細胞浸潤と移行の解析のための 2 つの方法の事例分析: ボイデン室アッセイと体外ビデオ顕微鏡を用いた創傷治癒アッセイ。これらの 2 つの実験のプロトコルの記述とのメリットとデメリットを比較します。
Abstract
腫瘍細胞の浸潤と移行の能力は、癌の進行や再発の主な要因です。多くの研究は、新しい治療戦略の開発の目的で、がん細胞を普及させる方法を理解するための移行と侵攻能力を探検しました。これらの能力の分子・細胞基盤の解析は、細胞移動の特性と細胞骨格と細胞の微小環境の物理化学的性質につながっています。長年にわたりボイデン室アッセイとスクラッチ傷アッセイは、細胞浸潤と移行を検討する標準的な手法をされています。ただし、これらの 2 つの手法には、制限があります。ボイデン室アッセイは難しく、時間がかかり、スクラッチ傷の試金、低再現性。顕微鏡、特に現代の技術の開発は、スクラッチ傷測定の再現性を増加しています。強力な解析システムを使用して、「インキュベーター」ビデオ顕微鏡は細胞の遊走と浸潤の自動リアルタイム分析を提供するために使用できます。本稿の目的は、レポートおよび細胞浸潤と移行を研究するために使用 2 つの試金を比較する: ボイデン室アッセイと、最適化された体外ビデオ顕微鏡ベース スクラッチ傷の試金。
Introduction
細胞浸潤と移行治療1への抵抗の主な原因である癌細胞の普及に関与しているし、局所または転移性がん治療2再発につながることができます。上皮間葉転換 (EMT) は、細胞浸潤移行の癌細胞からに切り替えると、上皮間葉系の表現型の初期プロセスです。E-カドヘリンは上皮性の表現型3の細胞マーカーと N 型カドヘリンおよびビメンチンの発現増加間葉系表現型4の特徴であります。移行は、マトリックス分解酵素5の作用により細胞外のマトリックス (ECM) を侵略する癌細胞の本質的な能力によっても異なります。
この侵略 – 移行メカニズムは、頭頸部がん6を中心に、多くの場所で癌のため記載されています。多くの研究者は、がん細胞がこの知識は新たな治療戦略につながることを願って発信方法をよりよく理解する移行と侵入のプロセスに焦点を当てています。信頼性が高く、再現性のある試金を使用してこれらの研究を実行することが重要です。
細胞の運動性のin vitro解析は挑戦することができます。何年も前に開発、ボイデン室アッセイに侵攻-移行解析7の標準と見なされます。しかし、それは時間がかかるし、はしばしば不正確。2 番目のテストは、創傷治癒の試金8、含み細胞の単層培養に傷を作り、細胞浸潤と一定の時間間隔で移行の画像をキャプチャします。この手法は、2 つの連続したテストの結果の大きい変化のため広く批判されています。しかし、特に、顕微鏡での近代的な技術のアプリケーション スクラッチ傷アッセイの再現性の向上が。ビデオ顕微鏡インキュベーターで簡単に導入することができ、細胞遊走のリアルタイム画像を生成することができます。これらのデバイスは顕微鏡データを記録し、時間をかけて傷細胞合流点の自動解析を提供します。本稿の目的はボイデン室分析と最適化されたスクラッチ傷の試金を記述する、長所とそれぞれのアプローチの弱点を議論します。
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Protocol
注: ECM の包含なし・ ボイデン ・商工会議所とスクラッチ アッセイし、呼ばれ遊走アッセイによる ECM と同じアッセイを浸潤能の測定と呼びます。
1. ボイデン室アッセイ
注: このプロトコル、喉頭がんの再発の頭と頸部扁平上皮癌 (各種) から派生した、ジョンから得られた SQ20B のセルラインに適応されるほとんど (ボストン、マサチューセッツ州、米国)。
日 1
-
細胞播種
- シード 2 106 SQ20B 細胞の培養液 (CM) 12 mL で 175 cm2フラスコ前日 72 h、80% セル合流点に成長する細胞を許可します。
- SQ20B 細胞の CM を準備をするには、10% 牛胎児血清 (FCS)、0.04 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 g/L とダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を補足します。
- 層流フードの下には、セルを trypsinize します。メディアを取り出して洗って滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞をトリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.5 g/L) の 2.5 mL を追加します。37 ° C で 5 分間細胞をインキュベートし、37 ° C に温めて cm 12.5 mL の追加によって反作用を停止細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。
- 評価する条件ごとに 6 105セルの細胞密度で 25 cm2フラスコで細胞を播きます。CM の 3 mL で 24 h のセルを孵化させなさい。
- シード 2 106 SQ20B 細胞の培養液 (CM) 12 mL で 175 cm2フラスコ前日 72 h、80% セル合流点に成長する細胞を許可します。
日 2
-
セル飢餓そしてコーティング室の準備
- FBS ではなく各フラスコの培地を 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) を使用して低胎児血清 (FBS) 培地 3 mL に置き換えることによって、細胞を飢えさせます。インキュベーターで 24 h の細胞を飢えさせます。
- 飢餓 CM (s CM) を準備するには、0.1 %bsa、0.04 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 g/L と DMEM を補足します。
- 移行分析手順 1.3 に進みます。
- 浸潤能の測定、3 日前に 12 h 各コーティング室に s cm 500 μ L の追加によってコーティングされた boyden 教授室を準備します。市販コーティング ボイデン室を使用して、使用する前に 4 ° C でそれらを保ちます。コンパニオン プレート内各ボイデン室を置き、37 ° C でインキュベーターで一晩おきます。
- FBS ではなく各フラスコの培地を 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) を使用して低胎児血清 (FBS) 培地 3 mL に置き換えることによって、細胞を飢えさせます。インキュベーターで 24 h の細胞を飢えさせます。
日 3
-
細胞播種 boyden 教授室
- コンパニオン プレートを使用して、走化性因子を準備します。それぞれ記入を完全培地 10 %fbs、0.04 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 0.1 g/L と 750 μ l 24 ウェル コンパニオン プレートのも。
- 各セルラインおよび処理の各条件の走化性因子に適応します。走化性因子 CM CM ca を準備するには、10 %fcs、0.4 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 g/L と DMEM を補足します。
- 泡を避けるために世話済みコンパニオン プレートに参院を転送します。
- 浸潤アッセイ各 boyden 教授室から CM の 450 μ L を慎重に取り外します。
- 層流フードの下には、セルを trypsinize します。メディアを取り出して、洗浄滅菌 PBS のセル、トリプシン EDTA (0.5 g/L) の 0.5 mL を加えて、37 ° C で 5 分間細胞をインキュベーションして37 ° C に温めて CM の追加によって反作用を停止します。細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。
- 500 μ L の 6 104セル/mL の最終希釈を与えて、0.1 %bsa の中でシード 3 104 SQ20B 細胞。
注: 各セルラインのセルの濃度を合わせる必要があります。 - 37 ° C で 24 時間のためのインキュベーターにプレートを配置します。
- コンパニオン プレートを使用して、走化性因子を準備します。それぞれ記入を完全培地 10 %fbs、0.04 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 0.1 g/L と 750 μ l 24 ウェル コンパニオン プレートのも。
日 4
-
細胞の固定・染色
- 倍加時間の細胞ラインに特定する前にセルを修正します。24 h する前に SQ20B セルを修正します。
- 各挿入をコンパニオン プレートから外し、綿棒を使用して上部チャンバーからセルを慎重に取り外します。特に上部室にあるすべてのセルを削除することが重要です。
- 修正と汚れはそれぞれ 5 月 Grunwald ギムザ着色9提供染色キットを使用してを取得する個別に挿入します。また、別の仲間の板で 30 分固定用 4% パラホルムアルデヒドを使用します。
- 各商工会議所を乾燥する所のフードの下で空 24 ウェル コンパニオン プレートに挿入をしてください。
日 5
-
顕微解析
- 20 位相差顕微鏡に挿入してコンパニオン プレートを挿入し、膜の下の部分にそれぞれ移行したセルをカウントします。目的を下から上に移動して右フォーカス位置を最適化し、膜の下の部分に位置を停止します。
- 移行した細胞数とシード セル間の比率を計算します。3 通の各治療条件に対してそれぞれのカウントを繰り返します。
2. スクラッチ傷の試金: 細胞の遊走
メモ: 手順は、細胞の種類ごとに合わせられなければなりません。
日 1
-
細胞播種
- 種子 2 x 106 SQ20B CM 175 cm2フラスコ前日 72 h の 12 mL の細胞し、80% セル合流点に成長する細胞を許可します。
- 層流フードの下には、セルを trypsinize します。メディアを取り出して、洗浄滅菌 PBS のセル、トリプシン EDTA (0.5 g/L) の 2.5 mL を追加し、37 ° C で 5 分間細胞をインキュベート37 ° C に温めて cm 12.5 mL の追加によって反作用を停止します。細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。
- 各ウェルに 100 μ L あたり 4 104セルの最終的な密度を与える 4 x 105/mL の細胞密度で prediluted のサンプルを生成します。この濃度は、各セルラインに適応する必要があり、1 x 104 6 104セルの範囲内にする必要があります。
- 2.1.2 の手順で、溶液の 100 μ l 堆積 96 ウェル プレートの各ウェルにシード細胞。
- 井戸の底にセルを均等に分散する 5 分間室温でプレートを残してください。
- インキュベーターにプレートを置き、37 ° C で 12 に 16 時間 (最大) プレートに付着する細胞は、
日 2
-
スクラッチ傷アッセイ
- インキュベーターから手順 2.1 準備プレートを取り外します。
- フードの下, 製造元のプロトコルに従って商業人が負傷したデバイスを使用して傷を作る。
- すぐに各もピペットを使用して合わせられた円錐形の先端、傷口に触れないように世話をからメディアを削除します。
- 吸引を繰り返し、各ウェルの 37 ° C に温めて CM の 100 μ L を使用して 2 回洗浄を行う。
- 洗浄のステップ後適応の円錐形の先端のピペットを使用して CM を削除します。
- 各ウェルに 100 μ L 媒体の治療条件ごとに特定を追加します。
- 井戸の中の任意の気泡を作成するようにしてください。逆ピペッティング テクニックはここで役に立つかもしれません。また、注射針の泡を削除します。
- ビデオ顕微鏡の適応のラックに板を配置します。
- 画像の品質を向上させるため、プレートの下側に結露を避けるために最初のスキャンの前に、少なくとも 15 分間ウォーム プレートを許可します。
- まあ 1 つのイメージでビデオ顕微鏡のソフトウェアを使用してスキャンのスケジュールをプログラムします。最大 2 h 間隔が侵攻移行実験のため必要です。実験の目的は、ビデオを作成することは場合、は、最大 30 分の間隔が優先されます。
- 実験の終わりには、負傷のデバイスを丁寧に洗うし、各メーカーが示す 4 つの洗浄のステップに従ってください。
3、4、および 5 の日
-
ビデオ顕微鏡を使用して移行の解析
- 24 h、最大 5 日間の最小、監視し、細胞遊走をチェックします。
- セル タイプごとに適応した適切なセル マスクを使用して、セルの移行を分析します。各セルライン適応セル マスクを得るためには、特定のセルのイメージのコレクションを使用してソフトウェア定義の処理セルを生成します。
- カーブをトレースし、データを分析し、結果を比較するために使用できます、スプレッドシートにエクスポートします。
3. スクラッチ傷の試金: 細胞浸潤
メモ: 手順は、細胞の種類ごとに合わせられなければなりません。
日 1
-
細胞播種
- 細胞播種手順 2.1 で説明されているように同じプロトコルを使用します。
日 2
-
ECM の準備
- 4 ° C で使用する前に、少なくとも 12 h のマトリックスを解凍します。集計が表示されていないことを確認します。集計が表示されている場合は、集計が消えるまで長い期間の 4 ° C でマトリックスを維持します。氷の行列をしてください。冷却のピペット チップを使用します。
注: マトリックスを固めるいない場合は 4 ° C で保管 - 氷上で 5 分間遠心管を冷やします。
- 取る CM 冷蔵庫から 4 ° C に冷却し、300 μ g/mL の濃度が最終的な冷却マイクロ遠心チューブ用の行列を希釈します。
- Prediluted 行列を用いたマイクロ遠心チューブ用を 4 ° C の冷凍庫に戻る
注: 冷却ラック マイクロ遠心チューブ用の適応実験を通して 4 ° c 管を維持するため便利です。
- 4 ° C で使用する前に、少なくとも 12 h のマトリックスを解凍します。集計が表示されていないことを確認します。集計が表示されている場合は、集計が消えるまで長い期間の 4 ° C でマトリックスを維持します。氷の行列をしてください。冷却のピペット チップを使用します。
日 2
-
スクラッチ傷アッセイと ECM の治療
- インキュベーターから 3.1 の手順で作製したプレートを取り外します。
- フードの下, 製造元のプロトコルに従って商業人が負傷したデバイスを使用して傷を作る。
- すぐに各もピペットを使用して傷に触れないように世話適応の円錐形の先端とからメディアを削除します。
- 2 回吸引の手順を繰り返し、37 ° C に温めて CM の 100 μ L を使用してセルを洗浄して
- 第 2 洗浄後、5 分間その温度を平衡に 4 ° C の定温器にプレートを配置します。
- 世話を端から慎重にピペットと傷口に触れることを避けるために円錐形の先端を吸引ピペットの各ウェルから寒い中を削除します。
- 4 ° C で冷却の円錐形の先端を使用して各ウェルに prediluted マトリックスの 50 μ L を追加します。
- 37 ° C で 30 分間のインキュベーターでプレートを配置します。
注: 37 ° C で prewarmed サポート ラック 96 ウェル プレートの温暖化を加速させると便利です。 - インキュベーターからプレートを外し、治療条件ごとに示されているように、各ウェルに 100 μ L の適応の CM を追加します。
- 井戸の中の任意の気泡を作成するようにしてください。逆ピペッティング テクニックはここで役に立つかもしれません。また、注射針の泡を削除します。
- ビデオ マイクロ スコープで適合ラックに板を配置します。
- 画像の品質を向上させるため、プレートの下側に結露を避けるために最初のスキャンの前に、少なくとも 15 分間ウォーム プレートを許可します。
- まあ、スクラッチ傷スキャン モードで 1 つのイメージでビデオ顕微鏡のソフトウェアを使用してスキャンのスケジュールをプログラムします。2 h の間隔の最大値は、侵攻移行実験に必要な。実験の目的は、ビデオを作成することは場合、は、最大 30 分の間隔が優先されます。
- 実験の終わりには、負傷のデバイスを丁寧に洗うし、各メーカーが示す 4 つの洗浄のステップに従ってください。
3、4、および 5 の日
-
ビデオ顕微鏡を用いた細胞浸潤の解析。
- 2.3 の手順を繰り返します。
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Representative Results
我々 は細胞浸潤と移行を分析する 2 つの方法をここに報告します。図 1は、ボイデン室実験を示します。挿入は走化性因子中、コンパニオン プレートに配置され、セルは CM で播かれます。膜をコーティングすることができます (移行法) や (浸潤アッセイ) をコーティングします。S cm 上部チャンバーに細胞がシードされます。下院は、走化性因子として CM でいっぱいです。セルは、2 倍の時間の前に固定されています。
図 2は、セル固定後・ ボイデン ・膜を示します。図 2 aは、最適ではない結果は、細胞膜の面の上にクラスターを示しています。図 2 bは、細胞固定し、膜上のブルーのステンド グラスに最適な結果を示しています。
図 3は、スクラッチ傷アッセイの最適な結果を示しています。図 3 aの線形の傷を見ることができます。傷の細胞が観察されなく、創傷治癒が 30 h で発生しました。傷を癒すために時間、セルラインおよび 50 h 24 からの範囲に依存します。
図 3 bは、創傷治癒の治療条件の 4 つのグラフィカルな表現: コントロール、アプト-199 (反-Bcl-2) やセツキシマブ (抗 EGFR)、アプト-199 + セツキシマブ。ABT-199 + セツキシマブ組み合わせが細胞遊走を有意に減少します。曲線は、時間とともに細胞遊走の堅牢なデータ分析を提供ビデオ マイクロ スコープのソフトウェアを使用して取得されます。誤差範囲は、各井戸の標準偏差 (SD) を表します。
90% の合流点は、創傷治癒の試金のための最適な細胞密度です。最適な細胞播種細胞ラインに依存し、3 x 10 の4から 6 × 104セルの範囲します。 図 4 a 最適な細胞密度を示していますと図 4は、低細胞密度を示しています。井戸は、図 4 bに示すように、細胞塊を避けるために二度洗浄する必要があります。
図 1: ボイデン室実験の概略図。挿入は走化性因子中、コンパニオン プレートに配置され、セルは CM で播かれます。膜は、ノンコート (A) または (B) がコーティングすることができます。
図 2: ボイデン室実験で得られた最適かつ最適な顕微鏡の結果。(A) 準最適膜膜および uninterpretable 結果の上部の細胞塊。スケール バー可算細胞膜のブルーのステンド グラスの下の部分での 300 μ m。 (B) 最適な膜を =。スケールバー = 300 μ m。
図 3: 創傷治癒実験で最適な結果が得られた。(A) 創傷治癒 0、15、30 h で観測された示されているスクラッチ傷アッセイから代表的なイメージ。品質実験条件が線形の傷傷、および最適な細胞合流で細胞断片が認められなかったです。スケールバー = 300 μ m。 (B) のグラフィカル創傷治癒時間 (h) によると傷細胞合流 (割合) のパラメーターの定量化を示します。4 つの治療条件がここでは、分析され、SD にデータが表示されます。
図 4: 創傷治癒実験に最適な結果が得られる。(A) 理想的な細胞密度。(B) 問題細胞ペレットを洗浄します。(C) 低細胞密度。スケール バー = 300 μ m
| 利点 | 不利な点 | |
| ボイデン室実験 | -3 D 細胞走化性 | -時間がかかる |
| -両方の侵略とコーティングと非コーティング層マトリックスに移行 | -低再現性 | |
| 高価な挿入 | ||
| -いいえのコマの探査 | ||
| -付着性のセルの必要性 | ||
| 創傷治癒の試金 | -自動再現性の高い傷 | -2次元細胞の運動性 |
| -両方の侵略とコーティングと非コーティング層マトリックスに移行 | -付着性のセルの必要性 | |
| 分析に含まれる細胞増殖 | ||
| -タイムラプス顕微鏡ビジュアル分析 | ||
| 的確な分析を創傷治癒のメトリックのデータ輸出 | ||
| -治療後セル移動と侵略の曲線の堅牢なソフトウェア |
表 1: Boyden の長所と短所の部屋の実験とビデオ顕微鏡創傷治癒アッセイ。長所と短所 boyden 教授室の実験し、スクラッチ傷の試金。
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Discussion
我々 はここに細胞浸潤と移行過程を研究する 2 つの異なるモダリティを報告します。このプロセスの分析は、がん幹細胞10,11と呼ばれる癌細胞の亜集団の増加運動によって説明されるかもしれない転移再発に関与する因子を理解することが重要です。
ボイデン室実験は最も頻繁に使用される 1 つを探索する技術細胞浸潤と移行。この手法は実験者の専門知識に大きく依存して、このアプローチの利点の 1 つはその再現性です。細胞数は手動、実験者によって異なります。多くの重要なステップは、標準化し、各セルラインに固有走化性因子と飢餓の適切な媒体の使用を確保するなどの世話を続けてする必要があります。綿棒と上部の膜からのセルの削除も最適な結果を確保し、図 2 aに示すように最適ではない結果を回避する重要です。細胞運動、侵略、および 3 次元 (3 D) 多孔質膜を通る移行能力評価にこの試金を使用する場合、コマ撮り実験を通して細胞を追跡する不可能します。また、多孔質膜を用いた市販スローアウエイ チップが高価な多い。
ここで紹介するビデオ顕微鏡ベースのスクラッチ傷アッセイは、細胞の遊走と浸潤を評価する堅牢な手法です。アッセイは、機械傷メーカー、実行され、処理条件の再現性比較を提供します。ビデオ顕微鏡による解析は、傷の治癒と細胞の合流点タイムラプス実験を通しての正確な定量データを生成する使用できます。さまざまな治療条件の時間-時間解析は、顕微鏡観察によって確証することができます。この分析は細胞増殖アッセイ中を統合し、細胞倍加時間を考慮します。図 3Bの細胞移行曲線に示すように、ビデオまたは raw データの内容を結果の非常に視覚的表現を取得にエクスポートできます。
多くの重要なステップは、解釈の結果を取得する必要があります。細胞播種のための最適の条件は細胞に依存しており、井戸に 90% セル合流を取得する別の希釈でテストする必要があります。線形の傷を得るためには、セルめっきは 16 時間を超えない。2 倍と急速に洗浄のステップを行う必要があります結果を変えることができる傷の細胞の残骸の導入を避けるために。侵略のスクラッチ傷の適切な ECM 世話も重要なステップです。冷却速度が一定でなければならないし、ECM をチルドのピペット チップを使用して操作し 4 ° C で維持する必要があります。
これらのテクニックには、表 1 に要約して多くの利点があります。付着性のセルは、この手法に必要です。傷原因機械的損傷細胞に周囲媒体に携帯電話コンテンツのリリースを引き起こし、移行プロセスに影響を及ぼす可能性があります。スクラッチ傷アッセイは、2 D の細胞運動のではなく細胞走化性、このテクニックを使用して検討することはできませんの見積もりを提供します。最近商業めっきを用いたビデオ顕微鏡走化性アッセイを開発しました。このアッセイでは、12を前述のようの細胞、がん幹細胞などの高い移行能力を持つ必要があります。この新しい技術は、将来的に侵攻移行の試金のためのゴールド スタンダードになります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
これらの技術は、LabEx 素数 (ANR-11-LABX-0063)、エトワール (CPER 2009 ~ 2013 年)、叙情詩的なグラント インカ DGOS-4664 の科学的なフレームワーク内で契プラン クーデタークーデター地域 (CPER) の支援を受けて開発されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
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