Summary
Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.
Abstract
De invasie en migratie mogelijkheden van tumorcellen zijn grootste bijdragen aan de progressie van kanker en herhaling. Vele studies hebben onderzocht de migratie en invasie capaciteiten om te begrijpen hoe kankercellen verspreiden, met het doel van de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën. Analyse van de cellulaire en moleculaire basis van deze capaciteiten heeft geleid tot de karakterisatie van cel mobiliteit en de fysisch-chemische eigenschappen van het cytoskelet en mobiele communicatie. Voor vele jaren, de bepaling van Boyden kamer en de kras wond assay geweest de standaardtechnieken cel invasie en migratie te gaan studeren. Deze twee technieken hebben echter beperkingen. De bepaling van de kamer Boyden is moeilijk en tijdrovend, en de bepaling van de kras wond heeft lage reproduceerbaarheid. Ontwikkeling van moderne technologieën, met name in microscopie, is de reproduceerbaarheid van de kras wond assay toegenomen. Met behulp van krachtige analysesystemen, kan een "in-incubator" video Microscoop worden gebruikt om automatisch en real-time analyse van cel migratie en invasie. Het doel van deze paper is te rapporteren en vergelijken van de twee tests gebruikt bij het bestuderen van de cel invasie en migratie: de bepaling van Boyden kamer en een geoptimaliseerde in vitro video Microscoop gebaseerde scratch wond assay.
Introduction
Cel invasie en migratie zijn betrokken bij de verspreiding van kankercellen, die de belangrijkste oorzaak van resistentie tegen behandeling1 en kunnen leiden tot regionale of metastatische herhaling na kanker behandeling2. De epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) is het eerste proces van cel invasie-migratie in welke kanker cellen van een epitheelweefsel naar een mesenchymale fenotype overschakelen. E-cadherine is een extracellulaire marker van de epitheliale fenotype-3en verhoogde expressie van N-cadherine en vimentin is kenmerkend voor de mesenchymale fenotype4. Migratie hangt ook de intrinsieke vermogen van kankercellen te vallen van de extracellulaire matrix (ECM) door de werking van matrix metalloproteasen5.
Dit mechanisme invasie-migratie is beschreven voor kanker op vele locaties, met name in hoofd en nek kanker6. Veel onderzoekers hebben gericht op de migratie en invasie processen beter te begrijpen hoe de verspreiding van de kankercellen in de hoop dat deze kennis tot nieuwe behandelingsstrategieën leiden zal. Het is van cruciaal belang dat deze studies worden uitgevoerd met behulp van betrouwbare en reproduceerbare testen.
In vitro analyse van de beweeglijkheid van de cel kan worden uitdagende. Vele jaren geleden ontwikkeld, de bepaling van Boyden kamer wordt beschouwd als de standaard voor invasie – migratie analyse7. Echter, het is tijdrovend en vaak onjuist is. Een tweede test is de wond-genezing assay8, waarbij een kras op een celkweek enkelgelaagde maken en vastleggen van beelden van cel invasie en migratie op vaste tijdstippen. Deze techniek is breed bekritiseerd wegens de grote verschillen tussen de resultaten van twee opeenvolgende tests. De toepassing van moderne technologieën, met name in microscopie, heeft echter de reproduceerbaarheid van de kras wond assay verbeterd. Video microscopen kunnen gemakkelijk worden ingevoerd in voorbroeders en real-time beelden van cel migratie kunnen genereren. Deze apparaten registreren microscopische gegevens en voorzien van automatische analyse van de wond cel samenvloeiing na verloop van tijd. Het doel van deze paper is om de bepaling van Boyden kamer en de geoptimaliseerde kras wond bepaling te beschrijven en te discussiëren over de voordelen en de zwakke punten van elke methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: De Boyden kamer en kras testen zonder opname van de ECM worden aangeduid als de bepaling van de migratie en de dezelfde testen met de ECM wordt aangeduid als de bepaling van de invasie.
1. Boyden kamer Assay
Opmerking: Dit protocol is aangepast voor de cellijn van SQ20B, die is afgeleid van een terugkerende hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) laryngeal kanker en is afkomstig van John Little (Boston, MA, USA).
Dag 1
-
Cel zaaien
- Zaad 2 106 SQ20B cellen in 12 mL gestolde voedingsbodem (CM) in een maatkolf van 175 cm2 72 h vóór dag en laat de cellen om te groeien tot 80% cel samenkomst.
- Aanvulling ter voorbereiding CM van SQ20B cellen, Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.
- Trypsinize onder de motorkap van een laminaire flow, de cellen. Verwijderen van het medium, wassen van de cellen met steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 2,5 mL trypsine ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (0,5 g/L). Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C en vervolgens zet de reactie stop door toevoeging van 12,5 mL CM opgewarmd tot 37 ° C. Het aantal cellen met behulp van een cel counter.
- Het zaad van de cellen in een maatkolf van 25 cm2 op een celdichtheid van 6-105 cellen voor elk criterium moet worden geëvalueerd. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in 3 mL CM.
- Zaad 2 106 SQ20B cellen in 12 mL gestolde voedingsbodem (CM) in een maatkolf van 175 cm2 72 h vóór dag en laat de cellen om te groeien tot 80% cel samenkomst.
Dag 2
-
Cel honger en voorbereiding van gecoate kamers
- De cellen verhongeren door vervanging van het medium in elke kolf met 3 mL laag-foetale runderserum (FBS) medium gebruik van 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in plaats van FBS. Verhongeren de cellen gedurende 24 uur in de incubator.
- Ter voorbereiding van honger CM (s-CM), een aanvulling DMEM met 0,1% BSA, 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.
- Voor de migratie assay, gaat u naar stap 1.3.
- Voor de invasie assay, 12 h voor dag 3, bereiden de gecoate Boyden kamers door toevoeging van 500 μL van s-CM aan elke beklede kamer. Gebruik van commercieel bereid gecoate Boyden kamers en houd hen bij 4 ° C vóór gebruik. Plaats elke kamer Boyden in de metgezel plaat en zet deze in de incubator bij 37 ° C's nachts.
- De cellen verhongeren door vervanging van het medium in elke kolf met 3 mL laag-foetale runderserum (FBS) medium gebruik van 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in plaats van FBS. Verhongeren de cellen gedurende 24 uur in de incubator.
Dag 3
-
Cel zaaien in de zaal van Boyden
- Gebruik de plaat metgezel ter voorbereiding van de chemoattractant. Vul elk van de 24-well metgezel plaat met 750 μL van volledige medium met 10% FBS, 0,04 mg/mL hydrocortison 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.
- Passen de chemoattractant voor elke cel-regel en de voorwaarde van elke behandeling. Ter voorbereiding van de chemoattractant CM (ca-CM), een aanvulling DMEM met 10% FCS, 0.4 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.
- Breng het Hogerhuis in de ingevulde metgezel plaat, verzorgen om te voorkomen dat de bubbels.
- Voor de invasie assay, 450 μL van CM zorgvuldig uit elke Boyden kamer te verwijderen.
- Trypsinize onder de motorkap van een laminaire flow, de cellen. Verwijderen van het medium, de cellen met steriel PBS wassen Voeg 0,5 mL trypsine EDTA (0,5 g/L) en vervolgens Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Zet de reactie stop door het toevoegen van CM opgewarmd tot 37 ° C. Het aantal cellen met behulp van een cel counter.
- Zaad 3 104 SQ20B cellen in 500 μL van 0,1% BSA medium, geven een uiteindelijke verdunning van 6 104 cellen/mL.
Opmerking: De concentratie van de cel moet worden aangepast voor elke regel van de cel. - Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Gebruik de plaat metgezel ter voorbereiding van de chemoattractant. Vul elk van de 24-well metgezel plaat met 750 μL van volledige medium met 10% FBS, 0,04 mg/mL hydrocortison 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.
Dag 4
-
Cel fixatie en kleuring
- De cellen herstellen voordat u de verdubbeling keer specifiek voor die cellijn. Fix SQ20B cellen voor 24 h.
- Elke toevoeging van de metgezel-plaat verwijderen en verwijder voorzichtig de cellen van de bovenste kamer met behulp van een wattenstaafje. Het is bijzonder belangrijk voor het verwijderen van alle cellen in de bovenste kamer gelegen.
- Fix en vlek elke plaats individueel om te verkrijgen van mei-Grunwald Giemsa kleuring9 met behulp van de kleuring kit geleverd. Als alternatief, gebruiken 4% paraformaldehyde in een andere metgezel plaat voor de fixatie van een 30 min.
- Houd de inserts in een lege 24-well metgezel plaat onder de motorkap van een laboratorium om te drogen van elke kamer.
Dag 5
-
Microscopische analyse
- Invoegen van de metgezel-plaat met de inzetstukken op een 20 fase contrast-Microscoop en tellen elke gemigreerde cel op het onderste gedeelte van het membraan. Optimaliseren van de positie van de juiste focus door het bewegen van de doelstelling van de bodem naar de top, en stoppen van de positie op het onderste gedeelte van het membraan.
- De verhouding tussen het aantal gemigreerde cellen en geplaatste cellen berekenen. Herhaal elke tellen voor elke behandeling voorwaarde in drievoud.
2. Kras wond Assay: Cel migratie
Opmerking: Instructies moeten worden aangepast voor elk type cel.
Dag 1
-
Cel zaaien
- Zaad 2 x 106 SQ20B cellen in 12 mL van CM in een maatkolf van 175 cm2 72 h vóór dag en laat de cellen om te groeien tot 80% cel samenkomst.
- Trypsinize onder de motorkap van een laminaire flow, de cellen. Verwijderen van het medium, de cellen met steriel PBS wassen Voeg 2,5 mL trypsine EDTA (0,5 g/L) en Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Zet de reactie stop door toevoeging van 12,5 mL CM opgewarmd tot 37 ° C. Het aantal cellen met behulp van een cel counter.
- Genereer een prediluted monster bij een celdichtheid van 4 x 105/mL, geven een definitieve dichtheid van 4 104 cellen per 100 μl in elk putje. Deze concentratie moet worden aangepast voor elke regel van de cel en moet in het bereik van 1 x 10,4 tot 6 104 cellen.
- Zaad-cellen in ieder putje van een 96-wells-plaat door neerlegging 100 μl van de oplossing bereid in stap 2.1.2.
- Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 min. te verspreiden van de cellen gelijkmatig over de bodem van de putten.
- Plaats van de plaat in de incubator en laat de cellen zich te houden aan de plaat gedurende 12 tot 16 uur (maximale) bij 37 ° C.
Dag 2
-
Kras wond assay
- Verwijder de platen bereid in stap 2.1 uit de incubator.
- Controleer onder de motorkap, een wond met behulp van de commerciële verwonden apparaat volgens protocol van de fabrikant.
- Onmiddellijke verwijdering van het medium van elk goed met behulp van een precisiepipet met een aangepast conische tip, zorg niet te raken van de wond.
- Het wassen van de cellen tweemaal door het herhalen van de ambitie en het gebruik van 100 μl van CM opgewarmd tot 37 ° C voor elk putje.
- Het verwijderen van de CM met behulp van een precisiepipet met een aangepast conische tip na de stappen wassen.
- Voeg 100 μl van medium specifiek voor elke behandeling voorwaarde aan elk putje.
- Probeer te vermijden dat er luchtbellen in de putjes. Een omgekeerde-pipetting techniek kan hier nuttig zijn. Ook het verwijderen van bubbels met een naald van de spuit.
- Plaats de plaat in het aangepast rack van de video Microscoop.
- Ter verbetering van de kwaliteit van de afbeelding, kunt u de plaat om te warmen gedurende ten minste 15 minuten voordat de eerste scan om te voorkomen dat condens aan de onderkant van de plaat.
- Het programma van de planning scans opgebouwd, met behulp van de video Microscoop software op één afbeelding per putje. Een maximuminterval 2-h is vereist voor een invasie-migratie-experiment. Als het doel van het experiment is om een video te produceren, heeft een interval van 30 minuten maximaal de voorkeur.
- Aan het einde van het experiment, het verwonden apparaat zorgvuldig wassen en volg elk van de vier wassen stappen aangegeven door de fabrikant.
Dagen 3, 4 en 5
-
Analyse van migratie met behulp van de video Microscoop
- Gedurende ten minste 24 uur en maximaal 5 dagen, controleren en de cel migratie.
- Gebruik een masker van de gewenste cel aangepast voor elk celtype cel migratie analyseren. Voor het verkrijgen van een masker van de cel aangepast voor elke regel van de cel, het genereren van een cel verwerken van definitie van de software met behulp van een bepaalde cel foto collectie.
- Sporen van de curven en de gegevens exporteren naar een werkblad, die kan worden gebruikt voor het analyseren en vergelijken van de resultaten.
3. Kras wond Assay: Cel invasie
Opmerking: Instructies moeten worden aangepast voor elk type cel.
Dag 1
-
Cel zaaien
- Hetzelfde protocol gebruiken voor cel zaaien zoals beschreven in stap 2.1.
Dag 2
-
Voorbereiding van de ECM
- Ontdooiing van de matrix voor ten minste 12 uur vóór gebruik bij 4 ° C. Zorg ervoor dat geen aggregaten weergegeven worden. Als aggregaten zichtbaar zijn, houden de matrix bij 4 ° C voor een langere periode tot de aggregaten verdwijnen. Houd de matrix op ijs. Gebruik precooled Pipetteer tips.
Opmerking: De matrix zal stollen zoniet bewaard bij 4 ° C. - Chill de buizen van de microcentrifuge op het ijs gedurende 5 minuten.
- Neem CM gekoeld tot 4 ° C uit de koelkast en de matrix in de buizen van de precooled microcentrifuge om een eindconcentratie van 300 μg/mL verdund.
- De microcentrifuge-buizen met prediluted matrix terug te keren naar de koelkast bij 4 ° C.
Opmerking: Een koeling rack aangepast voor microcentrifuge buizen is nuttig voor het behoud van de buizen bij 4° C gedurende het gehele experiment.
- Ontdooiing van de matrix voor ten minste 12 uur vóór gebruik bij 4 ° C. Zorg ervoor dat geen aggregaten weergegeven worden. Als aggregaten zichtbaar zijn, houden de matrix bij 4 ° C voor een langere periode tot de aggregaten verdwijnen. Houd de matrix op ijs. Gebruik precooled Pipetteer tips.
Dag 2
-
Kras wond Assay en behandeling van de ECM
- Verwijder de plaat bereid in stap 3.1 uit de incubator.
- Controleer onder de motorkap, de wond met behulp van de commerciële verwonden apparaat volgens protocol van de fabrikant.
- Onmiddellijke verwijdering van het medium van elk goed met behulp van een precisiepipet met een aangepast conische tip verzorgen niet te raken van de wond.
- Wassen van de cellen tweemaal door de aspiratie procedure herhalen en het gebruik van 100 μl van CM opgewarmd tot 37 ° C.
- Na de tweede wash, plaats u de plaat op de 4 ° C incubator aan equilibreer de temperatuur gedurende 5 minuten.
- Verwijder het koud medium uit elk putje met de pipet aspiratie met een conische tip, verzorgen Pipetteer zorgvuldig van de rand en te voorkomen dat de wond aan te raken.
- Voeg 50 l van prediluted matrix aan elk putje met behulp van precooled conische tips bij 4 ° C.
- Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
Opmerking: Een ondersteuning van het voorverwarmde rek bij 37 ° C is handig voor het versnellen van de opwarming van de aarde van de 96-wells-plaat. - Verwijderen de plaat uit de incubator en voeg 100 μl van de aangepast CM aan elk putje zoals aangegeven voor elke voorwaarde die behandeling.
- Probeer te vermijden dat er luchtbellen in de putjes. Een omgekeerde-pipetting techniek kan hier nuttig zijn. Ook het verwijderen van bubbels met een naald van de spuit.
- Plaats de plaat in het aangepast rack in de video Microscoop.
- Ter verbetering van de kwaliteit van de afbeelding, kunt u de plaat om te warmen gedurende ten minste 15 minuten voordat de eerste scan om te voorkomen dat condens aan de onderkant van de plaat.
- Het programma van de planning scans opgebouwd, met behulp van de video Microscoop software op één afbeelding per putje, in de Scratch wond scan-modus. Een maximuminterval 2-h in vereist voor een invasie-migratie-experiment. Als het doel van het experiment is om een video te produceren, heeft een interval van 30 minuten maximaal de voorkeur.
- Aan het einde van het experiment, het verwonden apparaat zorgvuldig wassen en volg elk van de vier wassen stappen aangegeven door de fabrikant.
Dagen 3, 4 en 5
-
Analyse van de invasie van de cel met behulp van een video Microscoop.
- Herhaal stap 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij rapporteren hier twee verschillende methoden voor het analyseren van de cel invasie en migratie. Figuur 1 toont de Boyden kamer experiment. De inserts zijn geplaatst in een metgezel plaat met chemoattractant medium, en de cellen worden overgeënt in CM. Het membraan kan worden gelamineerd (migratie assay) of bekleed (invasie assay). Cellen worden overgeënt in de bovenste kamer in s-CM. De tweede kamer is gevuld met CM als een chemoattractant. De cellen zijn geplaatst voor de verdubbeling tijd.
Figuur 2 toont de membraan van Boyden na fixatie van de cel. Figuur 2A toont een suboptimaal resultaat, met cel clusters op de bovenzijde van het membraan. Figuur 2B toont een optimaal resultaat met cellen vast en gekleurd in blauw op het membraan.
Figuur 3 toont een optimaal resultaat van de test van de kras wond. De lineaire wond te zien in figuur 3A. Geen cellen worden waargenomen in de wond en wondgenezing heeft plaatsgevonden binnen 30 uur. De tijd om te genezen van de wond is afhankelijk van de cellijn en varieert van 24 tot 50 h.
Figuur 3B is een grafische weergave van de wond genezing onder vier behandeling voorwaarden: controle, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximab (anti-EGFR) en ABT-199 + cetuximab. De ABT-199 + cetuximab combinatie cel migratie sterk gedaald. De bochten worden verkregen met behulp van de video Microscoop software, die robuuste data-analyse van cel migratie met de tijd biedt. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD) voor elk putje.
Negentig procent samenvloeiing is de optimale celdichtheid voor de wondgenezing assay. Het optimale cel zaaien hangt af van de cellijn en varieert van 3 x 10,4 tot 6 x 104 cellen. Figuur 4A toont de optimale celdichtheid, en cijfer 4C toont lage celdichtheid. Wells moet gewassen worden tweemaal om te voorkomen dat clusters van de cel, zoals aangegeven in figuur 4B.
Figuur 1: schematische weergave van het experiment van de kamer Boyden. Inserts worden geplaatst in een metgezel plaat met chemoattractant medium, en de cellen worden overgeënt in CM. Het membraan kunnen ongecoat (A) of bekleed (B).
Figuur 2: suboptimaal en optimale microscopische resultaten in het experiment van de kamer Boyden. (A) suboptimaal membraan met cel clusters op de bovenzijde van de membraan en uninterpretable resultaten. Schaal bar = 300 µm. (B) optimale membraan met aftelbare cellen in het onderste gedeelte van het membraan in blauw gekleurd. Schaal bar = 300 µm.
Figuur 3: optimale resultaten verkregen in de experiment wondgenezing. (A) representatieve afbeelding uit de bepaling van de kras wond wondgenezing waargenomen bij 0, 15 en 30 h komt te staan. De criteria voor een kwaliteit-experiment zijn een lineaire wond, geen cel fragmenten waargenomen in de wond, en optimale cel samenvloeiing. Schaal bar = 300 µm. (B) grafische weergave van de wondgenezing tonen kwantificering van parameters voor wond cel confluence (percentage) volgens tijd (h). Vier behandeling voorwaarden hier worden geanalyseerd, en de gegevens worden weergegeven met de SD.
Figuur 4: suboptimaal resultaten verkregen in de experiment wondgenezing. (A) ideaal celdichtheid. (B) problemen wassen van de cel-pellet. (C) lage celdichtheid. Schaal bars = 300 µm
| Voordelen | Nadelen | |
| Boyden kamer Experiment | -3D-cel Chemotaxis | -Tijdrovend |
| -Zowel de invasie en de migratie met gecoate en niet-gecoate laag matrix | -Lage reproduceerbaarheid | |
| -Dure inzetstukken | ||
| -Geen tijd-tijdspanne exploratie | ||
| -Noodzaak van Adherente cellen | ||
| Wondgenezing Assay | -Automatische zeer reproduceerbaar wond | -2D-Cell beweeglijkheid |
| -Zowel de invasie en de migratie met gecoate en niet-gecoate laag matrix | -Noodzaak van Adherente cellen | |
| -Cel proliferatie opgenomen in de analyse | ||
| -Time-Lapse microscopische visuele analyse | ||
| -Data uitvoer van wond genezing statistieken met nauwkeurige analyse | ||
| -Nabehandeling robuuste software voor cel migratie en invasie krommen |
Tabel 1: voor- en nadelen van de Boyden vergaderzaal experiment en video Microscoop wondgenezing assay. De voor- en nadelen van de kamer van Boyden experimenteren en kras wond assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij rapporteren hier twee verschillende modaliteiten te bestuderen van de cel invasie en migratie-proces. De analyse van dit proces is belangrijk voor het begrip van de factoren die betrokken zijn bij gemetastaseerde herhaling, die zou kunnen worden verklaard door de verhoogde motiliteit van een subpopulatie van kankercellen genoemd kanker stamcellen10,11.
Het experiment van Boyden kamer behoort tot de meest gebruikte technieken om te verkennen cel invasie en migratie. Een voordeel van deze aanpak is de reproduceerbaarheid, hoewel deze techniek sterk afhankelijk van de experimentator deskundigheid is. Cel tellen is handmatig en kan variëren tussen onderzoekers. Vele kritische stappen moeten worden gestandaardiseerd en volgde met zorg, zoals het gebruik van het juiste chemoattractant en honger medium specifiek voor elke regel van de cel. Cellen verwijderen uit het bovenste membraan met een wattenstaafje is ook cruciaal om het waarborgen van optimale resultaten en vermijden de suboptimaal resultaten die worden weergegeven in figuur 2A. Als deze test wordt gebruikt om de beweeglijkheid van de cel, invasie, en migratie capaciteiten door middel van een driedimensionale (3D) poreuze membraan te evalueren, is het niet mogelijk om bij te houden van de cellen tot een time-lapse experiment. Bovendien, commerciële inzetstukken met een poreuze membraan zijn vaak duur.
De bepaling van de video Microscoop gebaseerde kras wond hier gepresenteerd is een robuuste techniek cel migratie en invasie te evalueren. De test wordt uitgevoerd met een mechanische wond maker en biedt een reproduceerbare vergelijking tussen behandeling voorwaarden. De video microscopische analyse kan worden gebruikt voor het genereren van nauwkeurige kwantitatieve gegevens voor wond genezing en cel samenvloeiing via een time-lapse experiment. Tijd-aan-tijd analyse van verschillende behandeling voorwaarden kan worden bevestigd door microscopisch kleine opmerkingen. Deze analyse integreert celproliferatie tijdens de test en houdt rekening met de tijd van cel-verdubbeling. Video of ruwe inhoudsgegevens kan worden geëxporteerd met het oog op een zeer visuele weergave van de resultaten, zoals wordt weergegeven in de cel migratie curven in figuur 3B.
Vele kritische stappen zijn vereist om interpreteerbare resultaten te verkrijgen. De optimale omstandigheden voor cel zaaien zijn afhankelijk van de cellijn en moeten worden getest met verschillende verdunningen te verkrijgen 90% cel samenvloeiing in de putjes. Voor het verkrijgen van een lineaire wond, cel plating mag niet meer dan 16 h. De stap van het wassen moet worden gedaan tweemaal en snel om te voorkomen dat de invoering van cel puin in de wond die de resultaten kan veranderen. Voor de invasie kras wond, goede verzorging van de ECM is ook een cruciale stap. De koeling tarieven moet constant, en de ECM moet worden gemanipuleerd met gekoeld Pipetteer tips en onderhouden bij 4 ° C.
Deze technieken hebben vele voordelen, die zijn samengevat in tabel 1. Adherente cellen zijn nodig voor deze techniek. Krabben oorzaken mechanische schade aan de cellen, die veroorzaakt release van cellulaire inhoud in het omringende medium en invloed kunnen hebben op het migratieproces. De bepaling van de kras wond biedt een schatting van de beweeglijkheid van de 2D-cel, maar niet van cel chemotaxis, die niet kan worden bestudeerd met behulp van deze techniek. Onlangs hebben we een video microscopische chemotaxis assay met behulp van een commerciële plating-systeem ontwikkeld. Deze bepaling moet cellen met een hoge migratie-vermogen, zoals de cellen van de stam van kanker, zoals eerder beschreven12. Deze nieuwe techniek wellicht in de toekomst de gouden standaard voor invasie-migratie testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze technieken werden ontwikkeld met de steun van LabEx PRIEMGETALLEN (ANR-11-LABX-0063), de Contrat Plan-Etat-regio (CPER) in het wetenschappelijke kader van ETOILE (CPER 2009-2013), en lyrische Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
