Summary
本研究报告了两种不同的细胞浸润和迁移分析方法: 博伊登室法和体外视频 microscope-based 伤口愈合试验。对这两种实验的协议进行了描述, 并对它们的优缺点进行了比较。
Abstract
肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是癌症进展和复发的主要因素。许多研究探索了迁移和入侵的能力, 以了解癌症细胞传播, 目的是制定新的治疗策略。分析这些能力的细胞和分子基础, 导致细胞的移动性和理化性质的骨架和细胞微环境的表征。多年来, 博伊登室法和刮伤法是研究细胞侵袭和迁移的标准技术。然而, 这两种技术有局限性。博伊登室法检测困难, 费时, 刮伤法重现性低。现代技术的发展, 特别是在显微镜下, 增加了刮伤试验的重现性。利用强大的分析系统, "孵化器" 的视频显微镜可以提供自动和 real-time 的细胞迁移和入侵分析。本论文的目的是报告和比较两种方法用于研究细胞侵袭和迁移: 博伊登室法和优化的体外视频 microscope-based 刮伤法。
Introduction
细胞侵袭和迁移参与癌细胞的传播, 这是抵抗治疗的主要原因1 , 并可导致癌症治疗后的局部或转移复发2。上皮-间充质过渡 (急诊) 是细胞浸润-移行的初始过程, 癌细胞从上皮细胞转变为间质表型。e-钙黏蛋白是上皮表型的胞外标记物3, 增加的 n-钙黏蛋白和波形的表达是骨髓间质表型的特征4。迁移还取决于癌细胞的内在能力, 通过矩阵蛋白酶5的作用侵入细胞外基质 (ECM)。
这种 invasion–migration 机制已经被描述为癌症在许多地方, 特别是头颈部癌症6。许多研究人员把重点放在迁移和入侵过程上, 以便更好地理解癌细胞的传播, 希望这些知识能导致新的治疗策略。这是至关重要的, 这些研究是使用可靠和重现性的化验。
体外对细胞运动的分析可能具有挑战性。多年前, 博伊登室检测被认为是 invasion–migration 分析的标准7。然而, 它是费时, 往往是不准确的。第二个测试是伤口愈合试验8, 它涉及在细胞单层培养上进行划痕, 并在固定时间间隔捕获细胞入侵和迁移的图像。由于连续两次试验的结果相差很大, 这一技术受到了广泛的批评。然而, 现代技术的应用, 特别是在显微镜下, 提高了刮伤试验的重现性。视频显微镜可以很容易地在孵化器中引入, 并能产生细胞迁移的 real-time 图像。这些装置记录了显微镜数据, 并提供了一段时间内缠绕细胞汇流的自动分析。本文的目的是描述博伊登室法和优化的刮伤法, 并讨论每种方法的优缺点。
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Protocol
注: 不含 ecm 的博伊登室和划痕分析被称为迁移试验, 与 ecm 相同的化验被称为入侵检测。
1. 博伊登室试验
注: 本协议适用于 SQ20B 细胞系, 这是从复发头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 喉癌, 并获得从约翰小 (波士顿, 马萨诸塞州, 美国)。
1天
-
细胞播种
- 种子 2 106 SQ20B 细胞在12毫升培养基中 (cm) 在175厘米2烧瓶中72小时前一天, 允许细胞生长到80% 细胞汇合。
- 为 SQ20B 细胞准备 CM, 补充 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 与10% 胎小牛血清 (FCS), 0.04 毫克/毫升氢化可的松, 100 U/毫升青霉素, 和0.1 克/L 链霉素。
- 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 冲洗细胞, 并加入2.5 毫升的胰蛋白酶乙酸酸 (EDTA) (0.5 克/升)。孵育细胞5分钟在37° c, 然后停止反应, 增加12.5 毫升的 CM 温暖到37° c。使用单元格计数器计数单元格数。
- 在 25 cm2烧瓶中的单元格中, 对每个要计算的条件的单元密度为 6 105单元格进行种子。在3毫升的 CM 中孵育24小时的细胞。
- 种子 2 106 SQ20B 细胞在12毫升培养基中 (cm) 在175厘米2烧瓶中72小时前一天, 允许细胞生长到80% 细胞汇合。
2天
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细胞饥饿与包衣室的制备
- 用0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 代替 FBS, 用3毫升的 low-fetal 牛血清 (FBS) 培养基取代每个烧瓶中的培养基, 使细胞挨饿。在孵卵器中将细胞饿死24小时。
- 准备饥饿 cm (s cm), 补充 DMEM 与 0.1% BSA, 0.04 毫克/毫升氢化可的松, 100 U/毫升青霉素和0.1 克/L 链霉素。
- 对于迁移化验, 请转到步骤1.3。
- 为入侵试验, 12 小时在3天之前, 准备涂层的博伊登室通过增加500μ l CM 对每个被涂的房间。使用商业准备的涂层博伊登室, 并保持在4° c 使用前。将每个博伊登室放在伴板中, 并在37° c 过夜将其放在孵化器中。
- 用0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 代替 FBS, 用3毫升的 low-fetal 牛血清 (FBS) 培养基取代每个烧瓶中的培养基, 使细胞挨饿。在孵卵器中将细胞饿死24小时。
3天
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博伊登室的细胞播种
- 使用伴板来制备趋化因子。用 10% FBS、0.04 毫克/毫升的氢化可的松、100毫升青霉素和0.1 克/l 链霉素, 填充24井伴侣板的750μ l 的完整培养基。
- 适应每个细胞线和每个治疗条件的趋化因子。制备趋化蛋白 cm (ca cm), 补充 DMEM 与 10% FCS, 0.4 毫克/毫升的可的松, 100 U/毫升青霉素, 0.1 克/L 链霉素。
- 将上部腔室转换为预伴板, 注意避免气泡。
- 为入侵化验, 小心地从每个博伊登室去除450μ l CM。
- 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌 PBS 清洗细胞, 加入0.5 毫升的胰蛋白酶 (0.5 克/升), 然后在37° c 下孵育5分钟的细胞。通过增加 CM 加热到37° c 停止反应。使用单元格计数器计数单元格数。
- 种子 3 104 SQ20B 细胞在500μ l 0.1% BSA 培养基中, 最后稀释 6 104细胞/毫升。
注意: 细胞浓度应适应每个细胞系。 - 将板放入孵化箱中, 在37° c 为24小时。
- 使用伴板来制备趋化因子。用 10% FBS、0.04 毫克/毫升的氢化可的松、100毫升青霉素和0.1 克/l 链霉素, 填充24井伴侣板的750μ l 的完整培养基。
4天
-
细胞固定和染色
- 在特定于该单元格线的加倍时间之前修复单元格。在24小时前修复 SQ20B 细胞。
- 从辅助板上取下每个插入物, 用棉签小心地从上部腔中取出细胞。这是特别重要的是要删除所有的细胞位于上腔。
- 使用所提供的染色套件分别修复和着色每个插入, 以获得可格伦瓦德姬姆萨着色9 。另外, 使用4% 甲醛在另一个同伴板块中进行30分钟的固定。
- 将插入物放在一个空的24井伴侣板下, 在实验室罩下晾干每个腔室。
5天
-
显微分析
- 在20相衬显微镜上插入伴板与插入物, 并计算膜下部的每个迁移细胞。通过将目标从底部移到顶部来优化右焦点位置, 并停止膜底部的位置。
- 计算迁移细胞数与种子细胞的比值。重复每个治疗条件的每三个计数。
2. 刮伤试验: 细胞迁移
注意: 指令必须适应每种类型的单元格。
1天
-
细胞播种
- 种子 2 x 106 SQ20B 细胞在12毫升厘米在175厘米2烧瓶72小时前一天, 并允许细胞生长到80% 细胞汇合。
- 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌 PBS 洗涤细胞, 加入2.5 毫升的胰蛋白酶 EDTA (0.5 克/升), 并在37° c 下孵育5分钟的细胞。停止反应, 增加12.5 毫升的 CM 加热到37° c。使用单元格计数器计数单元格数。
- 在 4 x 105/mL 的单元格密度下生成一个小修样本, 在每个井中给出每10μ l 的 4 4100单元格的最终密度。此浓度必须适应每个单元格线, 并且应在 1 x 104到 6 104单元格的范围内。
- 通过沉积100μ l 在步骤2.1.2 中制备的溶液, 将种子细胞放入96井板的每一个井中。
- 将板材置于室温下5分钟, 将细胞均匀地分散在井底。
- 将板放入孵化箱中, 并允许电池在37° c 时附着在12至 16 h (最大) 的板上。
2天
-
刮伤试验
- 从孵化器中取出步骤2.1 中准备的盘子。
- 在引擎盖下, 根据制造商的协议, 用商业伤人装置制造伤口。
- 立即从每个井中取出介质, 使用一个适应锥尖端的吸管, 注意不要碰到伤口。
- 两次洗涤细胞通过重复的愿望和使用100μ l CM 温暖到37° c 每井。
- 在洗涤步骤后, 用吸管与一个适应的锥形尖端移除 CM。
- 每一个良好的治疗条件, 添加100μ l 介质。
- 尽量避免在油井中产生气泡。反向移技术在这里可能会有所帮助。或者, 用注射器针除去气泡。
- 把盘子放到视频显微镜的改装架上。
- 为了提高图像质量, 允许板在第一次扫描前至少预热15分钟, 以避免板的下侧凝结。
- 计划扫描的时间表, 使用视频显微镜软件在一个图像每井。入侵迁移试验需要最大2小时间隔。如果实验的目的是制作一个视频, 一个间隔30分钟的最大值是首选。
- 在实验结束时, 仔细清洗伤人装置, 并按照制造商指示的四洗涤步骤进行操作。
天 3, 4, 和5
-
利用视频显微镜进行偏移分析
- 至少24小时和5天, 监测和检查细胞迁移。
- 使用适合每个单元格类型的适当的单元掩码来分析单元格迁移。若要获取适合于每个单元格线的单元掩码, 请使用特定的单元格图像集合从软件生成单元格处理定义。
- 跟踪曲线并将数据导出到电子表格, 可用于分析和比较结果。
3. 刮伤试验: 细胞侵袭
注意: 指令必须适应每种类型的单元格。
1天
-
细胞播种
- 如步骤2.1 所述, 对单元播种使用相同的协议。
2天
-
准备 ECM
- 在4° c 使用前, 将基体解冻至少12小时。确保没有可见的聚合。如果聚集体是可见的, 保持矩阵在4° c 较长的时期, 直到聚合体消失。把母体放在冰上使用冷吸管提示。
注: 如果不保持在4° c, 基体将凝固。 - 在冰上冷却离心管5分钟。
- 采取 CM 冷却到4° c 从冰箱和稀释基体在冷离心管子获得最后的集中300微克/毫升。
- 返回离心管与小修矩阵到冰箱在4° c。
注: 适用于离心管的冷却机架有助于在整个实验中保持4° c 的管子。
- 在4° c 使用前, 将基体解冻至少12小时。确保没有可见的聚合。如果聚集体是可见的, 保持矩阵在4° c 较长的时期, 直到聚合体消失。把母体放在冰上使用冷吸管提示。
2天
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ECM 的伤伤分析及处理
- 从孵化器中取出步骤3.1 中准备的盘子。
- 在引擎盖下, 根据制造商的协议使伤口使用商业伤人装置。
- 立即从每个井中取出介质, 使用吸管与适应的锥形尖端, 注意不要触摸伤口。
- 通过重复吸入程序和使用100μ l 的 CM 加热到37° c, 清洗两次细胞。
- 第二次洗涤后, 将板放在4° c 恒温箱上, 平衡其温度为5分钟。
- 取出每个井中的冷媒, 用锥形尖端吸管, 小心地从边缘移开吸管, 避免碰到伤口。
- 在4° c 的情况下使用冷锥尖, 将50μ l 的小修矩阵添加到每个井中。
- 把盘子放在37° c 的孵卵器里30分钟。
注:37 ° c 的 prewarmed 支撑架有助于加速96井板的升温。 - 从孵化箱中取出盘子, 并在每种治疗条件下加100μ l 的适应 CM。
- 尽量避免在油井中产生气泡。反向移技术在这里可能会有所帮助。或者, 用注射器针除去气泡。
- 在视频显微镜下把盘子放到适应的货架上。
- 为了提高图像质量, 允许板在第一次扫描前至少预热15分钟, 以避免板的下侧凝结。
- 计划扫描的时间表, 使用视频显微镜软件在一个图像每井, 在划伤扫描模式。入侵迁移试验所需的最大2小时间隔。如果实验的目的是制作一个视频, 一个间隔30分钟的最大值是首选。
- 在实验结束时, 仔细清洗伤人装置, 并按照制造商指示的四洗涤步骤进行操作。
天 3, 4, 和5
-
利用视频显微镜对细胞浸润进行分析。
- 重复步骤2.3。
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Representative Results
我们在这里报告两种不同的方法来分析细胞入侵和迁移。图 1显示了博伊登室实验。插入物被放置在具有趋化介质的伴板中, 细胞在 CM 中播种。该膜可以被涂覆 (迁移化验) 或涂层 (入侵检测)。细胞在 s CM 中被播种入上部房间。下部腔内填充 CM 作为趋化因子。细胞在加倍的时间之前被固定。
图 2显示了细胞固定后的博伊登膜。图 2A显示了一个次优结果, 在膜的上部有细胞簇。图 2B显示了在膜上固定和染成蓝色的单元格的最佳结果。
图 3显示了刮伤检测的最佳结果。线性伤口可以在图 3A中看到。在伤口处没有观察到细胞, 伤口愈合发生在30小时内。愈合伤口的时间取决于细胞系, 从24到50小时不等。
图 3B是四治疗条件下伤口愈合的图形表示: 控制、ABT-199 (anti-Bcl-2)、单 (抗 EGFR) 和 ABT-199+cetuximab。ABT-199+cetuximab 组合明显减少细胞迁移。利用视频显微镜软件对曲线进行了研究, 为细胞迁移提供了可靠的数据分析。误差线表示每个井的标准差 (SD)。
90% 融合是伤口愈合试验的最佳细胞密度。最佳单元播种取决于单元格线, 范围从 3 x 104到 6 x 104单元格。 图 4A显示最佳单元格密度, 图 4C显示低单元格密度。井应该洗两次, 以避免细胞簇, 如图 4B所示。
图 1: 博伊登室实验的示意图表示.将插入物放在带有趋化剂培养基的伴板中, 细胞在 CM 中播种。膜可以涂覆 (A) 或涂层 (B)。
图 2: 在博伊登室实验中获得的次优和最佳显微结果.(A) 在膜上部有细胞簇的次优膜和 uninterpretable 结果。缩放条 = 300 µm. (B) 在膜下部的可数细胞的最佳膜染色蓝色。缩放条 = 300 µm。
图 3: 伤口愈合实验中获得的最佳结果.(A) 有代表性的图像从刮伤的分析显示伤口愈合观察在 0, 15, 和30小时。质量实验的标准是线性伤口, 在伤口处没有观察到细胞碎片, 以及最佳的细胞融合。缩放栏 = 300 µm. (B) 伤口愈合的图示显示, 根据时间 (h) 对伤口细胞汇合 (百分数) 参数进行量化。对四处理条件进行了分析, 并对 SD 进行了数据显示。
图 4: 创伤愈合实验中获得的次优结果.(A) 理想的细胞密度。(B) 清洗细胞颗粒的问题。(C) 低细胞密度。缩放条形图 = 300 µm
| 优势 | 缺点 | |
| 博伊登室实验 | -3 d-细胞趋化 | -耗时 |
| -侵入和迁移与涂层和非涂层层矩阵 | -低再现性 | |
| -昂贵的刀片 | ||
| -没有时间流逝的探索 | ||
| -需要黏附细胞 | ||
| 伤口愈合试验 | -自动高度再生伤口 | -2 d-细胞运动 |
| -侵入和迁移与涂层和非涂层层矩阵 | -需要黏附细胞 | |
| -细胞增殖包括在分析中 | ||
| -时间推移显微视觉分析 | ||
| -精确分析伤口愈合指标的数据输出 | ||
| -后处理健壮的细胞迁移和侵袭曲线软件 |
表 1: 博伊登室实验和视频显微镜伤口愈合试验的优缺点。博伊登室实验和刮伤试验的优缺点。
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Discussion
我们在这里报告两种不同的模式来研究细胞入侵和迁移过程。对这一过程的分析对于了解转移复发的因素是很重要的, 这可能是由于癌细胞亚群的增加运动而解释为肿瘤干细胞10,11。
博伊登室实验是研究细胞侵袭和迁移的最常用技术之一。这种方法的一个优点是它的重现性, 虽然这项技术是高度依赖于实验者的专长。细胞计数是手动的, 可以不同的实验者。必须对许多关键步骤进行标准化和谨慎处理, 例如确保使用适当的趋化因子和饥饿培养基, 具体到每个细胞线。用棉签从上膜中取出细胞对于确保最佳结果和避免图 2A中显示的次优结果也是至关重要的。如果通过三维 (3D) 多孔膜对细胞的运动、侵袭和迁移能力进行评估, 就不可能通过延时实验来追踪细胞。此外, 带有多孔膜的商用刀片通常是昂贵的。
本文提出的视频 microscope-based 划伤的检测方法是一种评价细胞迁移和侵袭的强有力的技术。该化验是由一个机械伤口制造商, 并提供了一个可重复的治疗条件之间的比较。通过延时实验, 可以利用视频显微分析方法, 为创面愈合和细胞融合生成精确的定量数据。时间分析不同的处理条件可以通过显微观察得到证实。这种分析结合细胞增殖过程中的试验, 并考虑到细胞倍增时间。可以导出视频或原始数据内容, 以获取结果的高度可视化表示形式, 如图 3B中的单元格迁移曲线所示。
需要许多关键步骤才能获得解释的结果。细胞播种的最佳条件取决于细胞系, 必须用不同的稀释进行测试, 以获得90% 细胞汇流。要获得一个线性的伤口, 细胞电镀不得超过16小时。清洗步骤必须进行两次和迅速, 以避免引入细胞碎片的伤口, 可能会改变的结果。对于入侵刮伤, 适当的处理 ECM 也是一个关键的步骤。冷却速度必须是恒定的, 并且 ECM 应该用冷冻的吸管技巧操作并且保持在4° c。
这些技术有许多优点, 在表1中作了总结。这项技术需要贴附细胞。抓伤会导致细胞的机械损伤, 从而导致将细胞的内容释放到周围的介质中, 并可能影响迁移过程。刮伤试验提供了一个2D 细胞运动的估计, 而不是细胞趋化性, 这是不能使用这种技术进行研究。我们最近开发了一个视频微观趋化分析使用商业电镀系统。这种检测需要具有高迁移能力的细胞, 如癌症干细胞, 如前所述12。这种新的技术可能成为未来入侵-迁移试验的黄金标准。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这些技术是在 LabEx 素数 (ANR-11-LABX-0063) 的支持下开发的, 合同计划-地区 (CPER) 在星辰广场 (CPER 2009-2013) 的科学框架内, 以及抒情格补助金 INCa-DGOS-4664。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
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