Summary
Diese Studie berichtet zwei verschiedene Methoden für die Analyse der Zelle Invasion und Migration: Boyden Kammer Assay und der in-vitro- video Mikroskop-basierte Wundheilung Assay. Die Protokolle für diese zwei Experimente werden beschrieben und ihre Vorteile und Nachteile gegenüber.
Abstract
Die Invasion und Migration Fähigkeiten von Tumorzellen sind Hauptursachen für Krebs Fortschreiten und Wiederkehr. Viele Studien haben untersucht, die Migration und Invasion Fähigkeiten zu verstehen, wie Krebszellen zu verbreiten, mit dem Ziel neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Analyse der zellulären und molekularen Grundlagen dieser Fähigkeiten führte zu der Charakterisierung der Zelle Mobilität und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Zytoskeletts und zelluläre Mikroumgebung. Seit vielen Jahren haben der Boyden Kammer Assay und der Kratzer Wunde Assay die Standardtechniken Zellinvasion und Migration zu studieren. Beide Techniken haben jedoch Einschränkungen. Boyden Kammer Assay ist schwierig und zeitaufwendig, und Kratzer Wunde Assay hat niedrige Reproduzierbarkeit. Entwicklung moderner Technologien, vor allem in der Mikroskopie ist die Reproduzierbarkeit des Scratch Wunde Assays gestiegen. Verwenden leistungsstarke Analyse-Systeme, ein "Inkubator" Videomikroskop lässt sich automatisch und in Echtzeit Analyse der Zelle Migration und Invasion. Das Ziel dieses Papiers ist, zu berichten und vergleichen die beiden Assays verwendet, um Zelle Invasion und Migration zu untersuchen: Boyden Kammer Assay und eine optimierte in-vitro- video Mikroskop-basierte Scratch Wunde Assay.
Introduction
Zellinvasion und Migration sind die Verbreitung von Krebszellen, die die Hauptursache der Widerstand gegen die Behandlung1 ist beteiligt und können zu locoregionaler oder metastasierten Rezidiv nach Krebs Behandlung2führen. Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist der erste Prozess der Invasion-Zellwanderung in welcher Krebs Zellen mesenchymalen Phänotyp aus einer epithelialen wechseln. E-Cadherin ist eine extrazelluläre Marker der epithelialen Phänotyps3und erhöhte Expression von N-Cadherin und Vimentin ist charakteristisch für die mesenchymalen Phänotyp4. Migration hängt auch von der Fähigkeit von Krebszellen, die extrazelluläre Matrix (ECM) zu erobern durch das Wirken des Matrix-Metalloproteasen-5.
Diese Invasion – Migration-Mechanismus wurde für Krebs an vielen Orten, vor allem im Kopf-Hals-Krebs-6beschrieben. Viele Forscher konzentrierten sich auf die Migration und Invasion Prozesse besser zu verstehen, wie Krebszellen in der Hoffnung zu verbreiten, die dieses Wissen zu neuen Behandlungsstrategien führen wird. Es ist wichtig, dass diese Studien mit zuverlässige und reproduzierbare Tests durchgeführt werden.
In-vitro- Analyse der Zelle Motilität kann schwierig sein. Vor vielen Jahren entwickelte der Boyden Kammer-Test gilt der Standard für Invasion – Migration Analyse7. Aber es kostet Zeit und ist oft ungenau. Ein zweiter Test ist die Wundheilung Assay8, beinhaltet einen Kratzer auf einer Zellkultur Monolage und Aufnahmen der Zelle Invasion und Migration in festen Zeitabständen. Diese Technik ist weithin wegen der großen Schwankungen zwischen den Ergebnissen von zwei aufeinanderfolgenden Tests kritisiert worden. Allerdings hat die Anwendung moderner Technologien, vor allem in der Mikroskopie, die Reproduzierbarkeit des Scratch Wunde Tests verbessert. Video-Mikroskope können leicht in Inkubatoren eingeführt werden und können in Echtzeit Bilder von Zellwanderung erzeugen. Diese Geräte zeichnen mikroskopische Daten und bieten automatische Analyse der Wunde Zelle Zusammenfluss im Laufe der Zeit. Das Ziel dieses Papiers ist Boyden Kammer Assay und optimierte Scratch Wunde Assay zu beschreiben und um die Vorteile und Schwächen der einzelnen Ansätze zu diskutieren.
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Protocol
Hinweis: Die Boyden Kammer und Scratch-Assays ohne Einbeziehung des ECM werden als des Migration-Tests bezeichnet, und die gleichen Tests mit der ECM nennt man die Invasion-Assay.
(1) Boyden Kammer Assay
Hinweis: Dieses Protokoll eignet sich für die SQ20B-Zell-Linie, die ergibt sich aus einer wiederkehrenden Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) Kehlkopfkrebs und wurde von John erhalten wenig (Boston, MA, USA).
Tag1
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Zelle, die Aussaat
- Samen 2 106 SQ20B Zellen in 12 mL Kulturmedium (CM) in einem 175 cm2 Kolben 72 h vor dem ersten Tag und die Zellen bis zu 80 % Zelle Zusammenfluss wachsen lassen.
- Um CM SQ20B Zellen vorzubereiten, ergänzen Sie Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 0,04 mg/mL Hydrocortison, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
- Unter einem Laminar-Flow-Haube trypsinize der Zellen. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und 2,5 mL Trypsin Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,5 g/L). Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C und beenden Sie dann die Reaktion durch Zugabe von 12,5 mL CM auf 37 ° c erwärmt Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.
- Samen der Zellen in einem 25 cm2 Kolben in einer Zelle Dichte von 6 105 Zellen für jede Bedingung ausgewertet werden. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in 3 mL CM.
- Samen 2 106 SQ20B Zellen in 12 mL Kulturmedium (CM) in einem 175 cm2 Kolben 72 h vor dem ersten Tag und die Zellen bis zu 80 % Zelle Zusammenfluss wachsen lassen.
Tag2
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Zelle verhungern und Vorbereitung der beschichteten Kammern
- Verhungern Sie die Zellen, indem Sie das Medium in jedem Kolben mit 3 mL niedrig-fötalen Rinderserum (FBS) Medium mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) anstelle von FBS. Verhungern Sie die Zellen für 24 h in den Inkubator.
- Ergänzen Sie um Hunger CM (s-CM) vorbereiten, DMEM mit 0,1 % BSA, 0,04 mg/mL Hydrocortison, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
- Gehen Sie für die Migration-Assay zu Schritt 1.3.
- Für die Invasion-Assay bereiten 12 h vor Tag 3, die beschichteten Boyden-Kammern durch Zugabe von 500 μl von s-CM zu jeder beschichteten Kammer. Kommerziell hergestellte beschichtete Boyden Kammern zu verwenden und bei 4 ° C vor dem Gebrauch aufbewahren. Legen Sie jede Boyden Kammer in die Begleiter-Platte und legen Sie es über Nacht im Brutschrank bei 37 ° C.
- Verhungern Sie die Zellen, indem Sie das Medium in jedem Kolben mit 3 mL niedrig-fötalen Rinderserum (FBS) Medium mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) anstelle von FBS. Verhungern Sie die Zellen für 24 h in den Inkubator.
Tag3
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Zelle in der Boyden Kammer Aussaat
- Verwenden Sie die Begleiter-Platte, um die Lockstoffgradient vorzubereiten. Füllen Sie jeweils auch der 24-Well Begleiter Platte mit 750 μl des kompletten Medium mit 10 % FBS, 0,04 mg/mL Hydrocortison 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
- Passen Sie die Lockstoffgradient für jede Zelllinie und jede Behandlung Bedingung. Zur Vorbereitung der Lockstoffgradient CM (ca-CM) ergänzen Sie DMEM mit 10 % FCS, 0,4 mg/mL Hydrocortison, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
- Übertragen Sie die obere Kammer in die vorgefüllten Begleiter-Platte, kümmert sich um Luftblasen zu vermeiden.
- Entfernen Sie für die Invasion-Assay vorsichtig 450 μL cm von jeder Boyden Kammer.
- Unter einem Laminar-Flow-Haube trypsinize der Zellen. Entfernen Sie das Medium, die Zellen mit sterilen PBS waschen, 0,5 mL Trypsin EDTA (0,5 g/L) zugeben und dann die Zellen für 5 min bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von CM auf 37 ° c erwärmt Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.
- 3 104 SQ20B Samenzellen in 500 μl von 0,1 % BSA Medium, geben eine Endverdünnung von 6 104 Zellen/mL.
Hinweis: Die Zellkonzentration sollte für jede Zelllinie angepasst werden. - Legen Sie die Platte in den Brutschrank bei 37 ° C für 24 h.
- Verwenden Sie die Begleiter-Platte, um die Lockstoffgradient vorzubereiten. Füllen Sie jeweils auch der 24-Well Begleiter Platte mit 750 μl des kompletten Medium mit 10 % FBS, 0,04 mg/mL Hydrocortison 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
Tag 4
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Zelle Fixierung und Färbung
- Befestigen Sie die Zellen vor der Verdopplungszeit spezifisch für die Zell-Linie. SQ20B Zellen vor 24 h zu beheben.
- Entfernen Sie jeder Einsatz von der Begleiter Platte und entfernen Sie vorsichtig die Zellen aus der oberen Kammer mit einem Wattestäbchen. Es ist besonders wichtig, alle Zellen in der oberen Kammer zu entfernen.
- Fix und Fleck legen Sie individuell, um May-Grünwald-Giemsa Färbung9 mit dem Färbung Kit zur Verfügung gestellt zu bekommen. Alternativ können Sie 4 % Paraformaldehyd in einem anderen Begleiter Platte für 30 min fixieren.
- Halten Sie die Einsätze in eine leere 24 wohlen Begleiter Platte unter eine Haube Labor jede Kammer trocken.
Tag 5
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Mikroskopische Analyse
- Legen Sie die Begleiter-Platte mit den Einsätzen auf dem 20 Phasenkontrast-Mikroskop und zählen Sie jedes migrierte Zelle im unteren Teil der Membran. Optimieren Sie die richtige Fokuslage zu, indem das Ziel bewegt sich von unten nach oben aus, bis die Position auf dem Unterteil der Membran.
- Berechnen Sie das Verhältnis zwischen der Zahl der migrierten Zellen und Zellen ausgesät. Jede Wiederholungsanzahl für jede Behandlung Bedingung in dreifacher Ausfertigung.
(2) neu gewickelt Assay: Zellwanderung
Hinweis: Anweisungen müssen für jede Art von Zelle angepasst werden.
Tag1
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Zelle, die Aussaat
- Samen 2 x 106 SQ20B Zellen in 12 mL CM in einem 175 cm2 Kolben 72 h vor dem ersten Tag und die Zellen bis zu 80 % Zelle Zusammenfluss wachsen lassen.
- Unter einem Laminar-Flow-Haube trypsinize der Zellen. Entfernen Sie das Medium, die Zellen mit sterilen PBS waschen, 2,5 mL Trypsin EDTA (0,5 g/L) zugeben und die Zellen für 5 min bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 12,5 mL CM auf 37 ° c erwärmt Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.
- Erzeugen Sie eine vorverdünnten Probe in einer Zelle Dichte von 4 x 105/mL, eine endgültige Dichte von 4-104 Zellen pro 100 μL in jede Vertiefung geben. Diese Konzentration sollte muss für jede Zelllinie angepasst werden und im Bereich von 1 x 104 bis 6 104 LiPo-Zellen.
- Samenzellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte durch Hinterlegung 100 μl der Lösung im Schritt 2.1.2 vorbereitet.
- Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5 min um die Zellen auf dem Boden der Näpfchen gleichmäßig zu verteilen.
- Die Platte in den Brutkasten und erlauben Sie die Zellen zur Einhaltung der Platte für 12 bis 16 h (maximal) bei 37 ° C.
Tag2
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Kratzen der Wunde assay
- Entfernen Sie die Platten in Schritt 2.1 aus dem Inkubator vorbereitet.
- Machen Sie unter der Haube eine Wunde mit dem kommerziellen verletzte Gerät laut Protokoll des Herstellers.
- Sofort entfernen Sie das Medium aus jeder gut mit einer Pipette mit einer angepassten konische Spitze, kümmert sich um die Wunde nicht berühren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal durch die Aspiration zu wiederholen und mit 100 μL von CM auf 37 ° C für jedes gut erwärmt.
- Entfernen Sie die CM mit einer Pipette mit einer angepassten konische Spitze nach der Waschschritte.
- Jedes gut 100 μL des Mediums, die spezifisch für jede Behandlung Bedingung hinzufügen.
- Versuchen Sie zu vermeiden, Luftblasen in den Brunnen. Eine umgekehrte Pipettieren Technik kann hier hilfreich sein. Alternativ entfernen Sie Luftblasen mit einer Spritzennadel.
- Legen Sie die Platte in die angepasst Rack mit dem Videomikroskop.
- Um die Bildqualität zu verbessern, lassen Sie die Platte zu warm für mindestens 15 Minuten vor dem ersten Scan zur Vermeidung von Kondensation auf der Unterseite der Platte.
- Programmieren Sie den Zeitplan für die Scans mit dem Videomikroskop-Software auf einem Bild pro Bohrloch. Ein maximales 2-h-Intervall ist erforderlich für eine Invasion-Migration-Experiment. Wenn das Ziel des Experiments ist es, ein Video zu produzieren, ist ein Intervall von 30 Minuten maximale bevorzugt.
- Am Ende des Experiments waschen Sie das verletzte Gerät sorgfältig und folgen Sie jeweils vier Waschschritte, die vom Hersteller angegebenen.
Tag 3, 4 und 5
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Analyse der Migration das video Mikroskop
- Überwachen Sie für ein Minimum von 24 h und bis zu 5 Tage und überprüfen Sie die Zellwanderung.
- Verwenden Sie eine entsprechende Zelle Maske angepasst für jeden Zelltyp Zellwanderung zu analysieren. Um eine Zelle Maske angepasst für jede Zelllinie zu erhalten, erzeugen Sie eine Zelle Verarbeitung Definition aus der Software über eine bestimmte Zelle Bildersammlung.
- Verfolgen Sie die Kurven und exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation, die verwendet werden kann, zu analysieren und vergleichen Sie die Ergebnisse.
3. neu gewickelt Assay: Zellinvasion
Hinweis: Anweisungen müssen für jede Art von Zelle angepasst werden.
Tag1
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Zelle, die Aussaat
- Verwenden Sie das gleiche Protokoll für die Zelle Aussaat, wie unter Punkt 2.1 beschrieben.
Tag2
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Vorbereitung der ECM
- Tauen Sie die Matrix für mindestens 12 Stunden vor Gebrauch bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, dass keine Aggregate sichtbar sind. Wenn Aggregate sichtbar sind, halten Sie die Matrix bei 4 ° C über einen längeren Zeitraum, bis die Aggregate verschwinden. Halten Sie die Matrix auf Eis. Verwenden Sie vorgekühlt Pipettenspitzen.
Hinweis: Die Matrix verfestigen wird wenn nicht bei 4 ° c aufbewahrt - Kühlen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen für 5 min auf Eis.
- CM auf 4 ° C gekühlt aus dem Kühlschrank und verdünnen Sie die Matrix in die vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen, eine Endkonzentration von 300 μg/mL zu erhalten.
- Rückkehr der Mikrozentrifugenröhrchen mit vorverdünnten Matrix wieder in den Kühlschrank bei 4 ° c
Hinweis: Eine Rack-Kühlung für Mikrozentrifugenröhrchen angepasst ist hilfreich für die Aufrechterhaltung der Rohre bei 4° C während des Experiments.
- Tauen Sie die Matrix für mindestens 12 Stunden vor Gebrauch bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, dass keine Aggregate sichtbar sind. Wenn Aggregate sichtbar sind, halten Sie die Matrix bei 4 ° C über einen längeren Zeitraum, bis die Aggregate verschwinden. Halten Sie die Matrix auf Eis. Verwenden Sie vorgekühlt Pipettenspitzen.
Tag2
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Scratch Wunde Assay und Behandlung des ECM
- Entfernen Sie die in Schritt 3.1 aus dem Inkubator vorbereitet.
- Machen Sie unter der Haube die Wunde mit dem kommerziellen verletzte Gerät laut Protokoll des Herstellers.
- Sofort entfernen Sie das Medium aus jeder gut mit einer Pipette mit einer angepassten konische Spitze kümmert sich um die Wunde nicht berühren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal durch die Aspiration zu wiederholen und mit 100 μL von CM auf 37 ° c erwärmt
- Legen Sie nach dem zweiten waschen die Platte auf 4 ° C Inkubator, seine Temperatur für 5 min equilibrate.
- Entfernen Sie das kalte Medium aus jedem Brunnen mit der Pipette Absaugen mit einer kegelförmigen Spitze, kümmert sich um pipette vorsichtig vom Rand und zu vermeiden, berühren die Wunde.
- Jedes gut vorgekühlt konischen Spitzen bei 4 ° c mit fügen Sie 50 μL vorverdünnten Matrix hinzu
- Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 ° C für 30 Minuten.
Hinweis: Eine vorgewärmte Unterstützung Rack bei 37 ° C ist hilfreich, um die Erwärmung der 96-Well-Platte zu beschleunigen. - Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 μL des angepassten CM in jede Vertiefung für jede Behandlung Bedingung angegebenen hinzu.
- Versuchen Sie zu vermeiden, Luftblasen in den Brunnen. Eine umgekehrte Pipettieren Technik kann hier hilfreich sein. Alternativ entfernen Sie Luftblasen mit einer Spritzennadel.
- Legen Sie die Platte in das angepasste Rack im video Mikroskop.
- Um die Bildqualität zu verbessern, lassen Sie die Platte zu warm für mindestens 15 Minuten vor dem ersten Scan zur Vermeidung von Kondensation auf der Unterseite der Platte.
- Programmieren Sie den Zeitplan für die Scans mit dem Videomikroskop-Software auf einem Bild pro Bohrloch im Scratch gewickelt-Scan-Modus. Ein maximale 2-h-Intervall in erforderlich für eine Invasion-Migration-Experiment. Wenn das Ziel des Experiments ist es, ein Video zu produzieren, ist ein Intervall von 30 Minuten maximale bevorzugt.
- Am Ende des Experiments waschen Sie das verletzte Gerät sorgfältig und folgen Sie jeweils vier Waschschritte, die vom Hersteller angegebenen.
Tag 3, 4 und 5
-
Analyse der Zellinvasion unter Verwendung eines video-Mikroskops.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3.
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Representative Results
Wir berichten hier zwei verschiedene Methoden zur Analyse von Zellinvasion und Migration. Abbildung 1 zeigt die Boyden Kammer Experiment. Die Einsätze werden in eine Begleiter-Platte mit Lockstoffgradient Medium, und die Zellen sind in CM ausgesät. Die Membran kann unbeschichtet (Migration Assay) oder beschichtet (Invasion Assay). Zellen sind in der oberen Kammer in s-CM ausgesät. Die untere Kammer ist gefüllt mit CM als eine Lockstoffgradient. Die Zellen sind bevor die Verdopplungszeit fixiert.
Abbildung 2 zeigt die Boyden Membran nach der Fixierung der Zelle. Abbildung 2A zeigt einen suboptimalen Ergebnis mit Zellcluster auf der oberen Seite der Membran. Abbildung 2 b zeigt ein optimales Ergebnis mit Zellen fixiert und gefärbt in blau auf der Membran.
Abbildung 3 zeigt ein optimales Ergebnis des Scratch Wunde Assays. Die lineare Wunde sehen in Abbildung 3A. Keine Zellen werden in die Wunde beobachtet und Wundheilung innerhalb von 30 h aufgetreten ist. Die Zeit, um die Wunde zu heilen ist abhängig von der Zelllinie und reicht von 24 bis 50 h.
Abbildung 3 b ist eine grafische Darstellung der Wundheilung unter vier Behandlungsbedingungen: Kontrolle, ABT-199 (Anti-Bcl-2), Cetuximab (Anti-EGFR) und ABT-199 + Cetuximab. Die ABT-199 + Cetuximab Kombination signifikant verringert Zellmigration. Die Kurven werden erzielt mit dem Videomikroskop-Software, die robuste Datenanalyse der Zellwanderung mit der Zeit liefert. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (SD) für jedes gut.
Neunzig Prozent Confluence ist die optimale Zelldichte für die Wundheilung Assay. Die optimale Zelle Aussaat richtet sich nach der Zell-Linie und reicht von 3 x 104 bis 6 x 104 LiPo-Zellen. Abbildung 4A zeigt die optimale Zelldichte und Abbildung 4 zeigt niedrige Zelldichte. Wells sollten gewaschen werden, zweimal um Zellcluster, zu vermeiden, wie in Abbildung 4 bdargestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Experiments Boyden Kammer. Einsätze sind in eine Begleiter-Platte mit Lockstoffgradient Medium gegeben, und die Zellen sind in CM ausgesät. Die Membran kann unbeschichtet (A) oder beschichteten (B).
Abbildung 2: suboptimale und optimale mikroskopischen Ergebnisse in der Boyden Kammer Experiment. (A) Suboptimal Membran mit Zellcluster auf der oberen Seite der Membran und nicht interpretierbar Ergebnisse. Maßstabsleiste = 300 µm. (B) optimale Membran mit zählbaren Zellen im unteren Teil der Membran in blau gefärbt. Maßstabsleiste = 300 µm.
Abbildung 3: optimale Ergebnisse in der Wundheilung Experiment. (A) repräsentatives Bild von Scratch Wunde Assays gezeigt Wundheilung beobachtet bei 0, 15 und 30 h. Die Kriterien für ein Qualität-Experiment sind eine lineare Wunde keine Zellfragmente in die Wunde und optimale Zelle Zusammenfluss beobachtet. Maßstabsleiste = 300 µm. (B) grafische Darstellung der Wundheilung zeigt Quantifizierung der Parameter der Wunde Zelle Zusammenfluss (in Prozent) nach Zeit (h). Vier Behandlungsbedingungen werden hier analysiert und die Daten werden angezeigt, mit der SD.
Abbildung 4: suboptimale Ergebnisse in der Wundheilung Experiment. (A) ideale Zelldichte. (B) Probleme der Zelle Pellet waschen. (C) gering Zelldichte. Skalieren von Balken = 300 µm
| Vorteile | Nachteile | |
| Boyden Kammer Experiment | -3D-Cell Chemotaxis | -Zeit- |
| -Sowohl Invasion und Migration mit beschichteten und nicht beschichteten Schicht matrix | -Geringe Reproduzierbarkeit | |
| -Teure Einsätze | ||
| -Keine Time-Lapse exploration | ||
| -Notwendigkeit der adhärenten Zellen | ||
| Wundheilung Assay | -Automatische hoch reproduzierbare gewickelt | -2D-Zelle Motilität |
| -Sowohl Invasion und Migration mit beschichteten und nicht beschichteten Schicht matrix | -Notwendigkeit der adhärenten Zellen | |
| -Zellproliferation in die Analyse einbezogen | ||
| -Zeitraffer mikroskopisch kleine visuelle Analyse | ||
| -Daten Export von Wunde heilende Metriken mit genauen Analyse | ||
| -Nachbehandlung robuste Software für Zelle Migration und Invasion Kurven |
Tabelle 1: vor- und Nachteile der Boyden Kammer Experiment und Videomikroskop Wundheilung Assay. Die vor- und Nachteile der Boyden Kammer experimentieren und neu gewickelt Assay.
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Discussion
Wir berichten hier zwei verschiedene Modalitäten Zellprozess Invasion und Migration zu studieren. Die Analyse dieses Prozesses ist wichtig für das Verständnis der Faktoren bei metastasierendem Wiederholung, die durch erhöhte Motilität der eine Subpopulation von Krebszellen, die sogenannten Krebs-Stammzellen10,11erklärt werden könnte.
Boyden Kammer Experiment ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken, erkunden Zell-Invasion und Migration. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist seine Reproduzierbarkeit, obwohl diese Technik stark abhängig von der Experimentator Know-how ist. Zellzählung erfolgt manuell und kann variieren zwischen Experimentatoren. Viele wichtige Schritte müssen standardisiert und mit Sorgfalt, wie die Sicherstellung der Verwendung des entsprechenden Lockstoffgradient und Hunger Mediums spezifisch für jede Zelllinie gefolgt. Zellen aus der oberen Membran mit einem Wattestäbchen entfernen ist auch entscheidend für optimale Ergebnisse zu gewährleisten und die suboptimale Ergebnisse in Abbildung 2Azu vermeiden. Wenn dieser Test verwendet wird, um die Zelle Motilität, Invasion und Migration Kapazitäten durch eine dreidimensionale (3D) poröse Membran zu bewerten, ist es nicht möglich, Zellen durch ein Time-Lapse Experiment zu verfolgen. Darüber hinaus sind kommerzielle Einsätze mit einer porösen Membran oft teuer.
Die hier vorgestellten video Mikroskop-basierte Scratch Wunde-Assay ist eine robuste Technik, Zelle Migration und Invasion zu bewerten. Der Test erfolgt mit einer mechanischen Wunde Maker und bietet einen reproduzierbaren Vergleich zwischen Behandlungsbedingungen. Mikroskopische Videoanalyse kann verwendet werden, um präzise quantitative Daten für Wunde heilen und Zelle Zusammenfluss durch ein Time-Lapse Experiment zu generieren. Zeit zu Zeit Analyse der verschiedenen Behandlungsbedingungen kann durch mikroskopische Beobachtungen erhärtet werden. Diese Analyse integriert Zellproliferation während des Tests und die Zelle-Verdoppelung Zeit berücksichtigt. Video oder Rohdaten Inhalte kann exportiert werden um eine hochgradig visuelle Darstellung der Ergebnisse zu erhalten wie in der Zelle Migration Kurven in Abbildung 3 bgezeigt.
Viele kritische Schritte sind erforderlich, um interpretierbare Ergebnisse zu erhalten. Die optimalen Bedingungen für Zelle Aussaat sind abhängig von der Zell-Linie und müssen getestet werden, mit verschiedenen Verdünnungen, 90 % Zelle Zusammenfluss in den Brunnen zu erhalten. Um eine lineare Wunde zu erhalten, muss Zelle Überzug 16 h nicht überschreiten. Die Waschschritt erfolgen zweimal und rasch zu vermeiden Einführung Zelle Schmutz in die Wunde, die die Ergebnisse verändern könnte. Für die Invasion Scratch Wunde richtige Pflege der ECM ist auch ein entscheidender Schritt. Die Abkühlgeschwindigkeiten müssen konstant sein, und die ECM sollte mit gekühlten Pipettenspitzen manipuliert und erhalten bei 4 ° C.
Diese Techniken haben viele Vorteile, die in Tabelle 1 zusammengefasst. Adhärente Zellen werden für diese Technik benötigt. Kratzen Ursachen mechanische Schädigung der Zellen, die verursacht die Freisetzung von zellulären Inhalt in das umgebende Medium und kann den Migrationsprozess beeinflussen. Die Scratch Wunde Assay liefert eine Schätzung der 2D Zelle Motilität aber nicht der Zelle Chemotaxis, die mit dieser Technik nicht studieren kann. Wir haben vor kurzem einen video mikroskopische Chemotaxis-Assay mit einem kommerziellen Plating System entwickelt. Dieser Assay braucht Zellen mit einer hohen Migration Fähigkeit, wie z. B. Krebs-Stammzellen, wie zuvor beschrieben12. Diese neue Technik kann der Goldstandard für die Invasion-Migration-Assays in der Zukunft werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Techniken wurden mit der Unterstützung von LabEx Primzahlen (ANR-11-LABX-0063), Contrat Plan-Etat-Region (CPER) im wissenschaftlichen Rahmen des ETOILE (CPER 2009-2013) und lyrische Grant Inka-DGOS-4664 entwickelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
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