Summary
Denne undersøgelse rapporter to forskellige metoder til analyse af celle invasion og migration: Boyden kammer assay og in vitro- video mikroskop-baserede sårheling analysen. Protokoller for disse to eksperimenter er beskrevet, og deres fordele og ulemper sammenlignes.
Abstract
Tumorcellerne invasion og migration evner er vigtigste bidragydere til kræft progression og gentagelse. Mange undersøgelser har udforsket migration og invasion evne at forstå, hvordan kræftceller udbrede, med formålet at udvikle nye behandling strategier. Analyse af cellulære og molekylære grundlag for disse evner har ført til karakterisering af celle mobilitet og de fysisk-kemiske egenskaber af cytoskelettet og cellulære mikromiljø. I mange år, har Boyden kammer assay og scratch sår analysen været standardteknikker at studere cellen invasion og migration. Disse to teknikker har imidlertid begrænsninger. Boyden kammer assay er vanskelig og tidskrævende, og scratch sår analysen har lav reproducerbarhed. Udviklingen af moderne teknologier, især i mikroskopi, har øget reproducerbarhed af scratch sår assay. Ved hjælp af kraftfulde analyse systemer, kan et "i-inkubator" video mikroskop bruges til at levere automatisk og real-time analyse af celle migration og invasion. Formålet med dette papir er at rapportere og sammenligne de to assays bruges til at studere cellen invasion og migration: Boyden kammer assay og en optimeret in vitro- video mikroskop-baseret skrabelod sår assay.
Introduction
Celle invasion og migration er involveret i udbredelsen af kræftceller, som er hovedårsagen til modstanden mod behandling1 og kan føre til locoregionale eller metastatisk fornyet efter kræft behandling2. Epitel-mesenchymale overgangen (EMT) er den indledende proces af celle invasion-migration i hvilke kræft celler skifte fra en epitelial til en mesenchymale fænotype. E-Cadherin er en ekstracellulære markør af epitel fænotype3, og øget udtryk for N-cadherin og vimentin er karakteristisk for mesenchymale fænotype4. Indvandring afhænger også kræftceller iboende evne til at invadere den ekstracellulære matrix (ECM) gennem handling af matrix metalloproteases5.
Denne invasion-migration mekanisme er blevet beskrevet for kræft på mange steder, især i hoved og hals kræft6. Mange forskere har fokuseret på migration og invasion processerne for bedre at forstå hvordan kræftceller formidle i håb om, at denne viden vil føre til ny behandling strategier. Det er afgørende, at disse undersøgelser udføres ved hjælp af pålidelig og reproducerbar assays.
In vitro analyse af celle motilitet kan være udfordrende. Udviklet for mange år siden, anses Boyden kammer analysen for at være standard for invasion-migration analyse7. Men det er tidskrævende og er ofte unøjagtige. En anden test er den sårheling assay8, som indebærer at gøre en skramme på en celle éncellelag kultur og fanger billeder af celle invasion og migration med faste tidsintervaller. Denne teknik er blevet kritiseret vidt på grund af de store variationer mellem resultaterne af to successive tests. Dog har anvendelsen af moderne teknologier, især i mikroskopi, bedre reproducerbarhed af scratch sår assay. Video mikroskoper nemt kan indføres i væksthuse og kan generere real-time billeder af celle migration. Disse enheder optage mikroskopiske data og automatisk analyse af sår celle sammenløbet med tiden. Formålet med dette papir er at beskrive Boyden kammer assay og optimeret scratch sår analysen og diskutere fordele og svagheder ved hver metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Boyden kammer og bunden assays uden inddragelse af ECM omtales som migration assay, og de samme assays med ECM er benævnt invasion assay.
1. Boyden kammer Assay
Bemærk: Denne protokol er tilpasset til linjen SQ20B celle, som er afledt af en tilbagevendende hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) larynx cancer og var fremstillet af John Little (Boston, MA, USA).
Dag 1
-
Celle såning
- Frø 2 106 SQ20B celler i 12 mL af næringssubstratet (CM) i en 175 cm2 kolbe 72 timer før dag ét og tillader cellerne til at vokse til 80% celle sammenløb.
- For at forberede CM til SQ20B celler, skal du supplere Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS), 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicillin og 0,1 g/L streptomycin.
- Under en laminar flow hætte, trypsinize cellerne. Fjern mediet, cellerne vaskes med steril fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsættes 2,5 mL trypsin ethylendiamintetra syre (EDTA) (0,5 g/L). Inkuber celler i 5 min ved 37 ° C og derefter stoppe reaktionen ved at tilføje 12,5 mL CM varmet til 37 ° C. Tæl antallet af celler ved hjælp af en celle counter.
- Seed celler i en 25 cm2 kolben med en celle tæthed på 6 105 celler for hver betingelse skal evalueres. Inkuber celler i 24 timer i 3 mL af CM.
- Frø 2 106 SQ20B celler i 12 mL af næringssubstratet (CM) i en 175 cm2 kolbe 72 timer før dag ét og tillader cellerne til at vokse til 80% celle sammenløb.
Dag 2
-
Celle sult og forberedelse af belagt kamre
- Sulte cellerne ved at erstatte medium i hver kolbe med 3 mL af lav-føtal bovint serum (FBS) medium ved hjælp af 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i stedet for FBS. Sulte celler i 24 timer i rugemaskinen.
- For at forberede sult CM (s-CM), supplere DMEM med 0,1% BSA, 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicillin og 0,1 g/L streptomycin.
- For migration assay, skal du gå til trin 1.3.
- Invasion assay, 12 h før dag 3, forberede de coatede Boyden kamre ved at tilføje 500 μL af s-CM til hver belagt kammer. Bruge kommercielt tilberedt belagt Boyden kamre og holde dem ved 4 ° C før brug. Placer hvert Boyden kammer i følgesvend plade og sat det i varmeskab ved 37 ° C natten over.
- Sulte cellerne ved at erstatte medium i hver kolbe med 3 mL af lav-føtal bovint serum (FBS) medium ved hjælp af 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i stedet for FBS. Sulte celler i 24 timer i rugemaskinen.
Dag 3
-
Celle såning i salen, Boyden
- Bruge følgesvend plade til at forberede chemoattractant. Fyld hver godt af 24-godt følgesvend plade med 750 μL af komplette mellemstore med 10% FBS, 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicillin og 0,1 g/L streptomycin.
- Tilpasse chemoattractant for hver cellelinje og hver behandling betingelse. For at forberede chemoattractant CM (ca-CM), supplere DMEM med 10% FCS, 0,4 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicillin og 0,1 g/L streptomycin.
- Overføre den øverste kammer i forudfyldte følgesvend pladen, pasning til at undgå boblerne.
- For invasion assay, forsigtigt fjerne 450 μL af CM fra hvert Boyden kammer.
- Under en laminar flow hætte, trypsinize cellerne. Fjern mediet, cellerne vaskes med steril PBS, der tilsættes 0,5 mL trypsin EDTA (0,5 g/L) og derefter inkuberes celler i 5 min ved 37 ° C. Reaktionen standses ved at tilføje CM varmet til 37 ° C. Tæl antallet af celler ved hjælp af en celle counter.
- Frø 3 104 SQ20B celler i 500 μl af 0,1% BSA medium, hvilket giver en endelig fortynding af 6 104 celler/mL.
Bemærk: Den celle koncentration bør tilpasses for hver cellelinje. - Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C i 24 timer.
- Bruge følgesvend plade til at forberede chemoattractant. Fyld hver godt af 24-godt følgesvend plade med 750 μL af komplette mellemstore med 10% FBS, 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicillin og 0,1 g/L streptomycin.
Dag 4
-
Celle fiksering og farvning
- Fix cellerne før den fordobling tid specifikke til at cellelinie. Fix SQ20B celler før 24 h.
- Fjern hver Indsæt fra følgesvend plade og fjern forsigtigt cellerne fra den øverste kammer ved hjælp af en vatpind. Det er især vigtigt at fjerne alle celler i det øverste kammer.
- Fix og plet hver indsætte individuelt for at få maj-Grunwald Giemsa farvning9 ved hjælp af farvning kit leveres. Alternativt bruge 4% PARAFORMALDEHYD i en anden ledsager plade til en 30 min fiksation.
- Holde indsætter i en tom 24-godt følgesvend plade under et laboratorium hood til at tørre hvert kammer.
Dag 5
-
Mikroskopisk analyse
- Indsæt følgesvend plade med skær på 20 fase-kontrast mikroskop og tælle hver overflyttede celle på den nederste del af membranen. Optimere den rigtige fokus position ved at flytte målet fra bunden til toppen, og stoppe holdning på den nederste del af membranen.
- Beregne forholdet mellem antallet af overflyttede celler og seedet celler. Gentag hver tæller for hver behandling betingelse i tre eksemplarer.
2. bunden sår Assay: Celle Migration
Bemærk: Instruktionerne skal tilpasses for hver type celle.
Dag 1
-
Celle såning
- Frø 2 x 106 SQ20B celler i 12 mL af CM i en 175 cm2 kolbe 72 timer før dag ét og tillader cellerne til at vokse til 80% celle sammenløb.
- Under en laminar flow hætte, trypsinize cellerne. Fjern mediet, cellerne vaskes med steril PBS, tilsættes 2,5 mL trypsin EDTA (0,5 g/L) og inkuberes celler i 5 min ved 37 ° C. Reaktionen standses ved at tilføje 12,5 mL CM varmet til 37 ° C. Tæl antallet af celler ved hjælp af en celle counter.
- Generere en prediluted prøve med en celle tæthed på 4 x 105/mL, giver en endelige tæthed af 4 104 celler pr. 100 μL i hver brønd. Denne koncentration skal tilpasses til hver cellelinje og skal være i intervallet 1 x 10,4 til 6 104 celler.
- Frø celler i hver brønd af en 96-brønd plade af deponering 100 μL af en opløsning fremstillet i trin 2.1.2.
- Forlade pladen ved stuetemperatur i 5 min. til at sprede cellerne jævnt på bunden af brøndene.
- Pladen anbringes i rugemaskinen og tillade celler til at overholde pladen i 12 til 16 timer (maksimale) ved 37 ° C.
Dag 2
-
Skrab sår assay
- Fjerne pladerne forberedt i trin 2.1 fra rugemaskinen.
- Under kølerhjelmen, gøre et sår ved hjælp af kommercielle såret enhed efter producentens protokol.
- Straks fjerne medium fra hver brønd med en pipette med en tilpasset koniske spids, pas på ikke for at røre ved sår.
- Cellerne vaskes to gange ved at gentage aspiration og bruge 100 μL af CM opvarmet til 37 ° C i hver brønd.
- Fjerne CM med en pipette med en tilpasset koniske tip efter vask trin.
- Tilsæt 100 μL af medium specifikke for hver behandling betingelse til hver brønd.
- Prøv at undgå at skabe nogen bobler i brøndene. En reverse-pipettering teknik kan være nyttigt her. Alternativt kan du fjerne bobler med en sprøjte nål.
- Pladen anbringes i den tilpassede rack af video mikroskop.
- For at forbedre billedkvaliteten, tillade plade til at varme i mindst 15 min. før den første scanning for at undgå kondens på den nederste side af pladen.
- Program tidsplan af scanninger, ved hjælp af video mikroskop software på ét billede pr. brønd. Et maksimuminterval 2-h er nødvendig for en invasion-migration eksperiment. Hvis formålet med forsøget er at producere en video, foretrækkes et interval på 30 min maksimale.
- I slutningen af forsøget, vaske såret enheden omhyggeligt og følge hver af de fire vask trin angives af fabrikanten.
Dag 3, 4 og 5
-
Analyse af migration ved hjælp af den video mikroskop
- I mindst 24 timer og op til 5 dage, overvåge og kontrollere celle migration.
- Brug en passende celle masken tilpasses for hver celle til at analysere celle migration. For at opnå en celle maske tilpasset hver cellelinie, generere en celle forarbejdning definition fra softwaren ved hjælp af en bestemt celle billedsamling.
- Spore kurver og eksportere data til et regneark, som kan bruges til at analysere og sammenligne resultaterne.
3. Skrab sår Assay: Celle Invasion
Bemærk: Instruktionerne skal tilpasses for hver type celle.
Dag 1
-
Celle såning
- Bruge den samme protokol til celle såning som beskrevet i trin 2.1.
Dag 2
-
Forberede ECM
- Afrimning matrix i mindst 12 timer før brugen ved 4 ° C. Sørg for at ingen aggregater er synlige. Hvis aggregater er synlige, skal du holde matrixen ved 4 ° C i en længere periode indtil aggregater forsvinde. Holde matrix på is. Bruge forkølede pipette tips.
Bemærk: Matrix vil størkne hvis ikke opbevares ved 4 ° C. - Chill microcentrifuge rør i isbad i 5 min.
- Tage CM afkøles til 4 ° C fra køleskabet og fortyndes matrix i forkølede microcentrifuge rør til at opnå en endelig koncentration på 300 μg/mL.
- Tilbage microcentrifuge rør med fortyndet matrix til køleskab ved 4 ° C.
Bemærk: En afkøling rack tilpasset microcentrifuge rør er nyttigt for at opretholde rør ved 4° C under hele forsøget.
- Afrimning matrix i mindst 12 timer før brugen ved 4 ° C. Sørg for at ingen aggregater er synlige. Hvis aggregater er synlige, skal du holde matrixen ved 4 ° C i en længere periode indtil aggregater forsvinde. Holde matrix på is. Bruge forkølede pipette tips.
Dag 2
-
Scratch sår analyse og behandling af ECM
- Fjern pladen forberedt i trin 3.1 fra rugemaskinen.
- Under kølerhjelmen, gøre såret ved hjælp af kommercielle såret enhed efter producentens protokol.
- Straks fjerne medium fra hver brønd med en pipette med en tilpasset koniske spids pas på ikke for at røre ved sår.
- Cellerne vaskes to gange ved gentagne aspiration procedure og bruge 100 μL af CM varmet til 37 ° C.
- Efter den anden vask, pladen anbringes på 4 ° C inkubator til Reagensglasset dens temperatur i 5 min.
- Fjern den kolde medium fra hver brønd med aspiration pipette med en kegleformet spids, pasning afpipetteres nøje fra kanten og undgå at røre ved sår.
- Tilsæt 50 μL fortyndet matrix til hver brønd med forkølede konisk tips ved 4 ° C.
- Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C i 30 min.
Bemærk: En forvarmet støtte rack ved 37 ° C er nyttigt at fremskynde opvarmning af 96-brønd plade. - Fjern pladen fra rugemaskinen, og tilsæt 100 μL af tilpasset CM til hver brønd, som er angivet for hver behandling betingelse.
- Prøv at undgå at skabe nogen bobler i brøndene. En reverse-pipettering teknik kan være nyttigt her. Alternativt kan du fjerne bobler med en sprøjte nål.
- Pladen anbringes i den tilpassede rack i den video mikroskop.
- For at forbedre billedkvaliteten, tillade plade til at varme i mindst 15 min. før den første scanning for at undgå kondens på den nederste side af pladen.
- Program tidsplan af scanninger, ved hjælp af video mikroskop software på ét billede pr. brønd i scanningstilstand ridse sår. En 2-h maksimuminterval i kræves for en invasion-migration eksperiment. Hvis formålet med forsøget er at producere en video, foretrækkes et interval på 30 min maksimale.
- I slutningen af forsøget, vaske såret enheden omhyggeligt og følge hver af de fire vask trin angives af fabrikanten.
Dag 3, 4 og 5
-
Analyse af celle invasion ved hjælp af en video mikroskop.
- Gentag trin 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi rapporterer her to forskellige metoder til at analysere celle invasion og migration. Figur 1 viser Boyden kammer eksperiment. Indsætter er placeret i en følgesvend plade med chemoattractant medium, og cellerne udsås i CM. Membranen kan være ubestrøget (migration assay) eller overtrukket (invasion assay). Cellerne udsås i det øverste kammer i s-CM. Den nedre kammer er fyldt med CM som en chemoattractant. Cellerne er fast før den fordobling tid.
Figur 2 viser Boyden membran efter celle fiksering. Figur 2A viser en suboptimal resultatet med celle klynger på oversiden af membranen. Figur 2B viser et optimalt resultat med celler fast og farves blå på membranen.
Figur 3 viser et optimalt resultat af scratch sår assay. Den lineære sår kan ses i figur 3A. Ingen celler er observeret i sår og sårheling har fundet sted inden for 30 h. Tid til at helbrede sår er afhængige af cellelinie og spænder fra 24 til 50 h.
Figur 3B er en grafisk repræsentation af sårheling under fire behandling betingelser: kontrol, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximab (anti-EGFR) og ABT-199 + cetuximab. ABT-199 + cetuximab kombination faldt betydeligt celle migration. Kurverne er opnået ved hjælp af video mikroskop software, som giver robust dataanalyse i celle migration med tiden. Fejllinjer udgør standardafvigelse (SD) til hver brønd.
Halvfems procent sammenløbet er optimal celle massefylden for sårheling analysen. Optimal celle seeding afhænger cellelinie og spænder fra 3 x 104 til 6 x 104 celler. Figur 4A viser den optimale celle tæthed, og figur 4 c viser lav celle tæthed. Brøndene vaskes to gange for at undgå celle klynger, som vist i figur 4B.
Figur 1: skematisk fremstilling af Boyden kammer eksperiment. Skær er placeret i en følgesvend plade med chemoattractant medium, og cellerne udsås i CM. Membranen kan være ubestrøget (A) eller bestrøget (B).
Figur 2: Suboptimal og optimal mikroskopisk resultater opnået i Boyden kammer eksperiment. (A) Suboptimal membran med celle klynger på oversiden af membranen og uninterpretable resultater. Skalalinjen = 300 µm. (B) Optimal membran med tællelig celler i den lavere del af membranen farves blå. Skalalinjen = 300 µm.
Figur 3: optimale resultater opnået i sårheling eksperimentet. (A) repræsentative billede fra scratch sår analysen vist sårheling observeret 0, 15 og 30 timer. Kriterierne for en kvalitet eksperiment er en lineær sår, ingen celle fragmenter observeret i sår og optimal celle sammenløb. Skalalinjen = 300 µm. (B) grafisk repræsentation af sårheling viser kvantificering af parametre for sår celle sammenløbet (procentdel) Ifølge tid (h). Fire behandling forhold analyseres her, og dataene, der er vist med SD.
Figur 4: suboptimale resultater opnået i sårheling eksperimentet. (A) ideelle celle tæthed. (B) problemer vask celle pellet. (C) lav celle tæthed. Skalere barer = 300 µm
| Fordele | Ulemper | |
| BoyDen kammer eksperiment | -3D-celle Chemotaxis | -Tidskrævende |
| -Både invasion og migration med bestrøget og ikke belagt lag matrix | -Lav reproducerbarhed | |
| -Dyrt skær | ||
| -Ingen Time-Lapse udforskning | ||
| -Behovet for vedhængende celler | ||
| Sårheling Assay | -Automatisk meget reproducerbare sår | -2D-celle motilitet |
| -Både invasion og migration med bestrøget og ikke belagt lag matrix | -Behovet for vedhængende celler | |
| -Celleproliferation, der indgår i analysen | ||
| -Time-Lapse mikroskopiske visuel analyse | ||
| -Data eksport af sår healing målinger med præcise analyse | ||
| -Efterbehandling robust software til celle migration og invasion kurver |
Tabel 1: fordele og ulemper ved Boyden kammer eksperiment og video mikroskop sårheling assay. Fordele og ulemper af Boyden kammer eksperimentere og bunden sår assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer her to forskellige metoder til at studere cellen invasion og migration processen. Analysen af denne proces er vigtigt at forstå de faktorer, der er involveret i metastatisk gentagelse, som kunne forklares med øgede motilitet af en delpopulation af kræftceller kaldes kræft stamceller10,11.
Boyden kammer eksperiment er en de hyppigst anvendte teknikker til at udforske celle invasion og migration. En fordel ved denne tilgang er dens reproducerbarhed, selv om denne teknik er stærkt afhængige af den eksperimentatoren ekspertise. Celle optælling er manuelle og kan variere mellem eksperimentatorer. Mange kritiske trin skal være standardiseret og fulgte med pleje, såsom at sikre anvendelsen af de relevante chemoattractant og sult medium specifikke for hver cellelinje. At fjerne celler fra den øverste membran med en vatpind er også afgørende for at sikre optimale resultater og undgå suboptimal resultaterne vist i figur 2A. Hvis denne analyse er brugt til at vurdere celle motilitet, invasion og migration kapacitet gennem en tredimensional (3D) porøse membran, er det ikke muligt at spore celler gennem en time-lapse eksperiment. Derudover er kommercielle skær med en porøse membran ofte dyrt.
Video mikroskop-baserede scratch sår analysen præsenteres her er en robust teknik til at evaluere celle migration og invasion. Analysen er udført med en mekanisk sår maker og indeholder en reproducerbar sammenligning mellem behandling betingelser. Den video mikroskopisk analyse kan bruges til at generere præcise kvantitative data for sår healing og celle sammenløbet gennem en time-lapse eksperiment. Tid til analyse af forskellige behandling betingelser kan være underbygget af mikroskopiske observationer. Denne analyse integrerer celleproliferation under analysen og tager hensyn til den celle-fordobling tid. Video eller rå dataindhold kan eksporteres for at få en visuel repræsentation af resultaterne, som vist i celle migration kurver i figur 3B.
Mange kritiske trin er forpligtet til at opnå fortolkelige resultater. De optimale betingelser for celle såning er afhængige af cellelinie og skal afprøves med forskellige fortyndinger at opnå 90% celle sammenløbet i brøndene. For at opnå en lineær sår, må celle plating ikke overstige 16 h. Vask skridt skal gøres to gange og hurtigt at undgå at indføre celle debris ind i såret, der kunne ændre resultaterne. For invasion scratch såret, ordentlig pleje af ECM er også et afgørende skridt. De kølende satser skal være konstant, og ECM bør manipuleret med kølet pipette tips og opretholdt ved 4 ° C.
Disse teknikker har mange fordele, der er opsummeret i tabel 1. Vedhængende celler er nødvendige for denne teknik. Skrabe årsager mekanisk skade på cellerne, der forårsager frigivelse af cellulære indholdet i det omgivende medium og kan påvirke overførselsprocessen. Scratch sår analysen giver en skøn 2D celle motilitet, men ikke celle chemotaxis, som ikke kan undersøges ved hjælp af denne teknik. Vi har for nylig udviklet en video mikroskopiske chemotaxis analyse ved hjælp af en kommerciel plating system. Denne analyse skal celler med en høj migration evne, som kræftstamceller, som tidligere beskrevet12. Denne nye teknik kan blive guldstandarden til invasion-migration assays i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Disse teknikker blev udviklet med støtte fra LabEx primtal (ANR-11-LABX-0063), Contrat Plan-Etat-regionen (CPER) inden for de videnskabelige rammer ETOILE (CPER 2009-2013) og Lyric Grant Inka-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
