Summary
Denna studie rapporterar två olika metoder för analys av cell invasion och migration: Boyden kammare analysen och in vitro- video Mikroskop-baserade sårläkning analysen. Protokollen för dessa två experiment beskrivs, och deras fördelar och nackdelar jämförs.
Abstract
Invasionen och migration kapaciteterna av tumörceller är viktigaste bidragsgivarna till cancer progression och upprepning. Många studier har undersökt migration och invasion förmåga att förstå hur cancerceller sprider, med syfte att utveckla nya behandlingsstrategier. Analys av cellulära och molekylära grunden för dessa förmågor har lett till karakterisering av cell rörlighet och fysikalisk-kemiska egenskaper av cytoskelettet och cellulära mikromiljö. Under många år har Boyden kammare analysen och scratch såret analysen varit de vanliga teknikerna för att studera cell invasion och migration. Dessa två metoder har dock begränsningar. Boyden kammare analysen är svårt och tidskrävande, och scratch såret analysen har låg reproducerbarhet. Utveckling av moderna tekniker, särskilt i mikroskopi, ökat reproducerbarheten hos scratch såret analysen. Använda kraftfulla analyssystem, kan en ”i-inkubator” video Mikroskop användas att tillhandahålla automatisk och realtid analys av cellmigration och invasion. Syftet med denna uppsats är att rapportera och jämföra de två analyser används för att studera cell invasion och migration: Boyden kammare analysen och en optimerad in vitro- video Mikroskop-baserade scratch sår assay.
Introduction
Cell invasion och migration är inblandade i spridningen av cancerceller, vilket är den främsta orsaken till resistens mot behandling1 och kan leda till lokoregional eller metastaserande återkommer efter cancer behandling2. Epitelial-mesenkymala övergången (EMT) är den första processen av cell invasion-migrering som cancer celler växla från en epitelial till en mesenkymala fenotyp. E-Cadherin är en extracellulär markör av epitelial fenotyp3och ökat uttryck av N-cadherin och vimentin är kännetecken av mesenkymala fenotyp4. Migration beror också på den inneboende kapaciteten av cancerceller att invadera den extracellulär matrixen (ECM) genom åtgärder av matrismetalloproteaser5.
Denna invasion – migration mekanism har beskrivits för cancer på många platser, särskilt i huvud och hals cancer6. Många forskare har fokuserat på migration och invasion processerna för att bättre förstå hur cancerceller sprider i hopp om att denna kunskap kommer att leda till nya behandlingsstrategier. Det är avgörande att dessa undersökningar utförs med hjälp av tillförlitliga och reproducerbara analyser.
In vitro -analys av cell motilitet kan vara utmanande. Utvecklat många år sedan, anses Boyden kammare analysen vara standard för invasion – migration analys7. Men, det är tidskrävande och är ofta felaktig. Ett andra test är sårläkning assay8, vilket innebär att göra en repa på en enskiktslager cellkultur och fånga bilder av cell invasion och migration på fasta tidsintervall. Denna teknik har kritiserats kraftigt på grund av de stora variationerna mellan resultaten av två på varandra följande tester. Tillämpningen av modern teknik, särskilt i mikroskopi, har dock förbättrats reproducerbarheten hos scratch såret analysen. Video Mikroskop enkelt kan införas i kuvöser och kan generera realtidsbilder av cellmigration. Dessa enheter registrera mikroskopiska data och ge automatisk analys av såret cell sammanflödet över tid. Syftet med denna uppsats är att beskriva Boyden kammare analysen och optimerad scratch såret analysen, och att diskutera fördelar och svagheter i varje strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Boyden kammare och scratch analyserna utan införande av ECM kallas migration analysen, och de samma analyserna med ECM benämns invasion analysen.
1. Boyden kammare Assay
Obs: Detta protokoll är anpassad för den SQ20B cell line, som härleds från en återkommande huvud och hals skivepitelcancer (SCHH) larynxcancer och erhölls från John Little (Boston, MA, USA).
Dag 1
-
Cell sådd
- Utsäde 2 106 SQ20B celler i 12 mL odlingsmedium (CM) i en 175 cm2 kolv 72 h innan dag ett och tillåta cellerna att växa till 80% cell sammanflödet.
- För att förbereda CM SQ20B celler, komplettera Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) med 10% fetalt kalvserum (FCS), 0,04 mg/mL hydrokortison, 100 U/mL penicillin och 0,1 g/L streptomycin.
- Under en LAF, trypsinize cellerna. Ta bort mediet, tvätta cellerna med steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och tillsätt 2,5 mL av trypsin etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (0,5 g/L). Inkubera cellerna för 5 min vid 37 ° C och sedan stoppa reaktionen genom att lägga till 12,5 mL cm värmas till 37 ° C. Räkna antalet celler som använder en cell räknare.
- Kärna ur cellerna i en 25 cm2 kolv på en cell densiteten av 6 105 celler för varje villkor som ska utvärderas. Inkubera cellerna för 24 h 3 ml CM.
- Utsäde 2 106 SQ20B celler i 12 mL odlingsmedium (CM) i en 175 cm2 kolv 72 h innan dag ett och tillåta cellerna att växa till 80% cell sammanflödet.
Dag 2
-
Cell svält och beredning av belagda chambers
- Svälta cellerna genom att ersätta mediet i varje kolv med 3 mL låg-fetalt bovint serum (FBS) medium med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i stället för FBS. Svälta cellerna för 24 h i inkubatorn.
- För att förbereda svält CM (s-CM), komplettera DMEM med 0,1% BSA, 0,04 mg/mL hydrokortison, 100 U/mL penicillin och 0,1 g/L streptomycin.
- För migration analysen, gå till steg 1.3.
- För invasionen analysen, 12 h innan dag 3, förbereda de belagda Boyden kammarna genom att lägga till 500 μL av s-CM varje belagd kammare. Använda kommersiellt beredd belagda Boyden kammare och hålla dem vid 4 ° C före användning. Placera varje Boyden kammare i följeslagare plattan och Ställ in den i inkubatorn vid 37 ° C under natten.
- Svälta cellerna genom att ersätta mediet i varje kolv med 3 mL låg-fetalt bovint serum (FBS) medium med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i stället för FBS. Svälta cellerna för 24 h i inkubatorn.
Dag 3
-
Cell sådd i Boyden kammare
- Använda följeslagare plattan för att förbereda korrektiv. Fylla varje väl av 24-väl följeslagare plattan med 750 μL av komplett medium med 10% FBS, 0,04 mg/mL hydrokortison, 100 U/mL penicillin och 0,1 g/L streptomycin.
- Anpassa korrektiv för varje cellinje och varje behandling villkor. För att förbereda korrektiv CM (ca-CM), komplettera DMEM med 10% FCS, 0,4 mg/mL hydrokortison, 100 U/mL penicillin och 0,1 g/L streptomycin.
- Överföra den övre kammaren i förfyllda följeslagare plattan, för att undvika bubblor.
- För invasionen analysen, ta försiktigt bort 450 μl cm från varje Boyden kammare.
- Under en LAF, trypsinize cellerna. Ta bort mediet, tvätta cellerna med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, tillsätt 0,5 mL av trypsin EDTA (0,5 g/L) och sedan Inkubera cellerna för 5 min vid 37 ° C. Stoppa reaktionen genom att lägga till CM värmas till 37 ° C. Räkna antalet celler som använder en cell räknare.
- Seed 3 104 SQ20B celler i 500 μL av 0,1% BSA medium, vilket ger en slutspädning av 6 104 celler/mL.
Obs: Cellkoncentrationen bör anpassas för varje cellinje. - Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C under 24 h.
- Använda följeslagare plattan för att förbereda korrektiv. Fylla varje väl av 24-väl följeslagare plattan med 750 μL av komplett medium med 10% FBS, 0,04 mg/mL hydrokortison, 100 U/mL penicillin och 0,1 g/L streptomycin.
Dag 4
-
Cell fixering och färgning
- Fixa cellerna innan fördubbling tid specifika för denna cellinje. Fixa SQ20B celler innan 24 h.
- Ta bort varje insats från följeslagare plattan och ta försiktigt bort cellerna från den övre kammaren med hjälp av en bomullspinne. Det är särskilt viktigt att ta bort alla celler ligger i den övre kammaren.
- Fixa och fläckar varje insats individuellt för att erhålla maj-Grunwald Giemsa färgning9 med hjälp av färgning kit som tillhandahålls. Alternativt använda 4% PARAFORMALDEHYD i en annan kamrat tallrik för en 30 min fixering.
- Hålla skär i en tom 24-väl följeslagare plattan under huv laboratorium torka varje kammare.
Dag 5
-
Mikroskopisk analys
- Infoga följeslagare plattan med skären på en 20 faskontrastmikroskop och räkna varje migrerad cell på nedre delen av membranet. Optimera rätt fokus position genom att flytta målet från botten till toppen, och stoppa positionen på den nedre delen av membranet.
- Beräkna förhållandet mellan antalet migrerade celler och seedade celler. Upprepa varje räknas för varje behandling villkor i tre exemplar.
2. skrapa sår Assay: Cellmigration
Obs: Instruktioner måste anpassas för varje typ av cell.
Dag 1
-
Cell sådd
- Utsäde 2 x 106 SQ20B celler i 12 mL cm i en 175 cm2 kolv 72 h innan dag ett och tillåta cellerna att växa till 80% cell sammanflödet.
- Under en LAF, trypsinize cellerna. Ta bort mediet, tvätta cellerna med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, tillsätt 2,5 mL av trypsin EDTA (0,5 g/L) och inkubera cellerna för 5 min vid 37 ° C. Stoppa reaktionen genom att lägga till 12,5 mL cm värmas till 37 ° C. Räkna antalet celler som använder en cell räknare.
- Generera ett prediluted prov på en cell densiteten av 4 x 105/ml, vilket ger en slutlig densitet 4 104 celler per 100 μL i varje brunn. Denna koncentration måste anpassas för varje cellinje och bör vara i intervallet 1 x 104 6 104 celler.
- Utsäde celler i varje brunn av en plattan med 96 brunnar av deponerar 100 μL av en lösning beredd enligt steg 2.1.2.
- Låt plattan i rumstemperatur i 5 min att skingra cellerna jämnt på botten av brunnarna.
- Placera plattan i inkubatorn och låta cellerna att följa plattan för 12 till 16 h (max) vid 37 ° C.
Dag 2
-
Scratch såret assay
- Ta bort plattorna bereddes i steg 2.1 från inkubatorn.
- Under huven, göra ett sår som använder kommersiella skadade enheten enligt tillverkarens protokollet.
- Omedelbart ta bort mediet från varje brunn med pipett med en anpassad konisk spets, noga med att inte röra såret.
- Tvätta cellerna två gånger genom att upprepa strävan och använder 100 μL av CM värmas till 37 ° C för varje brunn.
- Ta bort den CM med pipett med en anpassad konisk spets efter tvätt steg.
- Tillsätt 100 μL av medium som är specifika för varje behandling villkor till varje brunn.
- Försök att undvika att skapa eventuella bubblor i brunnarna. En omvänd-pipettering teknik kan vara till hjälp här. Alternativt ta bort bubblor med en sprutans nål.
- Placera plattan i det anpassat racket av mikroskopet video.
- För att förbättra bildkvaliteten, Låt plattan att värma för minst 15 min innan den första sökningen att undvika kondens på undersidan av plattan.
- Program schemat för genomsökningar, använda programvaran video Mikroskop på en bild per brunn. Ett maximalt 2-h intervall krävs för en invasion-migration experiment. Om syftet med experimentet är att producera en video, är ett intervall på 30 min max att föredra.
- Vid slutet av experimentet, tvätta skadade enheten noggrant och följ varje fyra tvätt steg anges av tillverkaren.
Dagar 3, 4 och 5
-
Analys av migrering med hjälp av mikroskopet video
- För minst 24 h och upp till 5 dagar, övervaka och kontrollera cellmigration.
- Använda en cell lämplig mask anpassad för varje celltyp för att analysera cellmigration. För att erhålla en cell mask anpassad för varje cellinje, generera en cell bearbetning definition från programvaran med en viss cell bildsamling.
- Spåra kurvorna och exportera data till ett kalkylblad, som kan användas för att analysera och jämföra resultaten.
3. skrapa sår Assay: Cell Invasion
Obs: Instruktioner måste anpassas för varje typ av cell.
Dag 1
-
Cell sådd
- Använda samma protokoll för cell seedning enligt beskrivningen i steg 2.1.
Dag 2
-
Förbereda ECM
- Frosta matris för i minst 12 timmar före användning vid 4 ° C. Kontrollera att inga aggregat är synliga. Om aggregaten är synliga, hålla matrisen vid 4 ° C under en längre period tills aggregaten försvinner. Hålla i matrisen på is. Använd förhandskyld pipettspetsar.
Obs: Matrisen kommer stelna om de förvaras vid 4 ° C. - Chill i mikrocentrifugrör på is för 5 min.
- Ta CM kylas till 4 ° C ur kylskåpet och späd matrisen i de förhandskylda mikrocentrifugrör att erhålla en slutlig koncentration på 300 μg/mL.
- Returnera mikrocentrifugrör med förspädas matrix kylskåpet vid 4 ° C.
Obs: En kylande rack anpassad för mikrocentrifugrör är användbart för att upprätthålla rören vid 4° C i hela experimentet.
- Frosta matris för i minst 12 timmar före användning vid 4 ° C. Kontrollera att inga aggregat är synliga. Om aggregaten är synliga, hålla matrisen vid 4 ° C under en längre period tills aggregaten försvinner. Hålla i matrisen på is. Använd förhandskyld pipettspetsar.
Dag 2
-
Scratch såret analys och behandling av ECM
- Avlägsna plattan bereddes i steg 3.1 från inkubatorn.
- Under huven, göra såret använder kommersiella skadade enheten enligt tillverkarens protokollet.
- Omedelbart ta bort mediet från varje brunn med pipett med en anpassad konisk spets utan för att röra såret.
- Tvätta cellerna två gånger genom upprepande strävan förfarandet och använda 100 μL av CM värmas till 37 ° C.
- Efter den andra tvätten, placera plattan på 4 ° C inkubatorn temperera sin temperatur under 5 minuter.
- Ta det kalla mediet från varje brunn med aspiration pipetten med konisk spets, ta hand att Pipettera försiktigt från kanten och för att undvika att vidröra såret.
- Tillsätt 50 μL av förspädas matris till varje brunn med hjälp förhandskyld koniska tips vid 4 ° C.
- Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C i 30 min.
Obs: En förvärmd stöd rack vid 37 ° C är bra att påskynda uppvärmningen av plattan med 96 brunnar. - Avlägsna plattan från inkubatorn och tillsätt 100 μL av den anpassa CM till varje brunn som anges för varje behandling villkor.
- Försök att undvika att skapa eventuella bubblor i brunnarna. En omvänd-pipettering teknik kan vara till hjälp här. Alternativt ta bort bubblor med en sprutans nål.
- Placera plattan i den anpassa racket i mikroskopet video.
- För att förbättra bildkvaliteten, Låt plattan att värma för minst 15 min innan den första sökningen att undvika kondens på undersidan av plattan.
- Programmera schemat för genomsökningar, använda programvaran video Mikroskop på en bild per brunn, i skanningsläget Scratch sår. Ett maximalt 2-h intervall i krävs för en invasion-migration experiment. Om syftet med experimentet är att producera en video, är ett intervall på 30 min max att föredra.
- Vid slutet av experimentet, tvätta skadade enheten noggrant och följ varje fyra tvätt steg anges av tillverkaren.
Dagar 3, 4 och 5
-
Analys av cell invasion med video Mikroskop.
- Upprepa steg 2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi rapporterar här två olika metoder att analysera cell invasion och migration. Figur 1 visar Boyden kammare experiment. Skären placeras i en följeslagare tallrik med korrektiv medium, och cellerna är seedade i CM. Membranet kan vara obestruket (migration assay) eller bestruket (invasion assay). Celler är seedade i den övre kammaren i s-CM. Den lägsta kammaren är fylld med CM som ett korrektiv. Cellerna är fasta innan fördubbling tid.
Figur 2 visar Boyden membranet efter cell fixering. Figur 2A visar ett suboptimala resultat, med cell kluster på den övre sidan av membranet. Figur 2B visar ett optimalt resultat med cellerna fixeras och färgas i blått på membranet.
Figur 3 visar ett optimalt resultat av scratch såret analysen. Linjär såret kan ses i figur 3A. Inga celler observeras i såret, och läkning av sår har förekommit inom 30 h. Tid att läka såret är beroende av cellinje och varierar från 24 till 50 h.
Figur 3B är en grafisk representation av sårläkning under fyra behandling villkor: kontroll, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximab (anti-EGFR) och ABT-199 + cetuximab. ABT-199 + cetuximab kombination minskade signifikant cellmigration. Kurvorna erhålls via programvaran video Mikroskop som ger robust dataanalys av cellmigration med tiden. Felstaplar representera standardavvikelsen (SD) för varje brunn.
Nittio procent sammanflödet är optimal cell densiteten för sårläkning analysen. Den optimala cell sådd beror på cellinje och varierar från 3 x 104 till 6 x 104 celler. Figur 4A visar optimal cell densiteten, och figur 4 c visar låg cell densiteten. Brunnar bör tvättas två gånger för att undvika cell kluster, som visas i figur 4B.
Figur 1: Schematisk bild av Boyden kammare experimentet. Skär placeras i en följeslagare tallrik med korrektiv medium, och cellerna är seedade i CM. Membranet kan vara obestruket (A) eller bestruket (B).
Figur 2: Suboptimal och optimal mikroskopiska resultat som erhållits i Boyden kammare experimentet. (A) suboptimala membran med cell kluster på den övre sidan av membranet och resultat. Skalstapeln = 300 µm. (B) Optimal membran med uppräknelig celler i nedre delen av membranet färgade i blått. Skalstapeln = 300 µm.
Figur 3: optimalt resultat erhålls i sårläkning experimentet. (A) representativ bild från scratch såret analysen visat sårläkning observerades vid 0, 15 och 30 h. Kriterierna för en kvalitet experiment är ett linjära sår, ingen cell fragment observerats i såret och optimal cell sammanflödet. Skalstapeln = 300 µm. (B) grafisk representation av sårläkning visar kvantifiering av parametrar av såret cell confluence (procent) enligt tid (h). Analyseras här fyra behandling villkor, och data visas med SD.
Figur 4: suboptimala resultat som erhållits i sårläkning experimentet. (A) perfekt cell densiteten. (B) problem tvätt cellpelleten. (C) låg cell densiteten. Skala barer = 300 µm
| Fördelar | Nackdelar | |
| Boyden kammare Experiment | -3D-Cell chemotaxisna | -Tidskrävande |
| -Både invasion och migration med överdragen och icke överdragen lager matrix | -Låg reproducerbarhet | |
| -Dyra skär | ||
| -Ingen Time-Lapse prospektering | ||
| -Behov av vidhäftande celler | ||
| Sårläkning Assay | -Automatisk mycket reproducerbara sår | -2D-Cell motilitet |
| -Både invasion och migration med överdragen och icke överdragen lager matrix | -Behov av vidhäftande celler | |
| -Cellproliferation som ingår i analysen | ||
| -Time-Lapse mikroskopiska visuell analys | ||
| -Data export av såret helande mätvärden med exakt analys | ||
| -Efterbehandling robust programvara för cell migration och invasion kurvor |
Tabell 1: fördelar och nackdelar med Boyden kammare experiment och video Mikroskop sårläkning haltbestämning. Fördelar och nackdelar av Boyden kammare experimentera och scratch såret assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterar här två olika metoder för att studera cell invasion och migration processen. Analysen av denna process är viktigt att förstå faktorerna som är inblandade i metastaserande återfall, vilket kan förklaras av ökad motilitet i en subpopulation av cancerceller som kallas cancer stamceller10,11.
Boyden kammare experimentet är en till de vanligaste tekniker att utforska cell invasion och migration. En fördel med denna metod är dess reproducerbarhet, men denna teknik är mycket beroende av de experimenter's expertis. Cell räkna manuellt och kan variera mellan praktiker. Många kritiska steg måste standardiseras och följas med omsorg, såsom en användning av lämpligt korrektiv och svält medium specifika för varje cellinje. Ta bort celler från det övre membranet med en bomullspinne är också avgörande för att säkerställa optimala resultat och undvika de suboptimala resultat som visas i figur 2A. Om denna analys används för att utvärdera cell motilitet, invasionen och migration kapacitet genom en tredimensionell (3D) porösa membran, går det inte att spåra celler genom en time-lapse experiment. Kommersiella skär med ett poröst membran är dessutom ofta dyra.
Den video Mikroskop-baserade skrap sår-analysen som presenteras här är en robust teknik för att utvärdera cellmigration och invasion. Analysen sker med en mekanisk såret maker och ger en reproducerbar jämförelse mellan behandling villkor. Den video mikroskopisk analysen kan användas för att generera precisa kvantitativa data för sår läkning och cell sammanflödet genom en time-lapse experiment. Tid till annan analys av olika behandling villkor kan styrkas genom mikroskopiska observationer. Denna analys integrerar cellproliferation under analysen och tar hänsyn till den cell-fördubbling tid. Video eller rådata innehåll kan exporteras för att få en visuell representation av resultaten, som visas i cell migration kurvorna i figur 3B.
Många kritiska steg krävs för att erhålla tolkningsbara resultat. Optimala förutsättningar för cell sådd är beroende av raden för cellen och måste testas med olika spädningar att få 90% cell sammanflödet i brunnarna. För att få en linjär såret, överstiga cell bordläggningen inte 16 h. Det tvätt steget måste göras två gånger och snabbt att undvika att införa cellfragment i såret som kan förändra resultaten. För invasionen scratch såret, väl hand om ECM är också ett viktigt steg. De kylande skattesatserna måste vara konstant och ECM bör manipuleras med kylda pipettspetsar och hålls vid 4 ° C.
Dessa tekniker har många fördelar, som sammanfattas i tabell 1. Vidhäftande celler behövs för denna teknik. Avlysningen orsaker mekanisk skada på cellerna, vilket orsakar frisättning av cellulära innehållet i omgivande medium och kan påverka migreringsprocessen. Scratch såret analysen ger en uppskattning av 2D cell motilitet men inte cell Kemotaxis, som inte kan studeras med denna teknik. Vi har nyligen utvecklat en video mikroskopiska chemotaxis analysen använder en kommersiell plattsystem. Denna analys måste celler med en hög migration förmåga, såsom cancerstamceller, som tidigare beskrivits12. Denna nya teknik kan bli den gyllene standarden för invasion-migration analyser i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Dessa tekniker har utvecklats med stöd av LabEx PRIMTAL (ANR-11-LABX-0063), den Contrat Plan-Etat-regionen (CPER) inom vetenskapliga ramen för ETOILE (CPER 2009-2013) och lyriska Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
