Summary
電離放射線 (IR) に関する研究-誘導的なクローンの細胞死が悪性腫瘍と正常組織に及ぼす IR を理解するために重要です。ここでは、4', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) の形態に基づく IR 誘導的なクローン細胞死の主要なモードを評価するためのワンステップ分析について述べる-蛍光顕微鏡による可視化の核を染色します。
Abstract
電離放射線 (IR) に関する研究-誘導的なクローンの細胞死が悪性腫瘍と正常組織の IR の効果を理解するために重要です。ここでは、IR、すなわちアポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞老化によるクローン細胞死の主要なモードを同時に評価するための迅速かつコスト効果の高いワンステップ アッセイについて述べる。この方法ではカバー スリップ上に成長したセルを x 線を照射して 4', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) で染色します。蛍光顕微鏡を用いた、アポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞の老化、に基づいて識別されます DAPI 染色核の特徴的な形態。アポトーシスは、アポトーシス小体 (すなわち、凝縮と断片化した核) の存在によって決定されます。分裂の大惨事は、明確な葉と小核の 2 つ以上を示す核の存在によって決定されます。細胞の老化、老化関連ヘテロクロマチン巣 (すなわち30-50 の明るい、高密度の巣を含んでいる核 DNA) の存在によって決まります。このアプローチにより、簡単に興味の標的細胞に細胞死のメカニズムの解明を目標に様々 な細胞、治療設定および/または時間ポイントを使用してクローン細胞死モードの画面に実験者です。
Introduction
電離放射線 (IR) は、複数モードのクローン細胞死を誘導します。IR 誘導的なクローン細胞死に関する研究は正常組織への IR の毒性を理解するためだけでなく、がんの放射線治療の治療効果を高める方法を開発するために重要です。アポトーシスと細胞分裂の大惨事細胞の老化は、IR1によるクローン細胞死の主要なモードです。アポトーシスは、DNA 損傷1による細胞死の調整されたモードです。分裂大惨事未修理 DNA 二重鎖切断1から生じる異常な有糸分裂のために発生する細胞死であります。細胞の老化が、不可逆的な細胞の成長停止2の状態として定義します。細胞の老化は、それ自体細胞死ではないため老化細胞のクローンの生存を廃止し、それはクローン細胞死のモードに注意してください。
様々 な細胞に基づく試金は、アポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞の老化を個別に評価するために開発されています。アポトーシスは、流れの cytometry1遊離トランスフェラーゼ dUTP ニック終わりラベリング TUNEL 染色、アネキシン V 染色、DNA 断片化の試金、およびサブ G1 細胞周期位相決定によって評価できます。分裂の大惨事は、MPM2、TUNEL 染色、電子顕微鏡1など分裂のマーカーの染色蛍光抗体法によって評価できます。細胞の老化は老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) の染色、増殖停止試金および電子顕微鏡1によって評価されます。重要なは、クローン細胞死の支配的なモードは細胞と治療設定3,4によって異なります。したがって、与えられた実験的設定のクローン細胞死の全体像を明らかにする死のこれらのモードのすべてをカバーする複数のアッセイわれること一緒に、労働とコストのかかるであります。
この記事でアポトーシス、細胞分裂の大惨事と IR3,4による細胞の老化を同時に評価するための迅速かつコスト効果の高い 1 つのステップの試金を記述します。この方法ではカバー スリップ上に成長したセルを x 線を照射して 4', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) で染色します。蛍光顕微鏡を用いた、アポトーシス、細胞分裂の大惨事と細胞の老化が、それぞれに基づいて識別されます DAPI 染色核のそれぞれ特徴的な形態。このアプローチは様々 な細胞があり、治療設定、およびの標的細胞に細胞死のメカニズムの調査の目的で、時間のポイントでクローン細胞死プロファイルのためのスクリーニングを含むアプリケーションの役に立つでしょう関心します。
Protocol
1 材料準備
- オートクレーブ カバー スリップ。。
- ガラス ビーカーにカバー スリップを配置します 。
- 箔ガラス ビーカーをカバーします 。
- 20 分 15 psi で 121 ° c のオートクレーブ
- 文化フードに室温で 50 ° C の店でドライ 。
- 固定の解決の準備: 3% パラホルムアルデヒド + 2% のショ糖リン酸緩衝生理食塩水 (PBS).
- 1,000 mL ガラス瓶 700 mL の PBS と 30 g パラホルムアルデヒドを追加します
。 注意: パラホルムアルデヒドは腐食性、適切な手袋を着用します 。
- 電子レンジを使用して 80 ° C の加熱により完全にディゾルブ パラホルムアルデヒド
。 注意: パラホルムアルデヒド煙は有毒なマスクを着用しています 。
- 常温で一晩おきます 。
- 20 g ショ糖を追加します 。
- 合計ボリューム 1 に PBS を追加・ l ・
- 因数 50 mL のチューブ。-20 ° C で 3 年間または 4 で 3 ヶ月間の固定の解決を格納できる ° C
- 1,000 mL ガラス瓶 700 mL の PBS と 30 g パラホルムアルデヒドを追加します
2。細胞培養の準備
注: 文化フードでこれらの手順を実行する必要があります
。 対数増殖 5 を維持するために- 文化と通路 U2OS ひと骨肉腫細胞
。 注: 他のセルタイプは最適な照射線量を決定した後使用できます 。
- では、70% エタノールで湿らせた紙タオルでメスを拭いてください。35 mm 細胞培養ディッシュ上カバー スリップを配置、メスを使用して (以下単と呼ばれる " 皿 ").
注意: カバー スリップ一皿の数は実験によると増加することができます設計 (議論を参照). - 追加 1 mL 文化メディア: 10% 牛胎児血清を DMEM
。 注: 他のメディアは、選択したセルの種類によると使用できます 。
ペーパー タオル鉗子 - ワイプは、70% エタノールで湿らせた。カバー スリップの中心を保持鉗子を使用して、優しく。カバー スリップの上でホールドを維持しながら、完全にお皿から培地を吸引します
。 注: この手順は、皿にカバー スリップの固定化を促進する 。
- トリプシン 5 を使用して付着性の培養されたセルをデタッチします。
- 皿から培地を吸引します 。
- 1 mL の PBS を加えるし、料理を振盪します 。
- 皿から吸い出しなさい PBS 。
- 皿に 1 mL のトリプシン [0.25w/v% L 1mmol/トリプシン EDTA] を追加します 。
- 5% CO 2 を含む大気中で 37 ° C で 5 分間加温 。
- 皿に 9 mL の培地を追加します 。
- 1000 μ L マイクロ ピペットを使用して単一細胞懸濁液を準備します 。
- 5 セルをカウントします。
- 1.5 mL チューブ追加 0.9 mL 細胞懸濁液、0.1 mL 0.4% トリパン ブルー溶液 。
- 診断に適用 10 μ L.
- の数を調べて逆位相顕微鏡下で細胞 (すなわち、ライブ) を無染色します 。
- 15 mL チューブ、0.5 × 10 5 セル/ml の密度で培養液で 3 mL の細胞懸濁液を準備します
。 注: セルの実験によると密度を変更ことができます必要が (議論 を参照してください). - 皿に細胞懸濁液 2 mL をそっと追加します 。
- 5% CO 2 を含む大気中で 37 ° C で一晩加温します 。
3。照射
注意: 製造業者に従って慎重に x 線照射を扱う ' の指示
。- は、逆位相顕微鏡下で細胞を検査します。カバー スリップし、生きている細胞が接続されていることを確認します 。
- 6 Gy の x 線が付いている皿を照射 (1.4 Gy/分、300 KVP、20 mA). 37 ° c 5% CO 2 を含む大気中で 72 時間
- 加温します
。 注: インキュベーション時間は実験によると変更することができます設計 (議論 を参照).
4。固定
- お皿から培地を吸引します 。
- 使用のはさみ、1,000 μ L ピペットの先端をカット、端から 5 mm をヒントします
。 注: カットのヒント スムーズに固定の解決を適用することができます 。
- 皿の側の壁から皿に 1 mL (1.2 の手順で準備) の固定の解決を追加カットの先端を使用しています
。 注: この手順は、時間に敏感なしたがって複数のサンプルを処理するとき、マイクロ ピペットのヒントを変更することがなく実行する必要があります。皿の底に直接固定ソリューションのアプリケーションは、細胞を損傷することができます 。
- は、正方形の培養皿に料理を配置します。カバー スリップ上固定ソリューションを均等に優しく正方形の培養皿を振る 。
- 室温で 10 分間加温 。
- 皿から固定の解決を吸い出しなさい 。
- は、皿の側の壁から皿に 2 mL の PBS を追加します
。 注: PBS のアプリケーションを皿の底に直接細胞を損傷することができます 。
- 皿から吸い出しなさい PBS 。
- 4.7 ・ 4.8 2 回手順を繰り返します
。 注: 料理と共に格納できます 4 ° C で 1 週間に 2 mL の PBS を浴びてカバー スリップ 。
5。DAPI 染色
- スライド ガラスに適用 5 μ L 1 G/ml DAPI 染色試薬
。 注: DAPI 染色試薬が格納されている場合、6 ヶ月間安定した-20 以下の光から保護された ° C - 皿からカバー スリップを削除、メスを使用しています 。
- ペーパー タオルでカバー スリップの端に触れることによりカバー スリップ上余分な PBS をオフ描画します 。
- マウント カバー スリップ セルが DAPI 染色試薬にさらされているので、スライド グラス上で試薬を汚す DAPI のドロップに逆さまにします
。 注: この手順は、時間に敏感なです。最適な汚染につながることができます染色試薬、DAPI の乾燥します 。
- サンプルは-20 で 1 年保存できる ° C
6。画像取得
- 検査蛍光顕微鏡のサンプル。核は DAPI フィルターを使用して、視覚化します
。 注: いずれか 20 X、60 X オイル レンズは、研究者によると使用することができます ' s 関心。60 X オイル レンズを使用している場合は、カバー スリップの上に油の 1 滴を追加します。サンプルはレンズを触れないでください。 注意してください。それ以外の場合、レンズを破損ことができます 。
- CCD カメラとデジタル画像集録ソフトウェアを使用して、次の設定とパラメーターを持つ核の画像を取得: 1 X、および自動露出の DAPI フィルター、単分子膜のイメージを得る 。
- フィニッシュ画像取得: 20 X レンズ クリーナー レンズで湿らせたペーパー タオルで拭く。クロロホルムで湿らせたペーパー タオルで油レンズ X 60 を拭く 。
7。クローン細胞死モードの評価
- ランダムに選択された画像でカウント核の合計数が 300 に到達するまで、アポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞の老化に条件を満たす核の数をカウントします。各実験的設定の 3 通のこのステップを実施します。
- Apoptosis のための条件: アポトーシス体 (すなわち、凝縮と断片化した核) 6 、 7 の存在 。 分裂の大惨事の
- 条件: 2 つ以上の異なる葉または micronucl を示す核の存在ei 8 , 9 , 10.
- 細胞の老化のための基準: 老化関連ヘテロクロマチン巣 (SAHF) (すなわち 30-50 の明るい、高密度の巣を含んでいる核 DNA) の存在 2 , 11 。
Representative Results
例として U2OS ひと骨肉腫細胞 6 Gy の x 線治療、72 時間インキュベートされ、DAPI 染色プロトコルに従って試験を受けます。 図 1アポトーシス、細胞分裂の大惨事、60 × 油レンズを使用して得られた細胞の老化と関連付けられる典型的な核形態の拡大画像が表示されます。クローン細胞死の各モードの特徴的な形態の手順 7.1.1-7.1.3 を参照してください。 図 2 20 倍レンズを使用して得られた核の概要画像を示しています。6 Gy の x 線照射による細胞分裂大惨事頻繁より少なく頻繁にアポトーシスと細胞の老化がほとんど。この方法で低倍率のフィールド試験は、一目で与えられた実験の設定でクローン細胞死プロファイルの全体像を理解する 1 つことができます。 図 3は、定量化されたデータのグラフィカル表現を示しています。
図 1: アポトーシス、細胞分裂の破局と細胞老化の典型的な形態を示す DAPI 染色核の画像を拡大表示します。U2OS セル 6 Gy の x 線照射しました。72 時間後のセルは固定され DAPI 染色します。油レンズ X 60 を使用して核画像に買収されました。スケール バー = 20 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: x 線奏効した細胞の核を DAPI 染色の概要イメージ。U2OS 細胞は、6 Gy の x 線照射されたり、モック照射します。72 時間後のセルは固定され DAPI 染色します。20 X レンズを使用して核の画像に買収されました。サークル、アポトーシス;矢印、分裂の大惨事。スケールバー = 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: x 線細胞に誘導されるアポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞の老化に定量化されたデータ。U2OS 細胞は、6 Gy の x 線照射されたり、モック照射します。72 時間後のセルは固定され DAPI 染色します。20 X レンズを使用して核の画像に買収されました。ランダム フィールドから合計 300 核アポトーシス (ap 通信)、分裂大惨事 (MC) と細胞の老化 (Sns) 評価されました。3 通の評価を行った。平均値を記載しており、エラーバーは標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
プロトコルの中で重要な手順は次のとおりです。まず、細胞が成長させる培養皿の単層として多層セルの困難である DAPI 染色核の形態学的評価を行うため。このために、2.9 の手順で培養する培養皿の注意転送の使用をお勧めします。培養皿の揺れと、浮遊細胞の培養皿の中央に細胞の濃度につながる渦が生成します。さらに、多層の細胞につながる overconfluence を避けるべきであります。このために、2.7 の手順で倍加時間と照射と固定の間隔に基づいて培養皿上に播種された細胞の数を変更できます。固定の時におよそ 80 の合流をお勧めします。第二に、速度は固定および DAPI 染色 (すなわち手順 4 および 5) に重要です。これらの手順に要する時間に関してサンプル間の矛盾は形態学的評価があいまいな核の DAPI 信号強度の不均一性につながります。
2.2 ステップでカバー スリップ単一培養皿の数を増やすことができます。35 mm ディッシュに最大 4 つのカバー スリップを配置できるし、数は大きい皿を使用してさらに増加することができます。各培養皿に複数のカバー スリップを配置すると、(すなわちスリップは興味の複数の時点で培養皿一つずつから集めることができるカバー) 与えられた治療のため時間コース評価の効率的な運用ができます。
ステップ 3.2 では、研究者の関心によると照射線量を変更できます。一貫性のある線量の複数の細胞株への応用クローン細胞死、細胞間での各モードへの感度の比較ができます。その一方で、各セルライン iso クローン生存用量の使用により細胞間でクローン細胞死プロファイルの比較。クローン化可能生存分析12iso クローン生存線量を決定できます。D10値、10% クローン生存を提供する線量は、iso クローン生存線量の一般的なエンドポイントです。
研究者の関心によるとステップ 3.3、照射から固定までの時間を変更できます。IR 誘導アポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞の老化のピーク時間は細胞と治療によって異なりますので、これは重要です。この記事で我々 はクローン細胞死プロファイルには、複数の研究による当社グループの最初のスクリーニングに最も有用となる時点として照射後 72 h を使用し、他のとおり1,2,3,4,8,9: (i) X 線誘発アポトーシス細胞腫瘍から大抵は照射後、数日を発生します。(癌細胞 ii) X 線誘起核分裂大惨事が 2 番目または 3 番目の最も顕著に発生する照射による一時的な細胞周期の停止からの解放後の有糸分裂。リリース通常続く照射後約 24 時間が発生する約 24 h (iii) の間隔で繰り返される有糸分裂によって細胞の老化が X 線-誘導が明らかになる問題のセル行に依存ぶり: 2 日後いくつかの初期の場合とほとんどの細胞ラインの照射後 7 日間の照射。時間のクローン細胞の全体像初期スクリーニングからの死のプロファイルを入手した後には、実験・実習、特定のセルの行および/または状態のクローン細胞死の各モードのピーク時間のより詳細な解明を提供金利4。
アッセイとクローンの生存分析を汚す DAPI、放射線感受性評価法のゴールド スタンダードは交換するに注意してください。アポトーシスと細胞分裂の大惨事は、時間の最後だけ。したがって、特定の時点のアッセイを汚す DAPI はアポトーシスと評価の時点で発生する分裂の大惨事を検出します。その一方で、クローンの生存の結果のポイントは、アポトーシスおよび通常照射後 10-14 日の潜伏期間中に発生した細胞分裂の大惨事の総量の時点で試金します。アポトーシスと細胞分裂の大惨事、老化細胞から異なる培養皿の上に残る照射後時間をかけて徐々 に蓄積します。したがって、両方の結果アッセイとクローンの生存分析を汚す DAPI は、潜伏期間中に発生した老化の総量を反映します。重要なは、アポトーシス、細胞分裂の破局と照射による老化の割合によって異なります広く細胞ラインおよび照射線量。一緒に取られて、理論的には、1 つのアッセイの結果に変換できない直接他のアッセイのそれら。
アッセイを汚す DAPI、いくつか制限があります。まず、分裂の大惨事が細胞死の明瞭なモードかどうか物議を醸すままです。放射線生物学分野、細胞分裂異常クローン細胞死1の他のメカニズムとは異なる IR による細胞死の主要なモードと見なされます。その一方で、他はその分裂の大惨事は細胞死はアポトーシスと壊死13,14を含む細胞死の前に、プロセスではなく明瞭なモードではないと主張します。したがって、アポトーシスと細胞分裂の大惨事は、ある程度重なる可能性があります。第二に、以前の研究は、細胞の老化がいくつかの細胞で治療設定2SAHF の不在で発生することが示唆されました。専用各クローン携帯の存在、他の試金で与えられた実験の結論の堅牢性を高めるための死モードが使わなければなりません。第三に、アッセイを汚す DAPI はクローン細胞死アポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞老化 (例えば壊死、オートファジー) 以外のモードを評価することはできません。第四に、腫瘍に対する放射線治療の予測因子としての試金を汚す DAPI のユーティリティは、クリニックで解明されていません。このような視点からクローン細胞死の合計量を評価し、クローンの生存アッセイは SF2、2 Gy 照射した細胞の生存率間の相関関係が確立されるために、試金を汚す DAPI よりも優れてX 線、および放射線治療15腫瘍応答。それにもかかわらず、データ集録のため、クリニックは、高度な専門性と (すなわち、14 日間) の時間の長い期間の要件を主因に広くクローン生存分析が使用されておらず、注目すべきです。比較では、アッセイを汚す DAPI のプロシージャは簡単です、かなり短い時間、約 3-4 日、結果を生成します。DAPI 染色の有用性腫瘍に対する放射線治療の予測因子としての試金は、近い将来にクリニックでテストされます。
要約すると、アッセイを汚す DAPI は IR 誘導的なクローン細胞死の 3 つの主要なモードを同時に評価するコスト効果の高い 1 つのステップの試金。このアプローチ関心の標的細胞に細胞死のメカニズムの解明を目標に様々 な細胞があり、治療設定、および時間単位のクローン細胞死のモード画面の簡単にすることができます。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
柴田晶子夫人は、技術支援を感謝いたします。この作品は、リーディング大学院、重いイオン治療およびエンジニア リングのグローバル リーダーの育成のためのプログラムの文部省、文化、スポーツ、科学および技術の日本からの補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
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