Summary
विकिरण पर अनुसंधान (ir)-प्रेरित clonogenic कोशिका मृत्यु घातक ट्यूमर और सामान्य ऊतकों पर आईआर के प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)-सना हुआ नाभिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized की आकृति विज्ञान के आधार पर IR-प्रेरित clonogenic कोशिका मृत्यु के प्रमुख मोड का आकलन करने के लिए एक एक कदम परख का वर्णन ।
Abstract
विकिरण पर अनुसंधान (ir)-प्रेरित clonogenic कोशिका मृत्यु घातक ट्यूमर और सामान्य ऊतकों पर IR के प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक साथ एक त्वरित और लागत प्रभावी एक कदम परख के लिए एक साथ clonogenic कोशिका IR द्वारा प्रेरित मौत, यानी, apoptosis, mitotic तबाही, और सेलुलर वार्धक्य के प्रमुख मोड का आकलन का वर्णन । इस विधि में, एक कवर पर्ची पर उगाई कोशिकाओं एक्स-रे और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) के साथ दाग के साथ विकिरणित हैं । morphologies-सना DAPI की विशेषता नाभिक के आधार पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, apoptosis, mitotic तबाही, और सेलुलर वार्धक्य के प्रयोग से पहचाने जाते हैं । Apoptosis अपोप्तोटिक निकायों (अर्थात, गाढ़ा और खंडित नाभिक) की उपस्थिति से निर्धारित होता है । Mitotic तबाही नाभिक की उपस्थिति है कि दो या अधिक विशिष्ट पालियों और micronuclei प्रदर्शन से निर्धारित होता है । सेलुलर वार्धक्य वार्धक्य-जुड़े heterochromatic घावों (यानी, परमाणु डीएनए युक्त 30-50 उज्ज्वल, घने घावों) की उपस्थिति के द्वारा निर्धारित किया जाता है । इस दृष्टिकोण को आसानी से clonogenic सेल मौत मोड विभिंन सेल लाइनों, उपचार सेटिंग्स, और/या समय अंक, लक्ष्य कोशिकाओं और ब्याज की शर्तों में सेल मौत के तंत्र elucidating के लक्ष्य के साथ प्रयोग के लिए स्क्रीन करने के लिए प्रयोगकर्ता की अनुमति देता है ।
Introduction
विकिरण (IR) clonogenic कोशिका मृत्यु के कई तरीके लाती है । ir-प्रेरित clonogenic कोशिका मृत्यु पर अनुसंधान सामांय ऊतकों को आईआर की विषाक्तता को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही कैंसर रेडियोथेरेपी की उपचार प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए तरीकों के विकास के लिए । Apoptosis, mitotic तबाही, और सेलुलर वार्धक्य clonogenic कोशिका मौत के प्रमुख तरीके है आईआर1द्वारा प्रेरित । Apoptosis कोशिका मृत्यु कि डीएनए क्षति1द्वारा शुरू की है की एक विनियमित मोड है । Mitotic आपदा कोशिका मृत्यु है कि ंयायपालिका बँटवारा unpaired डीएनए डबल-किनारा टूट जाता है के परिणामस्वरूप के कारण होता है1। सेलुलर वार्धक्य अपरिवर्तनीय सेल विकास के एक राज्य के रूप में परिभाषित किया गया है2गिरफ्तार; ध्यान दें कि सेलुलर वार्धक्य सेल मौत नहीं है, लेकिन यह clonogenic कोशिका मृत्यु की एक विधा है क्योंकि यह होनेवाला कोशिका के clonogenic अस्तित्व को समाप्त ।
विभिन्न सेल आधारित परख व्यक्तिगत रूप से apoptosis का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, mitotic तबाही, और सेलुलर वार्धक्य. Apoptosis टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है अंत लेबलिंग (TUNEL) धुंधला, annexin वी धुंधला, डीएनए विखंडन परख, और उप G1 सेल-चक्र चरण निर्धारण cytometry प्रवाह द्वारा1। Mitotic आपदा MPM2, TUNEL धुंधला, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी1सहित Mitotic मार्करों के लिए दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । सेलुलर वार्धक्य वार्धक्य-जुड़े β-galactosidase (एसए-β-लड़की) धुंधला, विकास गिरफ्तार परख, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी1द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, clonogenic कोशिका मृत्यु के प्रमुख मोड सेल लाइनों और उपचार सेटिंग्स3,4के बीच अलग है । इसलिए, एक दी प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए clonogenic सेल मौत के समग्र प्रोफ़ाइल स्पष्ट करने के लिए, कई परख मौत के इन साधनों के सभी को कवर एक साथ आयोजित किया जाना चाहिए, जो श्रम है और लागत गहन ।
इस अनुच्छेद में, हम एक त्वरित और लागत प्रभावी एक साथ apoptosis, mitotic आपदा का आकलन करने के लिए एक कदम परख, और सेलुलर वार्धक्य आईआर3,4द्वारा प्रेरित का वर्णन । इस विधि में, एक कवर पर्ची पर उगाई कोशिकाओं एक्स-रे और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) के साथ दाग के साथ विकिरणित हैं । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, apoptosis, mitotic तबाही, और सेलुलर वार्धक्य का उपयोग कर morphologies-सना DAPI के संबंधित विशेषता नाभिक के आधार पर प्रत्येक की पहचान कर रहे हैं । यह दृष्टिकोण विभिंन सेल लाइनों, उपचार सेटिंग्स, और समय अंक में clonogenic सेल मौत प्रोफाइल के लिए स्क्रीनिंग सहित अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होगा, लक्ष्य कोशिकाओं और की शर्तों में सेल मौत के तंत्र की जांच के लक्ष्य के साथ ब्याज.
Protocol
- आटोक्लेव आवरण पटका.
एक ग्लास यूरिन में
- प्लेस कवर स्लिप्स.
- पंनी के साथ कांच चोंच कवर ।
- आटोक्लेव at १२१ & #176; ग पर 15 psi के लिए 20 min.
- सोंठ पर ५० & #176; ग. एक संस्कृति हूड में कमरे के तापमान पर स्टोर.
- तैयारी निर्धारण समाधान: फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) में 3% paraformaldehyde + 2% सुक्रोज.
- को १,००० मिलीलीटर कांच की बोतल, जोड़ ७०० एमएल पंजाब और 30 ग्राम paraformaldehyde.
चेतावनी: Paraformaldehyde संक्षारक है, उपयुक्त दस्ताने पहनते हैं । - को ताप से paraformaldehyde पूरी तरह भंग कर ८० & #176; ग एक माइक्रोवेव का उपयोग कर.
चेतावनी: Paraformaldehyde धुएं विषाक्त कर रहे हैं, एक मुखौटा पहनते हैं । - रात को कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
- Add 20 g सुक्रोज.
- जोड़ें कुल मात्रा 1 एल बनाने के लिए पंजाब
- Aliquot में ५० मिलीलीटर ट्यूबों । निर्धारण समाधान 3 वर्षों में संग्रहित किया जा सकता है-20 & #176; c या 3 माह के लिए 4 & #176; c.
- को १,००० मिलीलीटर कांच की बोतल, जोड़ ७०० एमएल पंजाब और 30 ग्राम paraformaldehyde.
- कल्चर और गद्यांश U2OS मानव ऑस्टियो कोशिकाओं को लघुगणकीय वृद्धि बनाए रखने के लिए < सुप class = "xref" > 5 .
नोट: अन्य सेल प्रकार इष्टतम विकिरण खुराक का निर्धारण करने के बाद इस्तेमाल किया जा सकता. - कागज तौलिए के साथ एक स्केलपेल पोंछ ७०% इथेनॉल के साथ गीला । स्केलपेल का प्रयोग, एक ३५ mm सेल संस्कृति पकवान पर एक कवर पर्ची जगह (इसके बाद सिर्फ के रूप में भेजा & #34; पकवान & #34;).
नोट: एक डिश में कवर स्लिप्स की संख्या प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार बढ़ाया जा सकता है (चर्चा देखें) । - 1 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया जोड़ें: DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक.
नोट: अंय मीडिया चुना गया कक्ष प्रकार के अनुसार उपयोग किया जा सकता है । - कागज तौलिए के साथ संदंश पोंछ ७०% इथेनॉल के साथ गीला । संदंश का प्रयोग, धीरे कवर पर्ची के केंद्र पकड़ो । कवर स्लिप पर होल्ड बनाए रखते हुए, डिश से कल्चर मीडिया को पूरी तरह से महाप्राण ।
& #8203; नोट: यह कदम पकवान को कवर पर्ची के स्थिरीकरण को बढ़ावा देता है । - देताच अनुयाई कल्चर्ड सेल का उपयोग trypsin < सुप class = "xref" > 5 .
- डिश से
- महाप्राण कल्चर मिडिया.
- 1 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें और पकवान धीरे हिला । पकवान से
- महाप्राण पंजाबियों.
- जोड़ें 1 मिलि trypsin [0.25 w/v% trypsin-1mmol/L EDTA] डिश के लिए. 5 मिनट के लिए
- में ३७ & #176; ग 5% से युक्त वातावरण में कं 2 .
- डिश के लिए 9 मिलीलीटर कल्चर मीडिया जोड़ें ।
- का उपयोग कर १००० & #956; L micropipette, एकल-कक्ष निलंबन तैयार करें.
- गणना कक्ष < सुप वर्ग = "xref" > ५ .
- में १.५ एमएल ट्यूब, ०.९ एमएल सेल सस्पेंशन और ०.१ एमएल ०.४% Trypan ब्लू सॉल्यूशन शामिल हैं ।
- लागू 10 & #956; L ते अ hemocytometer.
- एक औंधा चरण माइक्रोस्कोप के तहत दाग ( यानी , लाइव) कोशिकाओं की संख्या की जांच करें ।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में, संस्कृति मीडिया में 3 मिलीलीटर सेल निलंबन ०.५ x 10 5 कोशिकाओं/एमएल
के घनत्व पर तैयार नोट: सेल घनत्व प्रयोगात्मक आवश्यकता के अनुसार संशोधित किया जा सकता है (देखें चर्चा ) । - धीरे डिश के लिए सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
- में रात भर गर्मी ३७ & #176; ग 5% से युक्त वातावरण में कं 2 .
- एक औंधा चरण माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच । पुष्टि करें कि कोशिकाओं को कवर पर्ची और जीवित करने के लिए संलग्न हैं ।
- विकीर्ण 6 Gy X-किरणों के साथ पकवान (१.४ Gy/मिनट, ३०० KVP, 20 mA) ।
- के लिए ७२ ज में ३७ & #176; ग 5% से युक्त वातावरण में कं 2 .
नोट: मशीन समय प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है (देखें चर्चा ).
- महाप्राण कल्चर मीडिया. कैंची का प्रयोग
- , एक १,००० की नोक काट & #956; L micropipette टिप 5 मिमी अंत से.
नोट: कटौती टिप को सुचारू रूप से निर्धारण समाधान लागू करने में मदद करता है । - कट टिप का उपयोग कर, पकवान की ओर दीवार से पकवान के लिए 1 मिलीलीटर निर्धारण समाधान (चरण १.२ में तैयार) जोड़ें ।
नोट: यह चरण समय-संवेदी है और इसलिए कई नमूने हैंडलिंग करते समय micropipette युक्तियों को परिवर्तित किए बिना किया जाना चाहिए । पकवान के नीचे करने के लिए सीधे निर्धारण समाधान के आवेदन कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है । - जगह एक वर्ग संस्कृति पकवान में पकवान । वर्ग संस्कृति पकवान धीरे शेक कवर पर्ची पर समान रूप से निर्धारण समाधान वितरित करने के लिए ।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन । पकवान से
- महाप्राण निर्धारण समाधान.
- डिश के साइड की दीवार से डिश के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
नोट: सीधे डिश के नीचे करने के लिए पंजाबियों के आवेदन कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है ।
पकवान से - महाप्राण पंजाबियों.
- दोहराएं चरण ४.७ और ४.८ दो बार ।
नोट: डिश 1 सप्ताह के लिए 4 & #176 पर संग्रहित किया जा सकता है; सी कवर स्लिप्स के साथ 2 एमएल पंजाब में नहाया ।
- एक slide ग्, गू 5 & #956; L 1 & #956; g/mL DAPI धुंधलान रिएजेंट.
नोट: DAPI धुंधला एजेंट 6 महीने के लिए स्थिर है जब प्रकाश से या नीचे से सुरक्षित संग्रहित-20 & #176; ग.
एक स्केलपेल का प्रयोग - , डिश से कवर स्लिप निकालें ।
- कवर स्लिप पर एक कागज तौलिया के साथ कवर पर्ची के किनारे को छूने से अतिरिक्त पंजाबियों आकर्षित ।
- माउंट कवर पर्ची उल्टा DAPI की बूंद पर स्लाइड ग्लास पर दाग इतना है कि कोशिकाओं को उजागर कर रहे है DAPI धुंधलाना reagent ।
नोट: यह चरण समय-संवेदी है । DAPI धुंधला एजेंट के सुखाने के लिए इष्टतम धुंधला करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । - के लिए 1 वर्ष से कम नमूनों को संग्रहित किया जा सकता है & #176; C.
- एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर नमूने की जांच । नाभिक DAPI फ़िल्टर का उपयोग कर विज़ुअलाइज़ कर रहे हैं.
नोट: या तो एक 20X या एक 60X ऑइल लेंस का इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसके अनुसार शोधकर्ता & #39; स याज. जब एक 60X तेल लेंस का उपयोग कर, कवर पर्ची पर तेल की एक बूंद जोड़ें । नमूने लेंस को छूने नहीं है कि सावधान रहें; अंयथा, लेंस क्षतिग्रस्त हो सकता है । - निम्नलिखित सेटिंग्स और मापदंडों के साथ एक सीसीडी कैमरा और डिजिटल छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नाभिक की छवियों को प्राप्त: DAPI फिल्टर, monolayer छवियों, 1x के लाभ, और स्वचालित प्रदर्शन.
- खत्म छवि अधिग्रहण: कागज के साथ लेंस क्लीनर गीला तौलिए के साथ 20X लेंस पोंछ । क्लोरोफॉर्म. के साथ गीला कागज तौलिए के साथ 60X तेल लेंस पोंछ
- बेतरतीब ढंग से चयनित छवियों में, नाभिक की संख्या, apoptosis तबाही, और सेलुलर mitotic के लिए मानदंडों को पूरा जब तक गिनती वार्धक्य की कुल संख्या ३०० तक पहुंचता है । प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए तपसिल में इस कदम का संचालन ।
- मानदंड के लिए apoptosis: अपोप्तोटिक निकायों की उपस्थिति ( यानी , गाढ़ा और खंडित नाभिक) < सुप क्लास = "xref" > 6 , < सुप क्लास = "xref" > 7 . mitotic तबाही के लिए
- मानदंड: दो या अधिक विशिष्ट पालियों या micronucl दिखा नाभिक की उपस्थितिेि < सुप class = "xref" > 8 , < सुप class = "xref" > 9 , < सुप क्लास = "xref" > 10 . सेलुलर वार्धक्य के लिए
- मानदंड: वार्धक्य-संबद्ध heterochromatic घावों (SAHF) की उपस्थिति ( यानी , परमाणु डीएनए युक्त 30-50 उज्ज्वल, घने घावों) < सुप क्लास = "xref" > 2 , < सुप क्लास = "xref" > 11 .
Representative Results
एक उदाहरण के रूप में, U2OS मानव ऑस्टियो कोशिकाओं 6 Gy एक्स के साथ इलाज किया गया रे, ७२ ज के लिए मशीन, और प्रोटोकॉल के अनुसार DAPI धुंधला परख के अधीन । चित्रा 1 apoptosis, mitotic आपदा के साथ जुड़े ठेठ परमाणु morphologies के लिए ज़ूम छवियों से पता चलता है, और सेलुलर वार्धक्य एक ६० × तेल लेंस का उपयोग कर प्राप्त की । clonogenic कोशिका मृत्यु के प्रत्येक विधा के लिए विशेषता morphologies के लिए कदम 7.1.1-7.1.3 देखें । चित्रा 2 एक 20X लेंस का उपयोग कर प्राप्त नाभिक के सिंहावलोकन छवियों से पता चलता है । 6 Gy एक्स-रे के साथ विकिरण mitotic आपदा अक्सर प्रेरित, apoptosis कम बार, और सेलुलर वार्धक्य शायद ही कभी । इस तरह, एक कम वृद्धि हुई क्षेत्र में परीक्षा एक एक नज़र में clonogenic कोशिका मौत प्रोफ़ाइल के समग्र चित्र में एक दिया प्रयोगात्मक सेटिंग में गवां करने के लिए अनुमति देता है । चित्रा 3 मात्रा डेटा का ग्राफ़िकल प्रस्तुतिकरण दिखाता है ।
चित्रा 1: DAPI-सना हुआ नाभिक की ज़ूम छवियों apoptosis, mitotic तबाही, और सेलुलर वार्धक्य के ठेठ morphologies दिखा । U2OS कोशिकाएँ ६ Gy एक्स-रे के साथ विकिरणित थीं. ७२ ज के बाद, कोशिकाओं को स्थिर और DAPI के साथ दाग थे । परमाणु छवियों को एक 60X तेल लेंस का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । स्केल बार = 20 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: एक्स-रे के साथ इलाज किया कोशिकाओं के DAPI-सना हुआ नाभिक के अवलोकन छवियों. U2OS कोशिकाओं को ६ Gy एक्स-रे या नकली-विकिरणित से विकिरणित गया. ७२ ज के बाद, कोशिकाओं को स्थिर और DAPI के साथ दाग थे । नाभिक के चित्र एक 20X लेंस का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । वृत्त, apoptosis; तीर, mitotic तबाही । स्केल बार = ५० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: apoptosis, mitotic तबाही, और सेलुलर वार्धक्य के लिए मात्रा डेटा एक्स-रे के साथ इलाज कोशिकाओं में प्रेरित । U2OS कोशिकाओं को ६ Gy एक्स-रे या नकली-विकिरणित से विकिरणित गया. ७२ ज के बाद, कोशिकाओं को स्थिर और DAPI के साथ दाग थे । नाभिक के चित्र एक 20X लेंस का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । यादृच्छिक क्षेत्रों से, ३०० नाभिक की कुल apoptosis (एपी), mitotic तबाही (एम सी), और सेलुलर वार्धक्य (एसएनएस) के लिए मूल्यांकन किया गया । मूल्यांकन तपसिल में प्रदर्शन किया गया । औसत मान दिखाए जाते हैं, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का संकेत देती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम निंनानुसार हैं । सबसे पहले, कोशिकाओं को एक monolayer के रूप में संस्कृति पकवान पर उगाया जाना चाहिए क्योंकि DAPI-सना हुआ नाभिक के एक रूपात्मक मूल्यांकन का आयोजन multilayered कोशिकाओं के लिए मुश्किल है । इस अंत करने के लिए, चरण २.९ में, एक मशीन के लिए संस्कृति पकवान के सावधान हस्तांतरण की सिफारिश की है; संस्कृति डिश के झटकों निलंबित कोशिकाओं का भंवर उत्पंन करता है कि संस्कृति पकवान के केंद्र में कोशिकाओं की एकाग्रता की ओर जाता है । इसके अलावा, multilayered कोशिकाओं में अग्रणी संगम से बचना चाहिए । इस अंत करने के लिए, चरण २.७ में, संस्कृति पकवान पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या जनसंख्या दोहरीकरण समय और विकिरण और निर्धारण के बीच अंतराल के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । निर्धारण के समय लगभग ८० का संगम अनुशंसित है. दूसरा, गति निर्धारण और DAPI धुंधला (यानी, चरण 4 और 5) में महत्वपूर्ण है । इन चरणों के लिए उठाए गए समय के संबंध में अंतर-नमूना विसंगति नाभिक में DAPI संकेत तीव्रता में विविधता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो रूपात्मक आकलन अस्पष्ट होगा.
चरण २.२ में, एक ही संस्कृति डिश में कवर स्लिप्स की संख्या बढ़ाई जा सकती है; एक अधिकतम चार कवर फिसल जाता है एक ३५ mm डिश में रखा जा सकता है, और संख्या आगे बड़ा बर्तन का उपयोग कर वृद्धि हो सकती है । एक संस्कृति पकवान में एकाधिक आवरण पटका रखकर एक दिए गए उपचार के लिए समय पाठ्यक्रम के मूल्यांकन के कुशल संचालन सक्षम बनाता है (यानी, कवर फिसल जाता है एक संस्कृति पकवान एक से एक के बाद एक से एकत्र किया जा सकता है ब्याज की एकाधिक समय अंक में) ।
चरण ३.२ में, विकिरण खुराक शोधकर्ताओं के हित के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । एकाधिक सेल लाइनों के लिए एक सुसंगत खुराक के आवेदन सेल लाइनों के बीच clonogenic कोशिका मृत्यु के प्रत्येक विधा के लिए संवेदनशीलता की तुलना में सक्षम बनाता है । दूसरी ओर, प्रत्येक सेल लाइन के लिए आईएसओ-clonogenic अस्तित्व खुराक का उपयोग सेल लाइनों के बीच clonogenic सेल मौत प्रोफाइल की तुलना में सक्षम बनाता है । आईएसओ clonogenic अस्तित्व खुराक clonogenic अस्तित्व परख12द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । डी10 मूल्य, खुराक है कि 10% clonogenic अस्तित्व प्रदान करता है, आईएसओ clonogenic अस्तित्व खुराक के लिए एक आम समापन बिंदु है ।
चरण ३.३ में, निर्धारण के लिए विकिरण से समय शोधकर्ताओं के हित के अनुसार संशोधित किया जा सकता है; यह महत्वपूर्ण है क्योंकि IR के लिए पीक समय प्रेरित apoptosis, mitotic आपदा, और सेलुलर वार्धक्य सेल लाइन और उपचार के अनुसार बदलता है । इस अनुच्छेद में, हम समय बिंदु के रूप में विकिरण के बाद ७२ ज का इस्तेमाल किया है कि clonogenic सेल मौत प्रोफाइल के प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए सबसे अधिक उपयोगी होगा, हमारे समूह और अंय लोगों द्वारा कई अध्ययनों के आधार पर इस प्रकार1,2के रूप में वर्णित है, 3 , 4 , 8 , 9: (i) ठोस ट्यूमर से स्थापित कोशिकाओं में एक्स-रे प्रेरित apoptosis ज्यादातर कुछ दिनों के विकिरण के बाद होता है । (२) कैंसर कोशिकाओं में एक्स-रे-प्रेरित mitotic तबाही विकिरण से प्रेरित अस्थायी कोशिका-चक्र गिरफ्तारी से रिहाई के बाद दूसरे या तीसरे बँटवारा में सबसे प्रमुखता से होती है. रिलीज आमतौर पर विकिरण के बाद लगभग 24 एच, लगभग 24 घंटे के अंतराल पर दोहराया mitoses द्वारा पीछा किया जाता है (iii) एक्स-रे-प्रेरित सेलुलर वार्धक्य एक अंतराल के बाद स्पष्ट हो जाता है प्रश्न में सेल लाइन पर निर्भर: 2 दिन के बाद विकिरण कुछ प्रारंभिक मामलों के लिए, और 7 दिनों के सबसे सेल लाइनों के लिए विकिरण के बाद । प्रारंभिक स्क्रीनिंग से clonogenic सेल मौत प्रोफाइल की एक समग्र तस्वीर प्राप्त करने के बाद, समय पाठ्यक्रम प्रयोगों विशिष्ट सेल लाइन में clonogenic कोशिका मृत्यु के प्रत्येक विधा के लिए पीक समय का एक अधिक विस्तृत elucidation प्रदान करेगा और/ प् याज4.
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि DAPI धुंधला परख और clonogenic अस्तित्व परख, विकिरण संवेदनशीलता मूल्यांकन के लिए एक सोने के मानक विधि, विनिमेय नहीं हैं । Apoptosis और mitotic तबाही केवल घंटे के लिए पिछले । इस प्रकार, DAPI एक निश्चित समय बिंदु के लिए धुंधला परख apoptosis और mitotic तबाही है कि आकलन के समय बिंदु पर होता है का पता लगाता है । दूसरी ओर, एक निश्चित समय बिंदु पर clonogenic अस्तित्व परख के परिणाम apoptosis और mitotic तबाही की कुल राशि है कि आमतौर पर 10-14 दिनों के लिए विकिरण के बाद गर्मी की अवधि के दौरान हुई थी शामिल हैं । apoptosis और mitotic तबाही से अलग, होनेवाला कोशिकाओं संस्कृति पकवान पर रहते हैं; वे विकिरण के बाद समय के साथ-धीरे जमा । इसलिए, दोनों DAPI के परिणाम धुंधला परख और clonogenic अस्तित्व परख वार्धक्य की कुल राशि है कि गर्मी की अवधि के दौरान हुई प्रतिबिंबित । महत्वपूर्ण बात, apoptosis, mitotic तबाही का अनुपात, और विकिरण द्वारा प्रेरित वार्धक्य व्यापक रूप से सेल लाइन और विकिरण खुराक के अनुसार बदलता है । एक साथ लिया, सैद्धांतिक रूप से, एक परख के परिणाम अंय परख के उन में सीधे अनुवाद नहीं किया जा सकता है ।
DAPI धुंधला परख कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, यह विवादास्पद है कि क्या mitotic तबाही सेल मौत का एक अलग विधा है रहता है । विकिरण जीवविज्ञान के क्षेत्र में, mitotic तबाही आईआर-प्रेरित कोशिका मौत का एक प्रमुख विधा है कि clonogenic कोशिका मृत्यु1के अंय तंत्र से अलग है माना जाता है । दूसरी ओर, दूसरों का तर्क है कि mitotic तबाही सेल मौत का एक अलग विधा नहीं है बल्कि एक प्रक्रिया है कि apoptosis और परिगलन13सहित सेल मौत से पहले,14। इस प्रकार, apoptosis और mitotic तबाही कुछ हद तक ओवरलैप हो सकता है । दूसरा, पिछले अध्ययनों का सुझाव है कि सेलुलर वार्धक्य कुछ सेल लाइनों और उपचार सेटिंग्स2में SAHF के अभाव में हो सकता है । वर्तमान में, अंय परख विशेष रूप से प्रत्येक clonogenic कोशिका मौत मोड के लिए डिजाइन एक दिया प्रयोग के निष्कर्ष की मजबूती बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । तीसरा, DAPI धुंधला परख clonogenic कोशिका apoptosis, mitotic तबाही के अलावा अंय मौत के तरीके का आकलन नहीं कर सकते, और सेलुलर वार्धक्य (जैसे, परिगलन और autophagy) । चौथा, रेडियोथेरेपी के लिए ट्यूमर की प्रतिक्रिया के एक कारक के रूप में DAPI धुंधला परख की उपयोगिता क्लिनिक में आविर्भाव नहीं किया गया है । देखने के इस बिंदु से, clonogenic अस्तित्व परख, जो clonogenic कोशिका मृत्यु की कुल राशि का आकलन है, DAPI धुंधला परख करने के लिए बेहतर है क्योंकि एक सहसंबंध SF2 के बीच स्थापित किया गया है, 2 विकिरणित के साथ कोशिकाओं के जीवित अंश Gy एक्स-रे, और रेडियोथेरेपी के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया15। फिर भी, यह उल्लेखनीय है कि clonogenic अस्तित्व परख व्यापक रूप से क्लिनिक में उपयोग नहीं किया जाता है, मुख्य रूप से विशेषज्ञता के एक उच्च डिग्री के लिए आवश्यकता के कारण और समय की एक लंबी अवधि (यानी, 14 दिन) डेटा अधिग्रहण के लिए । तुलना करके, DAPI धुंधला परख के लिए प्रक्रिया सरल है और काफी कम समय लगता है, लगभग 3-4 दिन, परिणाम उत्पंन करने के लिए । DAPI धुंधला की उपयोगितारेडियोथेरेपी के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के एक कारक के रूप में परख निकट भविष्य में क्लिनिक में परीक्षण किया जाएगा ।
सारांश में, DAPI धुंधला परख एक लागत प्रभावी एक कदम परख के लिए एक साथ IR-प्रेरित clonogenic कोशिका मौत के तीन प्रमुख तरीके का आकलन है । यह दृष्टिकोण एक को आसानी से विभिंन सेल लाइनों के लिए clonogenic सेल मौत के मोड के लिए स्क्रीन की अनुमति देता है, उपचार सेटिंग्स, और समय अंक, लक्ष्य कोशिकाओं और ब्याज की शर्तों में सेल मौत के तंत्र elucidating के लक्ष्य के साथ ।
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
तकनीकी सहायता के लिए हम श्रीमती अकिको शिबाता का धन्यवाद करते हैं. यह काम शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और जापान की प्रौद्योगिकी के प्रमुख स्नातक स्कूलों के लिए कार्यक्रमों के लिए, भारी आयन चिकित्सकीय और इंजीनियरिंग में वैश्विक नेताओं की खेती के मंत्रालय से सहायता अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
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