Summary
Ricerca sulle radiazioni ionizzanti (IR)-indotto clonogenic delle cellule morte è importante per comprendere gli effetti della IR su tumori maligni e tessuti normali. Qui, descriviamo un saggio di uno stadio per valutare i modi principali di morte cellulare indotta da IR clonogenic basata sulla morfologia di 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI)-macchiato i nuclei visualizzati da microscopia di fluorescenza.
Abstract
Ricerca sulle radiazioni ionizzanti (IR)-indotto clonogenic delle cellule morte è importante per comprendere l'effetto di IR su tumori maligni e tessuti normali. Qui, descriviamo un saggio di una tappa veloce ed economica per valutare simultaneamente i modi principali di clonogenic morte cellulare indotta da IR, cioè, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. In questo metodo, le cellule coltivate su un vetrino coprioggetto sono irradiate con raggi x e macchiate con 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI). Usando la microscopia di fluorescenza, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare vengono identificati in base sulle morfologie caratteristiche dei nuclei DAPI-macchiato. L'apoptosi è determinata dalla presenza di corpi apoptotici (cioè, nuclei condensati e frammentati). Catastrofe mitotica è determinata dalla presenza di nuclei che presentano due o più distinti lobi e micronuclei. La senescenza cellulare è determinata dalla presenza di senescenza-collegata heterochromatic fuochi (cioè, DNA nucleare che contiene i fuochi di brillanti, densi di 30-50). Questo approccio consente lo sperimentatore allo schermo facilmente per modalità di morte delle cellule clonogenic utilizzando varie linee cellulari, impostazioni di trattamento e/o punti di tempo, con l'obiettivo di chiarire i meccanismi di morte cellulare nelle cellule bersaglio le condizioni di interesse.
Introduction
Radiazioni ionizzanti (IR) induce i modi multipli di morte delle cellule clonogenic. La ricerca sulla morte cellulare indotta da IR clonogenic è importante per capire la tossicità di IR ai tessuti normali, così come per lo sviluppo di metodi per aumentare l'efficacia del trattamento di radioterapia del cancro. Apoptosis, catastrofe mitotica e senescenza cellulare sono i modi principali di clonogenic morte cellulare indotta da IR1. L'apoptosi è una modalità regolamentata di morte delle cellule che è iniziata dal DNA danni1. Catastrofe mitotica è la morte delle cellule che si verifica a causa di mitosi aberrante derivanti da unrepaired del DNA double-strand break1. La senescenza cellulare è definita come uno stato di irreversibile delle cellule crescita arresto2; Si noti che la senescenza cellulare non è la morte delle cellule per sé, ma è una modalità di morte delle cellule clonogeniche perché esso abolisce la sopravvivenza clonogenic della cella senescente.
Varie analisi cell-based sono state sviluppate per valutare individualmente apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. L'apoptosi può essere valutata dal terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end etichettatura (TUNEL) colorazione, colorazione di annessina V, test di frammentazione del DNA e sub-G1 ciclo cellulare fase determinazione di flusso cytometry1. Catastrofe mitotica può essere valutata dall'immunofluorescenza che macchia per indicatori mitotici, compreso MPM2, macchiatura TUNEL e la microscopia elettronica1. Senescenza cellulare può essere valutata dalla macchiatura di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone), saggi di arresto di crescita e di microscopia elettronica1. D'importanza, la modalità predominante della morte delle cellule clonogeniche differisce tra linee cellulari e trattamento impostazioni3,4. Pertanto, per delucidare il profilo complessivo di morte delle cellule clonogeniche per una determinata impostazione sperimentale, saggi multipli che copre tutte queste modalità di morte devono essere condotta insieme, che è ad alta intensità di manodopera e di costi.
In questo articolo, descriviamo un saggio di una tappa veloce ed economica per valutare simultaneamente apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare indotta da IR3,4. In questo metodo, le cellule coltivate su un vetrino coprioggetto sono irradiate con raggi x e macchiate con 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI). Usando la microscopia di fluorescenza, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare sono identificati ciascuno basato sulle rispettive morfologie caratteristiche dei nuclei DAPI-macchiato. Questo approccio sarà utile per le applicazioni tra cui la selezione per profili clonogenic delle cellule morte in varie linee cellulari, ambienti terapeutici e punti di tempo, con l'obiettivo di indagare i meccanismi della morte cellulare nelle cellule bersaglio e condizioni di interesse.
Protocol
1. preparazione dei materiali
- Autoclave vetrini coprioggetto.
- Posizionare i vetrini in un becher di vetro.
- Coprire il becher di vetro con lamina.
- Autoclave a 121 ° C a 15 psi per 20 min.
- Secca a 50 ° C. Conservare a temperatura ambiente in una cappa di cultura.
- Preparare soluzione di fissaggio: paraformaldeide 3% + 2% di saccarosio in tampone fosfato salino (PBS).
- a una bottiglia di vetro di 1.000 mL, aggiungere 700 mL di PBS e paraformaldeide 30 g.
Attenzione: Paraformaldeide è corrosivo, indossare guanti appropriati. - Paraformaldeide sciogliere completamente dal riscaldamento a 80 ° C, utilizzando un forno a microonde.
Attenzione: Paraformaldeide fumi sono tossici, indossare una maschera. - Lasciare a temperatura ambiente per una notte.
- Aggiungere 20 g di saccarosio.
- Aggiungere PBS per rendere il volume totale di 1 L. Tubi
- aliquota in 50 mL. Soluzione di fissaggio può essere conservata per 3 anni a-20 ° C o 3 mesi a 4 ° C.
- a una bottiglia di vetro di 1.000 mL, aggiungere 700 mL di PBS e paraformaldeide 30 g.
2. Preparazione della coltura delle cellule
Nota: queste procedure devono essere eseguite in una cappa di cultura.
Cellule di osteosarcoma umano U2OS- cultura e passaggio per mantenere la crescita logaritmica 5.
Nota: Altri tipi di cellule possono essere utilizzati dopo aver determinato la dose di irradiazione ottimale. - Pulire un bisturi con asciugamani di carta inumiditi con etanolo al 70%. Utilizzando il bisturi, posizionare un coprioggetto su una piastra di coltura cellulare di 35mm (d'ora in poi semplicemente indicato come " il piatto ").
Nota: Il numero di vetrini in un piatto può essere aumentato secondo la sperimentale di progettazione (vedi discussione). - Aggiungere 1 mL di coltura: DMEM completati con 10% siero bovino fetale.
Nota: Altri mezzi di comunicazione possono essere utilizzati secondo il tipo di cella scelta. - Wipe forcipe con carta assorbente inumidito con etanolo al 70%. Utilizzando le pinze, premere delicatamente al centro del vetrino coprioggetti. Aspirare i terreni di coltura dal piatto completamente, pur mantenendo una stretta su vetrini coprioggetto.
Nota: questo passaggio promuove immobilizzazione di vetrini coprioggetto al piatto. - Staccare aderente cellule coltivate usando tripsina 5.
- Terreni di coltura dal piatto di aspirare.
- Aggiungere 1 mL di PBS e agitare delicatamente il piatto.
- PBS aspirare dal piatto.
- Aggiungere tripsina 1 mL [0.25w/v% tripsina-1 mmol/L EDTA] al piatto.
- Incubare per 5 min a 37 ° C in un'atmosfera contenente 5% CO 2.
- Aggiungere 9 mL di coltura al piatto.
- Utilizzando una micropipetta di 1000 μL, preparare una sospensione unicellulare.
- Contare le cellule 5.
- In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 0,9 mL di sospensione cellulare e 0,1 mL 0,4% soluzione di blu di Trypan.
- Applicare 10 μL di un emocitometro.
- Esaminare il numero di senza macchia (cioè, dal vivo) le cellule al microscopio invertito-fase.
- In una provetta da 15 mL, preparare 3 mL di sospensione cellulare in terreni di coltura ad una densità di 0.5 x 10 5 cellule/mL.
Nota: Cella densità possono essere modificate secondo sperimentale bisogno (Vedi discussione). - Delicatamente aggiungere 2 mL di sospensione cellulare al piatto.
- Incubare durante la notte a 37 ° C in un'atmosfera contenente 5% CO 2.
3. Irradiazione
Attenzione: gestire l'irradiatore di raggi x con cura secondo il produttore ' istruzioni s.
- Esaminare le cellule al microscopio invertito-fase. Confermare che le cellule siano fissate per il vetrino coprioggetto e vivo.
- Irradiare il piatto con 6 Gy dei raggi x (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Incubare per 72 h a 37 ° C in un'atmosfera contenente 5% CO 2.
Nota: Il tempo di incubazione può essere modificato secondo la sperimentale di progettazione (Vedi discussione).
4. Fissazione
- terreni di coltura dal piatto di aspirare.
- Usando le forbici, tagliare la punta di una micropipetta 1.000 μL Suggerimento 5 mm dall'estremità.
Nota: La punta di taglio consente di applicare uniformemente la soluzione di fissazione. - Usando la punta di taglio, aggiungere 1 mL di soluzione di fissazione (preparata al punto 1.2) al piatto da parete laterale del piatto.
Nota: Questo passaggio è tempo-sensibile e pertanto deve essere eseguito senza cambio micropipetta punte durante la manipolazione di campioni multipli. Applicazione di soluzione di fissaggio direttamente alla parte inferiore del piatto può danneggiare le cellule. - Mettere il piatto in un piatto quadrato cultura. Agitare il piatto quadrato cultura delicatamente per distribuire uniformemente la soluzione di fissaggio sopra il vetrino coprioggetto.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Soluzione di fissaggio aspirare dal piatto.
- Aggiungere 2 mL di PBS al piatto da parete laterale del piatto.
Nota: Applicazione di PBS direttamente alla parte inferiore del piatto può danneggiare le cellule. - PBS aspirare dal piatto. Ripetere i punti 4.7 e 4.8 due volte
- .
Nota: Il piatto possa essere memorizzato per 1 settimana a 4 ° C con il coprioggetto bagnata in 2 mL di PBS.
5. Macchiatura di DAPI
- a un bicchiere di diapositiva, applicare 5 μL 1 μg/mL DAPI colorazione reagente.
Nota: Il reagente di colorazione DAPI è stabile per 6 mesi se conservato al riparo dalla luce pari o inferiore a -20 ° C. - Usando un bisturi, rimuovere il vetrino coprioggetto dal piatto.
- Disegnare l'eccesso di PBS su vetrini coprioggetto toccando il bordo del vetrino coprioggetti con un tovagliolo di carta.
- Montare il vetrino coprioggetto capovolto sulla goccia di DAPI colorazione reagente sul vetro diapositiva affinché le cellule sono esposte al reagente di colorazione DAPI.
Nota: Questo passaggio è tempo-sensibile. Essiccazione del DAPI colorazione reagente può portare alla macchiatura suboptimali. - i campioni possono essere conservati per 1 anno a -20 ° C.
6. Acquisizione immagini
- esaminare il campione su un microscopio a fluorescenza. I nuclei sono visualizzati utilizzando il filtro DAPI.
Nota: Sia un 20x o una lente di olio X 60 possa essere utilizzati, secondo il ricercatore ' interesse. Quando si utilizza un obiettivo di olio X 60, aggiungere una goccia di olio sul vetrino coprioggetti. Fare attenzione che i campioni non tocchino la lente; in caso contrario, la lente può essere danneggiata. - Acquisire immagini dei nuclei utilizzando una telecamera CCD e software di acquisizione di immagini digitali con le seguenti impostazioni e parametri: filtro DAPI, immagini monostrato, guadagno di 1 X e l'esposizione automatica. Acquisizione di immagini di
- finitura: Wipe il 20x lente con asciugamani di carta imbevuti di Pulitore lenti. Pulire il 60 X obiettivo olio con carta assorbente inumiditi con cloroformio.
7. Valutazione delle modalità di morte delle cellule clonogeniche
- In immagini selezionati casualmente, contare il numero dei nuclei che soddisfano i criteri per apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare fino a quando il numero totale di nuclei contati raggiunge 300. Eseguire questo passaggio in triplice copia per ogni impostazione sperimentale.
- Criteri per apoptosi: presenza di apoptotic corpi (cioè, nuclei condensati e frammentati) 6 , 7.
- Criteri per catastrofe mitotica: presenza di nuclei mostrando due o più distinti lobi o micronuclei 8 , 9 , 10.
- Criteri per la senescenza cellulare: presenza di senescenza-collegata heterochromatic fuochi (SAHF) (cioè, DNA nucleare che contiene i fuochi di brillanti, densi di 30-50) 2 , 11.
Representative Results
Ad esempio, cellule umane di osteosarcoma U2OS erano trattate con 6 Gy dei raggi x, incubate per 72 h e sottoposti a DAPI test secondo il protocollo di colorazione. La figura 1 Mostra immagini ingrandite per le tipiche morfologie nucleare associate di apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare ottenuta utilizzando una lente di olio 60 ×. Fare riferimento alla procedura 7.1.1-7.1.3 per le morfologie caratteristiche per ogni modalità di morte delle cellule clonogenic. Figura 2 Mostra immagini Panoramica dei nuclei ottenuti utilizzando un obiettivo X 20. L'irradiazione con raggi x Gy 6 indotto catastrofe mitotica frequentemente, meno frequentemente l'apoptosi e senescenza cellulare raramente. In questo modo, l'esame presso un campo di basso ingrandimento permette di catturare in un colpo d'occhio il quadro generale del profilo clonogenic delle cellule morte in un determinato ambiente sperimentale. La figura 3 Mostra una rappresentazione grafica dei dati quantificati.
Figura 1: ingrandita immagini di DAPI-ha macchiato i nuclei risultati tipiche morfologie di apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. U2OS cellule sono state irradiate con 6 Gy dei raggi x. Dopo 72 h, le cellule erano fissi e macchiate con DAPI. Immagini nucleare sono stati acquisiti utilizzando un 60 X lente di olio. Barra della scala = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica di immagini di DAPI-ha macchiato i nuclei delle cellule trattate con i raggi x. U2OS cellule sono state irradiate con 6 Gy dei raggi x o mock-irradiati. Dopo 72 h, le cellule erano fissi e macchiate con DAPI. Immagini dei nuclei sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo X 20. Cerchi, apoptosi; frecce, catastrofe mitotica. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: dati quantificati per apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare indotto in cellule trattate con i raggi x. U2OS cellule sono state irradiate con 6 Gy dei raggi x o mock-irradiati. Dopo 72 h, le cellule erano fissi e macchiate con DAPI. Immagini dei nuclei sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo X 20. Da campi aleatori, un totale di 300 nuclei sono stati valutati per apoptosi (Ap), catastrofe mitotica (MC) e senescenza cellulare (Sns). Le valutazioni sono state eseguite in triplice copia. I valori medi sono mostrati, e barre di errore indicano le deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Di seguito sono riportati i passaggi critici all'interno del protocollo. In primo luogo, le cellule devono essere coltivate su piastra di coltura come uno strato monomolecolare perché una valutazione morfologica di DAPI-ha macchiato i nuclei è difficile per le celle multilivello. A tal fine, al punto 2.9, si raccomanda attenzione trasferimento di piastra di coltura in un'incubatrice; agitazione del piatto cultura genera un turbinio di cellule sospese che porta alla concentrazione di cellule al centro della piastra di coltura. Inoltre, overconfluence che conduce alle celle multilivello dovrebbe essere evitato. A tal fine, al punto 2.7, il numero delle cellule seminate su piastra di coltura può essere modificato basato sul tempo e l'intervallo tra l'irradiazione e la fissazione di raddoppiamento della popolazione. È consigliabile una confluenza di circa 80 al momento della fissazione. In secondo luogo, la velocità è importante nella fissazione e colorazione DAPI (cioè, i passaggi 4 e 5). Inter-campione incoerenza per quanto riguarda il tempo impiegato per questi passaggi può condurre all'eterogeneità nell'intensità del segnale DAPI nei nuclei, che potrebbe oscurare la valutazione morfologica.
Al punto 2.2, si può aumentare il numero di vetrini in un piatto di sola cultura; un massimo di quattro vetrini può essere collocato in un piatto di 35 mm, e il numero può essere ulteriormente aumentato utilizzando piatti più sostanziosi. Immissione più vetrini coprioggetto in ogni piatto di cultura consente il funzionamento efficiente di valutazione del corso di tempo per un dato trattamento (cioè, il coperchio scivola possa essere raccolti da una piastra di coltura uno per uno in più momenti di interesse).
Al punto 3.2, la dose di irradiazione può essere modificata secondo l'interesse dei ricercatori. L'applicazione di una dose costante di linee cellulari multiple consente il confronto della sensibilità per ogni modalità di morte delle cellule clonogeniche tra le linee cellulari. D'altra parte, l'uso di dosi di sopravvivenza clonogenic iso per ogni linea cellulare consente il confronto dei profili di morte delle cellule clonogeniche tra le linee cellulari. La dose di sopravvivenza clonogenic iso può essere determinata dalla sopravvivenza clonogenic assay12. Il valore di10 D, la dose che fornisce 10% sopravvivenza clonogenic, è un punto finale comune per la dose di sopravvivenza clonogenic iso.
Al punto 3.3, il tempo da irradiazione di fissazione può essere modificato secondo l'interesse dei ricercatori; Questo è importante perché il tempo di picco per apoptosi indotta da IR, catastrofe mitotica e senescenza cellulare varia secondo trattamento e linea cellulare. In questo articolo, abbiamo usato 72 h dopo irradiazione come il punto di tempo che sarebbe più utile per lo screening iniziale dei profili di morte delle cellule clonogeniche, basato su studi multipli dal nostro gruppo e altri descritto come segue1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray-indotta apoptosi in cellule stabilite da tumori solidi per la maggior parte si verifica un paio di giorni dopo irradiazione. (ii) catastrofe mitotica X-ray-indotta in cellule di cancro si verifica più prominente al secondo o terzo mitosi dopo il rilascio dall'arresto temporaneo ciclo cellulare indotta da irradiazione. Il rilascio avviene di solito circa 24 h dopo irradiazione, seguita dalla mitosi ripetute ad intervalli di circa 24 h. (iii) X-ray – indotta senescenza cellulare diventa evidente dopo un intervallo dipende la linea cellulare in questione: 2 giorni dopo irradiazione per alcuni casi in anticipo e 7 giorni dopo irradiazione per la maggior parte delle linee cellulari. Dopo aver ottenuto un quadro complessivo della cella clonogenic profili di morte lo screening iniziale, tempo corso esperimenti forniranno una delucidazione più dettagliata del tempo di picco per ciascun modo di morte delle cellule clonogenic in linea cellulare specifica e/o condizione di di interesse4.
Si deve osservare che il DAPI colorazione dosaggio e l'analisi di sopravvivenza clonogenic, metodo gold standard per la valutazione di sensibilità di radiazione, non sono intercambiabili. Apoptosi e catastrofe mitotica solo durare per ore. Così, il dosaggio per un punto dato tempo di colorazione DAPI rileva apoptosi e catastrofe mitotica, che si verifica nel punto di volta della valutazione. D'altra parte, i risultati della sopravvivenza clonogenic assay in un dato momento punto includono la quantità totale di apoptosi e catastrofe mitotica che si era verificato durante il periodo di incubazione, in genere 10-14 giorni dopo l'irradiazione. Diverso da apoptosi e catastrofe mitotica, cellule senescenti rimangono sulla piastra di coltura; si accumulano gradualmente nel tempo dopo irradiazione. Pertanto, i risultati di entrambi il DAPI colorazione dosaggio e l'analisi di sopravvivenza clonogenic riflette l'importo totale della senescenza che si è verificato durante il periodo di incubazione. D'importanza, la proporzione di apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza indotta da irradiazione varia notevolmente secondo la cella linea e irradiazione della dose. Presi insieme, teoricamente, i risultati di un test non possono essere convertiti direttamente in quelli di altri test.
Il dosaggio di colorazione DAPI ha alcune limitazioni. In primo luogo, resta controverso se catastrofe mitotica è una modalità distinta della morte delle cellule. Nel campo della biologia di radiazione, catastrofe mitotica è considerata una modalità principali di morte cellulare indotta da IR che è distinta da altri meccanismi di clonogenic delle cellule morte1. D'altra parte, altri sostengono che catastrofe mitotica non è una modalità distinta di morte delle cellule, ma piuttosto un processo che precede la morte delle cellule, tra cui l'apoptosi e necrosi13,14. Così, l'apoptosi e la catastrofe mitotica possono sovrapporsi in una certa misura. Precedenti, secondo gli studi suggeriscono che la senescenza cellulare può verificarsi in assenza di SAHF in alcune linee cellulari e trattamento impostazioni2. Al presente, altri saggi appositamente per ogni cella clonogenic morte modalità deve essere utilizzata per aumentare la robustezza delle conclusioni di un esperimento dato. In terzo luogo, il dosaggio di colorazione DAPI non può valutare modi di morte delle cellule clonogeniche diverso da apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare (ad es., la necrosi e l'autofagia). In quarto luogo, l'utilità di DAPI macchiatura saggio come un predittore di risposta del tumore alla radioterapia non è stata chiarita nella clinica. Da questo punto di vista, l'analisi di sopravvivenza clonogenic, che valuta la quantità totale di morte delle cellule clonogeniche, è superiore al DAPI macchiatura saggio perché è stata stabilita una correlazione tra SF2, la frazione sopravvivente di cellule irradiate con 2 Gy I raggi x e la risposta del tumore alla radioterapia15. Tuttavia, è interessante nota che l'analisi di sopravvivenza clonogenic non è utilizzata ampiamente nella clinica, principalmente a causa del requisito per un elevato grado di competenza e un lungo periodo di tempo (cioè, 14 giorni) per l'acquisizione dati. In confronto, la procedura per il dosaggio di colorazione DAPI è più semplice e richiede significativamente meno tempo, circa 3-4 giorni, per generare i risultati. L'utilità della colorazione DAPIanalisi come un predittore di risposta del tumore alla radioterapia sarà testato in clinica nel prossimo futuro.
In sintesi, il dosaggio di colorazione DAPI è un dosaggio di conveniente One-Step per valutare simultaneamente i tre modi principali di morte cellulare indotta da IR clonogenic. Questo approccio permette facilmente dello schermo per le modalità della morte delle cellule clonogeniche per varie linee cellulari, ambienti terapeutici e punti di tempo, con l'obiettivo di chiarire i meccanismi di morte cellulare nelle cellule bersaglio le condizioni di interesse.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo la signora Akiko Shibata per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da localizzativi dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone per i programmi per scuole laureate leader, coltivando Global Leaders in ingegneria e pesante dello ione Therapeutics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
- Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
