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Cancer Research

नमूना और प्रक्रिया के लिए व्यापक प्रोटोकॉल मापने योग्य अवशिष्ट रोग और ल्यूकेमिया से प्रभावित के लिए अस्थि मज्जा तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में स्टेम सेल

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/56386
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,4, 1, 3, 1
1Department of Hematology, VU University Medical Center, 2Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 3Janssen Research & Development, LLC, 4Princess Máxima Center for Pediatric Oncology
* These authors contributed equally

Summary

न्यूनतम या मापने योग्य अवशिष्ट रोग (MRD) का पता लगाने के जोखिम मूल्यांकन को परिष्कृत और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में पतन की भविष्यवाणी के लिए एक महत्वपूर्ण शकुन के निशान है । इन व्यापक दिशानिर्देश और सिफारिशों के अनुरूप और सही पहचान और MRD का पता लगाने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं के साथ, प्रभावी एएमएल उपचार निर्णय लेने में सहायता कर सकते हैं ।

Abstract

गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया में प्रतिक्रिया मानदंड (एएमएल) हाल ही में फिर से स्थापित किया गया है, सुघड़ परीक्षा के साथ निर्धारित करने के लिए उपयोग कि क्या मरीजों को पूरा छूट हासिल की है (सीआर) । जो सीआर दर्ज वयस्क रोगियों के लगभग आधे 12 अस्थि मज्जा में अवशिष्ट एएमएल कोशिकाओं के विकास के कारण महीने के भीतर पलटा जाएगा । इन शेष ल्यूकेमिया कोशिकाओं के quantitation, न्यूनतम या औसत दर्जे का अवशिष्ट रोग (MRD) के रूप में जाना जाता है, इन पुनरावृत्ति की भविष्यवाणी के लिए एक मजबूत हो सकता है । इसके अलावा, कई अध्ययनों के पूर्वव्यापी विश्लेषण से पता चला है कि एएमएल रोगियों की अस्थि मज्जा में MRD की उपस्थिति गरीब अस्तित्व के साथ संबद्ध । न केवल कुल ल्यूकेमिया से प्रभावित जनसंख्या है, एक प्रतिरक्षा संबद्ध ल्यूकेमिया बंदरगाह कोशिकाओं द्वारा परिलक्षित-phenotype (LAIP), नैदानिक परिणाम के साथ जुड़े, लेकिन इतनी अपरिपक्व कम आवृत्ति उप आबादी है ल्यूकेमिया स्टेम सेल (LSC), दोनों में से जो हो सकता है प्रवाह cytometry MRD या MRD तरह दृष्टिकोण के माध्यम से निगरानी की । संवेदनशील परख की उपलब्धता है कि रोग के आधार पर अवशिष्ट ल्यूकेमिया (स्टेम) कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सक्षम (असामान्य आणविक मार्करों या ंयायपालिका immunophenotypes) काफी सुधार हुआ है MRD आकलन एएमएल में । हालांकि, एक रोग के रूप में निहित विविधता और एएमएल की जटिलता को देखते हुए, अस्थि मज्जा नमूना और प्रदर्शन MRD और LSC विश्लेषण के लिए तरीके जब संभव संगत किया जाना चाहिए । इस पांडुलिपि में हम पर्याप्त अस्थि मज्जा महाप्राण नमूना, परिवहन, इष्टतम बहु रंग प्रवाह cytometry आकलन के लिए नमूना प्रसंस्करण, और गेटिंग रणनीतियों MRD और LSC का आकलन करने के लिए चिकित्सकीय निर्णय लेने में सहायता के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन एएमएल रोगियों के लिए ।

Introduction

एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल), असामान्य प्रसार और माइलॉयड जनक कोशिकाओं के संचय के साथ, परिपक्वता कार्यक्रम में दोषों द्वारा विशेषता अस्थि मज्जा की एक द्रोह है, सामान्य hematopoiesis के निषेध, और अंत में अस्थि मज्जा विफलता . रोग आकृति विज्ञान, immunophenotype, cytogenetics, आणविक वाकया, और जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर के संबंध में अत्यधिक विषम है, साथ ही उपचार प्रतिक्रिया और उपचार के परिणाम के लिए1,2. वर्तमान प्रबंधन के उद्देश्य के साथ प्रेरण कीमोथेरेपी शामिल करने के लिए पूरी छूट (सीआर), बाद छूट उपचार, जो मोटे तौर पर आणविक, सितोगेनिक क और immunophenotypic अध्ययन के परिणामों द्वारा निर्देशित है और या तो शामिल है के बाद प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त कीमोथेरेपी के कई पाठ्यक्रमों या (ऑटोलॉगस या allogeneic) स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन3। 90% तक की गहन कीमोथेरेपी के बाद उच्च छूट दरों के बावजूद, 5 साल के वयस्कों में अस्तित्व केवल लगभग 30% है-40%, मुख्य रूप से पलटा जो आमतौर पर कीमोथेरेपी के लिए प्रतिरोधी रहे है और इस तरह के विकास के कारण बहुत मुश्किल से इलाज । बच्चों में परिणाम बेहतर है, हालांकि लगभग एक तिहाई भी पलटा । इसलिए, आसंन पतन के जल्दी पता लगाने के एक unmet चिकित्सा की जरूरत है और मई गाइड पोस्ट-छूट थेरेपी4भरना होगा ।

चिकित्सा के बाद अवशिष्ट रोग सभी निदान और बाद के योग को प्रतिबिंबित कर सकते हैं निदान प्रतिरोध तंत्र/ इसलिए इसके माप शकुन और मार्गदर्शन उपचार के लिए वाद्य हो सकता है । defining अवशिष्ट रोग की संभावना (पूर्व में ंयूनतम अवशिष्ट रोग कहा जाता है और अब औसत दर्जे का अवशिष्ट रोग या MRD के रूप में निर्दिष्ट) अभी तक 5% विस्फोट कोशिकाओं के रूपात्मक कसौटी से नीचे जोखिम classification के परिदृश्य बदल रहा है । वर्तमान में दो तरीकों ज्यादातर MRD का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्रवाह cytometry आधारित और आणविक आधारित हैं, बाद रिवर्स transcriptase पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया जा रहा (RT-qPCR)5 या, हालांकि एक समय से पहले चरण में, अगली पीढ़ी sequencing द्वारा (NGS). वयस्कों में कई अध्ययनों के रूप में अच्छी तरह के रूप में बच्चों में पहले से ही प्रदर्शन किया है कि विभिंन MRD दृष्टिकोण दोनों प्रेरण और समेकन थेरेपी6,7के बाद एएमएल में मजबूत शकुन जानकारी प्रदान करते हैं, और रोग के बोझ की एक नई परिभाषा ( रूपात्मक सीआर के लिए सुपीरियर) अब8उभर रहा है । यह पता चलता है कि प्रवाह और/या आणविक तकनीक द्वारा मूल्यांकन MRD हो जाना चाहिए, और वास्तव में पहले से ही बन रहे हैं, एएमएल में हर नैदानिक परीक्षण में मानक ।

इस पांडुलिपि विस्तृत प्रवाह cytometry प्रक्रिया पर चर्चा के लिए अस्थि मज्जा नमूने में MRD के एक सटीक और reproducible immunophenotypic लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए, प्रवाह cytometry पूर्ववर्ती प्रक्रियाओं प्रसंस्करण सहित । निदान पर अच्छी गुणवत्ता वाले अस्थि मज्जा के नमूनों की उपलब्धता और अनुवर्ती नैदानिक साइटों और नैदानिक परीक्षणों में इस माप की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । वास्तव में, इन पूर्व विश्लेषणात्मक विचार आणविक (पीसीआर और NGS) MRD दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण महत्व के भी हैं । MRD के immunophenotypic लक्षण वर्णन के लिए, aberrantly व्यक्त मार्करों सामान्य माइलॉयड और जनक मार्करों के साथ संयुक्त कर रहे हैं, एक ल्यूकेमिया से जुड़े immunophenotype (LAIP)9की पहचान । MRD ऐसे आंतरिक या अधिग्रहीत ल्यूकेमिया दवा प्रतिरोध, pharmacodynamics और चिकित्सा के कैनेटीक्स, प्रतिरक्षा निगरानी, और अनुपालन के रूप में चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया को प्रभावित करने वाले कई कारकों के परिणामी उपाय । इसलिए, MRD एक बहुत मजबूत पोस्ट निदान शकुन पैरामीटर नैदानिक परिणाम के साथ जुड़े जब रिसीवर-ऑपरेटिंग (ROC) विश्लेषण द्वारा निर्धारित कट-ऑफ स्तर पर dichotomized है । हमारे HOVON 42a अध्ययन के वयस्क एएमएल पलटन के लिए, कट-ऑफ स्तर LAIP सकारात्मक कोशिकाओं के 0.1% पर सेट है/ नकारात्मक का निर्धारण करने के लिए इस कसौटी का प्रयोग सकारात्मक MRD स्थिति बनाम, रोगियों के एक समूह की पहचान की जा सकती है जो एक काफी बदतर पतन घटना, पतन मुक्त और समग्र अस्तित्व6है । इसके अतिरिक्त, हम स्टेम सेल की तरह सुविधाओं के साथ अपरिपक्व, दवा प्रतिरोधी ल्यूकेमिया कोशिकाओं की माप का वर्णन (CD34 + CD38-ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं, या LSC), जो रोगी के परिणाम की एक मजबूत कारक10प्रदान करता है । एक साथ LAIP और LSC दृष्टिकोण प्रवाह cytometric MRD दृष्टिकोण फार्म । LAIP दृष्टिकोण रोगियों के लगभग 90% के लिए उपयुक्त है, जबकि LSC दृष्टिकोण रोगियों के बारे में 80% में लागू किया जा सकता है । रोगियों के 95% से अधिक एक साथ या तो एक पैरामीटर या दोनों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।

अंत में, इस प्रकाशन के प्रवाह cytometry द्वारा MRD का आकलन करने के लिए एक विस्तृत संचालन विवरण प्रदान करता है । यह भी शामिल है: 1) मिलाना और/या अस्थि मज्जा नमूना प्रक्रियाओं का मानकीकरण, 2) नमूना परिवहन मार्गदर्शन 3) FACS के साथ ल्यूकेमिया से प्रभावित सेल का पता लगाने का विस्तृत विवरण एकल सेल ट्यूब दृष्टिकोण सहित कई एंटीबॉडी पैनलों का उपयोग LSC को चिह्नित करने के लिए, 4) मानकीकृत मापन के लिए FACS मशीनों के सेट अप, 5) MRD माप और 6 के लिए विश्लेषणात्मक कार्यक्रमों) LSC का पता लगाने के लिए विश्लेषणात्मक कार्यक्रम.

हम नमूना तैयारी सहित प्रक्रिया के सभी पहलुओं को दिखाने के उद्देश्य से है कि शायद ही कभी चर्चा की है, जबकि यह अंतिम परिणाम की गुणवत्ता के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है । अस्थि मज्जा आकांक्षा और बायोप्सी नैदानिक प्रक्रियाओं अस्थि मज्जा के भीतर टेम कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । ये एक साथ पूरा रक्त गिनती (सीबीसी) और रक्त धब्बा के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं । अस्थि मज्जा आकांक्षा के लिए इष्टतम विधि सटीक निदान और अनुवर्ती MRD माप के लिए के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, एक सफल अस्थि मज्जा महाप्राण LAIP और LSC प्रवाह विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए (कम से १०,०००,००० व्यवहार्य कोशिकाओं). यहां, हम एक अस्थि मज्जा आकांक्षा प्रदर्शन करने के लिए विधि का वर्णन और दिशा निर्देशों, जो पर्याप्त सेल नमूने में परिणाम चाहिए प्रदान (और hemodilution के लिए क्षमता की सीमा) सटीक निदान और अतिरिक्त अनुसंधान के लिए आवश्यक । इन पूर्व विश्लेषणात्मक विचार आणविक (पीसीआर और NGS) MRD दृष्टिकोण के लिए भी महत्वपूर्ण महत्व के हैं । immunophenotyping के लिए सभी नमूनों को संग्रह के 24 ज के भीतर तरजीही रूप से संसाधित किया जाना चाहिए । हालांकि नहीं सिफारिश की, अस्थि मज्जा और परिधीय रक्त के नमूने अभी भी संसाधित किया जा सकता है और विश्लेषण जब परिवेश के तापमान पर 72 घंटे के लिए रखा । इसके अलावा, सामग्री के साथ सभी हैंडलिंग बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए, क्रम में बाद में अनुसंधान के लिए बाँझ कोशिकाओं के cryopreservation को सक्षम करने के लिए/

Protocol

प्रोटोकॉल अनुसंधान संहिता और नजरों से देख विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र की अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है ।

1. अस्थि मज्जा आकांक्षा और नमूना तैयारी

  1. रोगी और सामग्री की तैयारी
    1. एक 16-गेज सुई का उपयोग कर 1% lidocaine के साथ एक या २ १० मिलीलीटर सीरिंज भरें । एक 21 गेज सुई के लिए सुई बदलें ।
    2. एक घड़ी पर 5% EDTA की दो बूंदें-गिलास रखो ।
    3. धब्बा तैयारी के लिए ग्लास स्लाइड्स (n = 15 अनुरूप रोगी क्रमांकन और दिनांक के साथ) सेट करें ।
    4. पार्श्व decubitus स्थिति में रोगी प्लेस । बेहतर पीछे श्रोणि रीढ़ की हड्डी और कलम के साथ निशान का पता लगाएँ ।
      नोट: सामांय में, पीछे बेहतर श्रोणि रीढ़ एक हाथ श्रोणि शिखा के लिए बाहर की चौड़ाई और एक हाथ midline को पार्श्व चौड़ाई स्थित है । महिलाओं में, वास्तविक रीढ़ थोड़ा और अधिक पार्श्व, कुछ पुरुषों में थोड़ा अधिक औसत दर्जे का हो सकता है ।
    5. chlorhexidine 0.5-1% से इथेनॉल में लक्षित बायोप्सी क्षेत्र जावक हलकों में के साथ त्वचा को संक्रमित ।
    6. बाँझ दस्ताने के पैकेज को खोलने, बाँझ दस्ताने पर डाल दिया और एक बाँझ क्षेत्र बनाने के लिए मेज पर पैकेज के नीचे रखना. आकांक्षा सुई के साथ पैकेज खोलें और यह बाँझ क्षेत्र पर जगह है ।
    7. त्वचा और चमड़े के नीचे ऊतक और अंत में periosteum घुसपैठ । periosteum, इस तरह से lidocaine में प्रशासन है कि 1 सेमी व्यास का एक क्षेत्र anesthetized किया गया है ।
      नोट: periosteum करने के लिए lidocaine के पर्याप्त प्रशासन रोगी आराम के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक है । परीक्षण कि periosteum पर्याप्त रूप से शुरू की सुई के साथ इरादा बायोप्सी स्थान दोहन द्वारा anesthetized किया गया है और पूछना अगर रोगी किसी भी दर्द महसूस करता है । नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान बच्चे पूरी तरह से anesthetized होते हैं ।
    8. टिप के पास सुई की धातु शाफ्ट के पक्ष के खिलाफ हथेली और तर्जनी में समीपस्थ अंत के साथ महाप्राण सुई (15 Ga x 2.8 ") पकड़ो; यह स्थिति बेहतर नियंत्रण की अनुमति देता है ।
    9. एक घूर्णन आंदोलन के साथ सुई परिचय (जल्दी से श्रोणि रीढ़ की ओर त्वचा के माध्यम से pronating/supinating आंदोलन बारी) और पीछे श्रोणि रीढ़ के साथ संपर्क में सुई लाने के लिए ।
    10. सुनिश्चित करें कि सुई है periosteum के anesthetized क्षेत्र के लिए शुरू की है; रोगी को केवल दबाव और कोई दर्द महसूस करना चाहिए । यदि रोगी दर्द महसूस करता है, या तो सुई की स्थिति, या अधिक lidocaine प्रशासन ।
    11. कोमल लेकिन फर्म दबाव का प्रयोग, सुई अग्रिम जबकि यह एक बारी दक्षिणावर्त काउंटर दक्षिणावर्त गति में घूर्णन. मज्जा गुहा में प्रवेश आम तौर पर कम प्रतिरोध द्वारा पता लगाया है ।
    12. सुई से stylet निकालें । एक 10 मिलीलीटर सुई को खाली सिरिंज देते हैं ।
    13. एक सौंय पुल के साथ सिरिंज गोताख़ोर वापस लेने के द्वारा नकारात्मक दबाव लागू करें । रोगी चेतावनी दी है कि वे एक ऐंठन उत्तेजना और दर्द महसूस हो सकता है जब मज्जा aspirated जा रहा है । यदि नहीं पर्याप्त अस्थि मज्जा कंटक जारी कर रहे हैं, एक और आकांक्षा एक त्वरित आकर्षित के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । सबसे कंटक पहले 1-2 मिलीलीटर प्रारंभिक पुल से प्राप्त में होगा । महाप्राण केवल 1-2 मिलीलीटर कमजोर से बचने के लिए नमूना ।
      नोट: hemodilution में कमजोर पड़ने का परिणाम होगा और MRD परिणामों को पाया जा सकता है) ।
    14. सिरिंज निकालें और आकांक्षा सुई में stylet की जगह. एक घड़ी में मज्जा का हिस्सा बेदखल गिलास और एक 8 मिलीलीटर हेपरिन के साथ लेपित ट्यूब में आराम ।
      नोट: पर्याप्त एंटिकोगुलेशन सुनिश्चित करने के लिए नमूना ट्यूब में मज्जा महाप्राण रखने के बाद तुरंत प्रत्येक ट्यूब पलटना. अस्थि मज्जा जमावट अक्सर अनुचित सामग्री का कारण है । अतिरिक्त अस्थि मज्जा एक ही स्थान से aspirated जा सकता है, लेकिन अधिमानतः, सुई 5-10 mm उन्नत है इससे पहले कि एक नया महाप्राण लिया जाता है । अधिमानतः नहीं और अधिक से अधिक 2 संमिलन स्तर प्रति ड्रॉ लिया जाना चाहिए । करने के लिए बढ़ती संख्या के साथ ट्यूबों चिह्नित करने के लिए सुनिश्चित करें पहला, दूसरा और/ सबसे प्रासंगिक नैदानिक विश्लेषण के लिए पहला ड्रा का उपयोग करने के लिए यह सामान्य नियम है.
    15. वैकल्पिक रूप से, सम्मिलन स्थान से सुई वापस लेना और यह मज्जा गुहा में फिर से शुरू कुछ मिलीमीटर मूल सम्मिलन स्थान से दूर और प्रक्रिया दोहराएँ.
      नोट: महत्वपूर्ण रक्त संदूषण से बचने के लिए, पुल प्रति 1-2 मिलीलीटर से अधिक महाप्राण न करें ।
    16. के रूप में अक्सर के रूप में सामग्री की जरूरत है दोहराएँ । जब विशिष्ट नैदानिक अध्ययन प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त सामग्री aspirated अस्थि मज्जा सुई निकाल रहा है ।
      नोट: धीमी या अंयथा कठिन अस्थि मज्जा आकांक्षाओं के मामले में थक्कारोधी के साथ पूर्व फ्लश थे कि सीरिंज के उपयोग में सहायक हो सकता है । एक सूखी नल के मामले में, एक trephine बायोप्सी जो इस पांडुलिपि के दायरे के बाहर है प्रदर्शन करते हैं ।
  2. सुघड़ परीक्षा के लिए धब्बों की तैयारी
    1. इष्टतम रूपात्मक आकलन के लिए, कंटक बाहर उठाओ (उदाहरण के लिए एक प्लास्टिक रंग का उपयोग कर) में महाप्राण से घड़ी ग्लास और एक गिलास स्लाइड पर उन्हें जगह.
    2. धीरे मज्जा और धीरे स्लाइड के साथ स्लाइड पर एक और गिलास स्लाइड जगह; किसी भी दबाव से बचें ।
      नोट: केवल बहुत बड़े अस्थि मज्जा कंटक मामूली दबाव के मामले में लागू किया जा सकता है, कोशिका के प्रसार की मोटाई कम करने के लिए. प्रक्रिया एक सहायक है जो नमूना ट्यूबों संभाल कर सकते है से मदद से लाभ । रोगी संख्या और अनुक्रमिक अस्थि मज्जा आकर्षित की संख्या के साथ ट्यूबों के सटीक लेबलिंग महत्वपूर्ण है ।
    3. स्लाइड को अच्छी तरह सुखाएं, और फिर Giemsa Grünwald धुंधला कर सकते है (सामग्री की तालिका देखें) । आकृति विज्ञान के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच ( चित्र 1देखें).
      नोट: चित्रा 1a मुख्य रूप से ल्यूकेमिया से प्रभावित विस्फोटों के साथ एक एएमएल रोगी आंकड़ा 1b, जबकि विभिन्न कार्यात्मक कोशिका प्रकार से मिलकर स्वस्थ अस्थि मज्जा के धब्बों से पता चलता है. बेहतर अवशिष्ट ल्यूकेमिया से प्रभावित बोझ को परिभाषित करने के लिए, immunophenotyping प्रदर्शन की जरूरत है ।

2. आगे की प्रक्रिया के लिए सामग्री का परिवहन

  1. परिवहन के लिए नमूनों की तैयारी
    1. आदेश में सुनिश्चित करें कि सामग्री रिसाव नहीं होगा और ट्यूबों को तोड़ने नहीं होगा बनाने के लिए, सही पैकेजिंग सुनिश्चित ( चित्रा 2देखें) ।
      नोट: हमारे और दूसरों से कोशिकाओं की व्यवहार्यता अनुभव सबसे अच्छा संरक्षित है जब अस्थि मज्जा कमरे के तापमान पर रखा जाता है । लंबी अवधि के परिवहन के लिए यह सबसे अच्छा पारगमन के दौरान तापमान स्थिरता में सहायता करने के लिए एक कमरे के तापमान ' जेल पैक ' का उपयोग कर हासिल की है ।
    2. संकुल लेबल और पैकेज, लंबे समय तक परिवहन या रोगियों के स्विचन के नुकसान से बचने के लिए सही फार्म जोड़ें ।
      नोट: यह होना चाहिए में कम से शामिल: (प्रपत्र 1) रोगी डेटा । इसमें अध्ययन संख्या और सामान्यतः ' जन्म की तिथि ' को शामिल करना चाहिए. प्राप्त लैब में आगमन के बाद सामग्री के सही प्रसंस्करण के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से अनुरोध प्रयोगशाला विश्लेषण का एक स्पष्ट बयान (आणविक निदान, immunophenotyping, MRD आदि) इस फार्म पर है । (प्रपत्र 2) एक संपर्क व्यक्ति का पता और फोन नंबर, और जब आवश्यक हो, सीमा शुल्क के लिए कागजात । मेल में संकुल खोने से बचने के लिए, भेजने प्रयोगशाला हमेशा प्राप्त लैब कि एक नमूना भेजा गया है सूचित करता है । "ट्रैक और ट्रेस" का उपयोग अनुशंसित है ।
  2. अन्य संस्थानों से नमूने प्राप्त करना
    1. सुनिश्चित करें कि उपयुक्त रसद संस्थान में जगह में है प्रयोगशाला में नमूना प्राप्त करने के रूप में ही यह संस्थान में वितरित किया जाता है ।
      नोट: इष्टतम सैंय संगठन के लिए अधिमानतः एक केंद्रीय प्रयोगशाला की आवश्यकता है, जो प्राप्त करता है और स्थानीय क्लिनिक से और बाहरी अस्पतालों से सभी सामग्री इकट्ठा । विशेष रूप से, वितरण और कार्यकारी प्रयोगशालाओं के साथ स्पष्ट संचार के लिए प्रोटोकॉल आवंटित आवश्यक है ।
    2. नमूने प्राप्त करने के बाद, सही हार्ड कॉपी रूपों और एक सुरक्षित ऐसे MRD आईडी नंबर, परीक्षण विशिष्ट आईडी नंबर, अस्पताल पंजीकरण संख्या, भेजने संस्थान, जंम तिथि, सामग्री के रूप में महत्वपूर्ण क्षेत्रों युक्त डाटाबेस में उचित क्रमांकन ध्यान दें प्रकार (अस्थि मज्जा या परिधीय रक्त), सफेद रक्त कोशिका गिनती (WBC), अस्थि मज्जा आकांक्षा की तारीख, नमूने की माप की तारीख और माप की गुणवत्ता के लिए प्रासंगिक किसी भी टिप्पणी.
      नोट: अधिमानतः, इस डेटाबेस भी अतिरिक्त डेटा को शामिल करने के लिए सुसज्जित है (या अंय डेटाबेस के लिए लिंक किया जा) विश्लेषण परिणामों के, और अनुवर्ती डेटा के रूप में आगे रोगी डेटा ।

3. फ्लो Cytometer सेटअप

नोट: यह खंड Euroflow निर्देशों पर आधारित है । 11

  1. FCS SSC पैरामीटर और लक्ष्य प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए photomultiplier (पीएमटी) वोल्टेज की स्थापना
    1. FCS एसएससी मापदंडों के लिए प्रवाह cytometer शुरू और सीएसटी मोती के साथ प्रवाह cytometer पर चलाने के लिए "cytometer सेटअप और ट्रैकिंग (सीएसटी)" प्रदर्शन (सामग्री की तालिका देखें) । एक स्वस्थ दाता से लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे (धारा 4.1 में वर्णित) ।
      1. एक नया प्रयोग बनाएँ (मेनू में: प्रयोग, नया प्रयोग, रिक्त प्रयोग का चयन करें) निर्माता के सॉफ्टवेयर (देखें सामग्री तालिका) के साथ एक फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) बनाम Sideward स्कैटर (एसएससी) डॉट भूखंड FSC और एसएससी पैरामीटर की स्थापना के लिए का उपयोग कर । नाम इस प्रयोग FSC/SCC PMT दिनांक के साथ । पहले वर्तमान cytometer सेटिंग्स का उपयोग करें (दायां क्लिक करें: "लागू वर्तमान सीएसटी") । ये सेटिंग्स सीएसटी-अंशांकन मोतियों का उपयोग कर सीएसटी प्रदर्शन की जांच के साथ उत्पंन किया गया है (सामग्री की तालिका देखें) । "वैश्विक प्रयोग सेटिंग्स" में लिम्फोसाइटों कल्पना करने के लिए FSC और एसएससी समायोजित करें । नोट: हमारे प्रवाह में cytometer इन 285 v और 400 v क्रमशः रहे हैं । बंद की जांच करें "मुआवजा में सक्षम करें": निरीक्षक/साधन सेटिंग्स/
      2. कोशिकाओं (FSC) और दानेदार (एसएससी) के आकार का आकलन करने के लिए "प्राप्त कोशिकाओं" समारोह द्वारा unलेबल्ड लीजड ड परिधीय रक्त कोशिकाओं को मापने शुरू करते हैं । गेट लिम्फोसाइटों और समायोजित/फ़ाइन-ट्यून FSC और SSC वोल्ट gated लिम्फोसाइट जनसंख्या के लिए निम्न अर्थ लक्ष्य मानों तक पहुँचने के लिए: FSC: 100,000 (रेंज ९५,०००-१०५,०००); एसएससी: 15,000 (रेंज 13,000-17,000) ।
      3. न्यूनतम 10,000 घटनाओं को मापने के द्वारा डेटा प्राप्त और रिकॉर्ड करें । gated लिम्फोसाइटों के लिए मतलब FSC और एसएससी लक्ष्य मूल्यों की पुष्टि करें और यदि आवश्यक हो तो पुन: समायोजित ।
    2. लक्ष्य प्रतिदीप्ति चैनलों की स्थापना के लिए PMT वोल्टेज 8 पीक इंद्रधनुष मोतियों अंशांकन कणों का उपयोग (सामग्री की तालिका देखें).
      1. 7-चोटियों के लिए FACS पर एक नया प्रयोग बनाएं । एक वर्कशीट बनाएं "लक्ष्य का मतलब है फ्लोरोसेंट तीव्रता (MFI)" सभी आवश्यक डॉट भूखंडों (n = 2 के साथ; FSC बनाम एसएससी, FITC बनाम पीई), हिस्टोग्राम (n = 8; प्रत्येक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर के लिए एक हिस्टोग्राम) और प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए संदर्भ शिखर मूल्यों (MFI और भिन्नता का गुणांक (CV)) दिखा आँकड़े.
      2. नए सिरे से एक समाधान तैयार 1 ड्रॉप (± 60 µ एल) इंद्रधनुष मोतियों की 1 मिलीलीटर में डीएच2O. धीरे भंवर के समाधान में मोती मिश्रण करने के लिए ।
      3. ऊपर से FSC/SSC वोल्टेज की PMT सेटिंग्स का उपयोग करें और "प्राप्त" समारोह (रिकॉर्डिंग के बिना) का उपयोग करके इंद्रधनुष मोतियों की प्रतिदीप्ति मापने शुरू 5,000 की दहलीज के साथ "कम" प्रवाह दर. FSC बनाम SSC डॉट प्लॉट में स्वेटर मोती जनसंख्या P1 को गेट करने के लिए "आयताकार गेट बटन" का उपयोग करें । गेट FITC बनाम पीई डॉट साजिश में 7वें पीक-जनसंख्या P2 ।
      4. 7-चोटियों इंद्रधनुष मनका निलंबन के अधिग्रहण जारी रखें और समायोजित/सभी प्रतिदीप्ति चैनल में ठीक धुन PMT वोल्टेज को लक्ष्य mfi मूल्यों के अनुसार तक पहुँचने के लिए व्याख्या mfi लक्ष्य चैनलों के रूप में मोतियों के साथ प्रदान की.
      5. का प्रयोग करें "रिकॉर्ड" के बारे में 10,000 घटनाओं का डेटा इकट्ठा करने और 7th चोटी मोतियों के लिए MFI की जांच करें । PMT वोल्टेज यदि आवश्यक हो तो सही. एक बार 7th चोटी के लिए लक्ष्य MFI मूल्यों तक पहुंच रहे हैं, अंतिम PMT मूल्यों के लिए फ़ाइल रिकॉर्ड/
      6. अंतिम pmt मानों को सहेजें और फ़ाइल का नाम pmt सेटअप दिनांक के साथ, जो निर्माता के सॉफ़्टवेयर के कैटलॉग में सहेजें जाएगा । प्रत्येक प्रतिदीप्ति डाई के लिए पर फैल सही करने के लिए इस PMT सेटअप का उपयोग करें.
  2. प्रतिदीप्ति मुआवजा सेटिंग्स
    1. दाग नियंत्रण और प्रत्येक fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए एक ट्यूब लेबल (प्रयुक्त fluorochromes के लिए तालिका एस सी देखें) । पिपेट 100 µ प्रत्येक ट्यूब में बफर के एल ।
    2. भंवर बहुरंगा मुआवजा मोती की शीशी (सामग्री की तालिका देखें) अच्छी तरह से और फिर एक ट्यूब के लिए इन मोतियों की 1 पूर्ण ड्रॉप (± 60 µ एल) जोड़ें ।
      नोट: एक ट्यूब के लिए उन्हें जोड़ने जबकि ट्यूब के पक्ष नीचे मोतियों से टपकता से बचें. यह कम मनका एकाग्रता के लिए नेतृत्व कर सकते है और मुआवजा मैट्रिक्स के परिणामों को प्रभावित कर सकता है ।
    3. पिपेट उचित मात्रा fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी पर्याप्त के एक परीक्षण के लिए गणना की (जो 106 कोशिकाओं दाग करने के लिए पर्याप्त होगा) इसी ट्यूब और भंवर में अच्छी तरह से । एंटीबॉडी को दाग वाले कंट्रोल ट्यूब में न डालें । कमरे के तापमान पर अंधेरे में 15 से 30 मिनट के लिए मशीन (आरटी) ।
    4. 4 मिलीलीटर का वाश बफ़र जोड़ें (फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब)/0.05% azide-0.1% मानव सीरम एल्ब्युमिन (HSA) (सामग्री की तालिका देखें)) प्रत्येक ट्यूब के लिए । 10 मिनट के लिए 300जी पर ट्यूबों केंद्रापसारक । supernatant निकालें और प्रत्येक ट्यूब के लिए धोने बफर के 0.2 मिलीलीटर जोड़कर मनका गोली reसस्पेंड । भंवर ट्यूबों अच्छी तरह से ।
    5. निर्माता का विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें (सामग्री तालिका देखें) और एक नया प्रयोग बनाएं (मेनू में: प्रयोग, नया प्रयोग, रिक्त प्रयोग का चयन करें) और वर्तमान दिनांक के साथ क्षतिपूर्ति फ़ाइल के रूप में नाम बदलें ।
    6. "cytometer सेटिंग" पर जाएं और अनुभाग 3.1 से PMT सेटिंग का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि FSC में थ्रेशोल्ड 5,000 है और सभी प्रयुक्त fluorochromes के क्षतिपूर्ति मान शून्य हैं.
    7. आवश्यकतानुसार, लेबल-विशिष्ट ट्यूबों सहित क्षतिपूर्ति नियंत्रण बनाएं । एक दाग नियंत्रण शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें । मेनू से चुनें: प्रयोग, मुआवजा सेटअप, मुआवजा नियंत्रण बनाएं ।
    8. दाग नियंत्रण ट्यूब लोड और स्वेटर मनका आबादी के आसपास p1 गेट को समायोजित करने और यह सुनिश्चित करें कि p1 गेट केवल स्वेटर मोती शामिल हैं ।
    9. P1 गेट पर राइट-क्लिक करें और चुनें "सभी क्षतिपूर्ति नियंत्रण के लिए लागू करें" । सभी एकल लेबल प्रतिदीप्ति ट्यूबों के लिए रिकॉर्ड डेटा । सत्यापित करें कि P2 गेट प्रत्येक प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम पर सकारात्मक जनसंख्या शामिल हैं । यदि जरूरत हो तो गेट को एडजस्ट करें ।
    10. क्षतिपूर्ति की गणना करें । प्रयोग का चयन करें, मुआवजा सेटअप, मुआवजा की गणना ।
    11. यदि क्षतिपूर्ति परिकलन सफल नहीं होता है, तो एक त्रुटि संदेश प्रदर्शित होता है. आवश्यक समायोजन करें, और पुन की गणना । जब क्षतिपूर्ति परिकलन सफल होता है, तो एक संवाद क्षतिपूर्ति सेटअप के लिए नाम के लिए संकेत प्रकट होता है ।
    12. एक नाम दर्ज करें (उदाहरण के लिए वव-MM-DD 8 रंग सेटअप) और क्लिक, लिंक और सहेजें । मुआवजा सेटअप भी मुआवजा सेटअप सूची में सहेजा जाएगा ।
      नोट: समान fluorophores का उपयोग करके सभी प्रयोगों के लिए एक ही सेटिंग का उपयोग किया जा सकता है.

4. फ्लो Cytometry असेसमेंट (LAIP and LSC)

नोट: यहां हम दाग से पहले थोक lysis प्रक्रिया का वर्णन है, जो WBC की एक पसंदीदा एकाग्रता दाग में सक्षम बनाता है । ज्यादातर MRD प्रोटोकॉल इस दृष्टिकोण का उपयोग करें, हालांकि कुछ सफलतापूर्वक lysis से पहले धुंधला जैसे अंय विकल्पों का इस्तेमाल किया है । पूरे अस्थि मज्जा धुंधलाना पहले lysis तरजीही कोशिका नुकसान12कम कर देती है, लेकिन अप्रत्याशित के नुकसान है, बहुत कम सेल सांद्रता.

  1. कक्षों की बल्क lysis
    नोट: अगले दिन पूरी प्रक्रिया को प्रारंभ करने के क्रम में एक ही दिन नहीं किया जा सकता जब प्रवाह cytrometric अधिग्रहण, आरटी पर unहेर नमूने क्षैतिज रखें ।
    1. कई बार नमूना पलटने से सजातीयता के लिए anticoagulated अस्थि मज्जा नमूना reसस्पेंड । अस्थि मज्जा कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण (सफेद रक्त कोशिका गिनती (WBC)) सेल धुंधला Tuerk समाधान के साथ एक सेल गिनती कक्ष का उपयोग (सामग्री की तालिका देखें).
    2. एक अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब में अस्थि मज्जा की जरूरत मात्रा प्लास्टिक । कोशिकाओं की मात्रा अलग धुंधला ट्यूब की संख्या पर निर्भर है; एक धुंधला (एक ट्यूब) LAIP माप और LSC ट्यूब के माप के लिए 8x106 सफेद रक्त कोशिकाओं के लिए लगभग 2 x 106 सफेद रक्त कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए ।
    3. लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं lysing समाधान जोड़कर (सामग्री की तालिका देखें) । lysing समाधान की आवश्यक मात्रा सेल निलंबन की मात्रा 10 गुना होना चाहिए ।
    4. धीरे से मिश्रण, उलटा और आरटी पर 10 मिनट के लिए गर्मी से । आर टी पर 7 मिनट 800g के लिए केंद्रापसारक supernatant त्यागें (जैसे एक निर्वात पंप या पाश्चर पिपेट के साथ) । प्रारंभ में सेल गोली फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब)/0.05% azide-0.1% मानव सीरम एल्ब्युमिन (HSA) (सामग्री की तालिका देखें) पर RT. उपयोग ट्यूब की अधिकतम मात्रा ।
    5. आर टी पर 7 मिनट 800g के लिए केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें (उदा. वैक्यूम पम्प या पाश्चर पिपेट) । फिर से निलंबित पंजाब में सेल गोली/0.05% azide-0.1% HSA 100x10 की एक कोशिका एकाग्रता के लिए6 WBC/एमएल, और लक्षित ट्यूबों की संख्या पर विभाजित ।
  2. प्रवाह cytometry के लिए कोशिकाओं का धुंधला
    1. प्लास्टिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मोआब) उपयुक्त प्रतिदीप्ति में कॉकटेल समाधान मिश्रण-सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) ट्यूबों और अंधेरे में 15 मिनट के लिए लीजड ड अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ मशीन ।
      नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है जब मिलकर-रंगों का इस्तेमाल कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, मानक रूप से हमारी प्रयोगशाला (तालिका एस सी) में इस्तेमाल पैनलों के घोला जा सकता है देखें ।
    2. 3 मिलीलीटर पंजाबियों/0.05% azide-0.1% के साथ कोशिकाओं को धो लें । 400जीपर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant (उदाहरण के लिए एक वैक्यूम पंप या पाश्चर पिपेट के साथ) त्यागें और सेल गोली 300 µ l पंजाब में 0.05% azide-0.1% HSA ।
    3. LSC माप के लिए: 400 µ l पंजाब में सेल गोली reसस्पेंड/0.05% azide-0.1% HSA और रिक्त मोतियों की 4 µ एल जोड़ें (उदाहरण के लिए Spherotech, सामग्री की तालिका देखें) विश्लेषण में नकारात्मक नियंत्रण जनसंख्या के रूप में उपयोग करने के लिए ।
    4. MRD या LSC प्रयोग खुला FACS पर (सामग्री की तालिका देखें) और MRD के लिए उपाय WBC निदान और gated पर एएमएल नमूने के लिए6 1X10 के माप के लिए WBC के रूप में कम 100,000 एएमएल घटनाओं का पालन करें । LSC प्रयोगों को मापने के लिए कम से 4x106 WBC निदान और अनुवर्ती दोनों पर एक विश्वसनीय LSC परिणाम के लिए ।
    5. परिणामों के विश्लेषण के लिए मानकीकृत उपयुक्त फ़ाइल नाम का उपयोग करके डेटा सहेजें । एएमएल कोशिकाओं पर और एएमएल स्टेम कोशिकाओं पर अलग मापा मार्करों की एक सूची बनाओ (सकारात्मक, नकारात्मक, पर/के तहत अभिव्यक्ति) और लैब जर्नल में इन आंकड़ों की दुकान ।
    6. मामले में कोई निदान उपलब्ध LAIP है, सभी 4 ट्यूबों को मापने के अनुवर्ती यह सुनिश्चित करने के लिए कि किसी भी संभव औसत दर्जे का LAIP एक अलग-से-सामांय दृष्टिकोण में पहचाना जा सकता है ।
    7. निदान पर स्थापित सबसे विश्वसनीय LAIP (s)13 चुनें और संभव के रूप में कई घटनाओं के रूप में प्राप्त है, लेकिन > न्यूनतम संख्या निर्धारित.

5. ल्यूकेमिया से जुड़े इंयूनो-Phenotypes (LAIP) की पहचान: विभिन्न कोशिका की आबादी का विश्लेषण

नोट: FCS फ़ाइलें विभिंन कोशिका आबादी के इष्टतम दृश्य के लिए कई सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ विश्लेषण किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें) ।

  1. सफेद रक्त कोशिका जनसंख्या
    1. गेट CD45 सकारात्मक कोशिकाओं और व्यवहार्य दिखने कोशिकाओं, बाहर कम FSC छोड़ने (गैर व्यवहार्य कोशिकाओं, erythroid कोशिकाओं) के भीतर FSC/ इनमें WBC (चित्र 3ए) शामिल हैं । WBC दिखाएं और एक आदिम मार्कर का उपयोग करें (उदाहरण के लिए CD34; चित्रा 3एद्वितीय) डी CD45dim क्षेत्र (चित्रा 3iii) में विस्फोटों की अंतिम स्थिति का पता लगाने में मदद करने के लिए ।
    2. गेट CD45dim कोशिकाओं और वापस गेट FSC/एसएससी प्लॉट (चित्रा बीआई) में कोशिकाओं । इस गेट में% कोशिकाओं की रिपोर्टिंग करते समय CD34 gate (figure 3Bii) निकालें प्रोग्राम में आपकी जनसंख्या ट्री में% धमाकों के रूप में । एक SSC/CD34 प्लॉट और गेट द CD34 पॉजिटिव सेल (Figure3Biii) में हुए धमाकों को दिखाएं ।
  2. लिम्फोसाइटों
    1. एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में लिम्फोसाइटों का प्रयोग करें: एक नकारात्मक नियंत्रण और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लसीकावत् आबादी के रूप में माइलॉयड आबादी ।
    2. श्वेत रक्त कोशिका जनसंख्या (चित्र 4a) से प्रारंभ करें. गेट लिम्फोसाइटों के रूप में CD45उच्च/SSCकम जनसंख्या (चित्रा 4B) ।
    3. सुनिश्चित करें कि वहां CD34, CD117, CD13 या CD33 और CD13 नकारात्मक/CD33 नकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 4सी-ई) के लिए गेट का उपयोग कर फाटक में कोई माइलॉयड कोशिकाओं रहे हैं । जनसंख्या वृक्ष (figure 4F) में इस जनसंख्या ' लिम्फोसाइटों ' को बुलाओ ।
  3. निदान पर LAIP
    1. बम धमाकों और बाद में एक एसएससी में CD34 सकारात्मक कोशिकाओं/CD34 प्लॉट और आबादी के पेड़ में इन ' आदिम मार्कर ' कहते हैं ।
    2. साजिश आदिम कोशिकाओं, इस मामले में सकारात्मक CD34, और एक लिम्फोसाइटों मार्कर (CD33) के खिलाफ एक लसीकावत् मार्कर (CD7) के साथ एक नए भूखंड में । गेट ंयायपालिका जनसंख्या (दिशानिर्देश अनुपूरक फाइल 1 के लिए देखें) और उंहें जनसंख्या पेड़ में ' LAIP सकारात्मक ' कहते हैं ।
      नोट: अंतिम चुना LAIP विस्फोट जनसंख्या पर% LAIP के रूप में सूचित है । संवेदनशीलता, विशिष्टता और LAIPs की स्थिरता MRD माप में पर्याप्त अनुभव के साथ केवल कर्मियों द्वारा स्थापित किया जा सकता है । इन मापदंडों की कुल LAIP की गुणवत्ता निर्धारित करता है । निदान पर चार अलग LAIP आकलन के उदाहरण चित्रा 5 ए-डीमें दिए गए हैं ।
    3. LAIPs की अभिव्यक्ति का निर्धारण (% विस्फोटों पर) और इन डेटा को किसी डेटाबेस या excel फ़ाइल में रक्षित करें ।
    4. FACS विश्लेषण और LAIPs है कि MRD माप पर इस्तेमाल किया जाना है के नोटों की रिपोर्ट बनाओ ।
      नोट: LAIPs की परिभाषा विशेषज्ञों की एक टीम में अधिकृत है क्योंकि यह अनुवर्ती पर सटीक MRD माप के लिए एक अनिवार्य सुविधा है ।
  4. MRD पर फ़ॉलो-अप
    1. 5.1 में वर्णित के रूप में विस्फोटों गेट लेकिन चिकित्सा के बाद समय बिंदु पर निर्भर करता है; इस गेट का सही आकलन चुनौतीपूर्ण हो सकता है । LAIP phenotype कि निदान और गेट अपरिपक्व जनसंख्या पर स्थापित किया गया था पर ध्यान केंद्रित ।
    2. के रूप में 5.1 में वर्णित है । सही विस्फोट परिभाषित aberrancy के आधार पर गेट का पता लगाएं और उन्हें गेट आउट करने के लिए अस्थि मज्जा और सामान्य भाव को पुनः उत्पन्न करने के बारे में पता होना
    3. सभी अनुवर्ती बिंदुओं पर समान गेटिंग कार्यनीति को दोहराएँ और पूरे श्वेत रक्त कोशिका जनसंख्या में LAIP कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में MRD का निर्धारण करते हैं. उदाहरण के लिए देखें चित्रा 6A और घमण्ड.
    4. रिपोर्ट MRD धनात्मकता जब MRD का% सफेद रक्त कोशिकाओं के ≥ 0.1% है । प्रिंट MRD टीम के साथ साप्ताहिक चर्चा करने के लिए एक मानक प्रारूप में डेटा का विश्लेषण किया । सर्वसम्मति से पहुंचने के बाद ही परिणाम रजिस्टर करें । परिणाम चिकित्सकों करने के लिए संवाद करने से पहले पर्यवेक्षक द्वारा अधिकृत किया जा करने दें ।

6. स्टेम सेल MRD का विश्लेषण (LSC सिंगल ट्यूब)14

  1. निदान पर LSC का विश्लेषण और अनुवर्ती
    1. खंड 5.1 में वर्णित के रूप में ब्लास्ट कक्ष गेट ।
    2. CD38 के लिए संभावित नकारात्मक नियंत्रण के रूप में-, गेट लाल कोशिकाओं-अंश (lysis के बाद शेष लाल रक्त कोशिकाओं अर्थात्, एसएससीकम/FSCकम और CD45नकारात्मकके रूप में विशेषता) । यदि आवश्यक हो, मृत कोशिकाओं और सेल टुकड़े इस साजिश में एक अतिरिक्त फाटक से बाहर रखा जा सकता है ।
    3. ल्यूकेमिया से प्रभावित ब्लास्ट गेट CD34 की अभिव्यक्ति के साथ उपआबादी के भीतर निर्धारित करें । इस जनसंख्या के भीतर का चयन करें CD34+ CD38- कोशिकाओं (कट-ऑफ के रूप में उपयोग करें: सीमा निर्धारण के लिए खाली अंशांकन मोतियों की ऊपरी सीमा (सामग्री की तालिका देखें), लाल-अंश या उपयोग 103 के रूप में कट ऑफ प्वाइंट) । इस जनसंख् या को ' CD38कम progenitors ' (figure 7) कहते हैं ।
      नोट: CD38-कट-ऑफ स्तर सेटिंग पर अधिक जानकारी के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें ।
    4. इस CD38कम जनसंख्या के भीतर का निर्धारण सच CD34 + CD38बहुत कम स्टेम सेल जनसंख्या, लाल अंश के औसत का उपयोग कर, खाली अंशांकन मोतियों की निचली सीमा या कट-ऑफ प्वाइंट के रूप में 102 चुनें (चित्रा 7 ). CD38-कट-ऑफ स्तरों की स्थापना के बारे में अधिक जानकारी के लिए अनुपूरक फाइल 1 देखें ।
    5. दोनों आबादी के भीतर, गेट ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम कोशिकाओं बनाम । पैनल (यानी CD45RA, कॉम्बी-6 (CLEC12A, टिम-3, CD7, CD11b, CD22 और CD56 सब में पीई), CD123, CD33 और CD44) में दिए गए प्रत्येक ल्यूकेमिया से प्रभावित मार्कर का विश्लेषण करके सामान्य टेम स्टेम कोशिकाएं (LSC vs HSC) ।
    6. प्लॉट ब्याज की स्टेम सेल मार्कर बनाम अंय स्टेम सेल मार्कर धनात्मकता के साथ सकारात्मकता/नकारात्मकता/अंय मार्करों की नकारात्मकता के साथ तुलना करने के लिए और ठीक धुन LSC बनाम HSC आवृत्ति ।
    7. अपरिपक्व विस्फोटों, लिम्फोसाइटों, CD34 + कोशिकाओं के प्रतिशत की रिपोर्ट करें । सभी अलग मार्करों के लिए, CD38 की कुल संख्याकम और CD38verylow और CD38कम और CD38verylow जो मार्कर सकारात्मक (और इस प्रकार नवोत्पादित) की संख्या की सूची ।
    8. मार्कर के लिए चयन करें जो आगे विश्लेषण के लिए सामान्य टेम स्टेम कोशिकाओं बनाम ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम कोशिकाओं को अलग करता है । कुल WBC के प्रतिशत के रूप में LSC और HSC के प्रतिशत की गणना करें ।
      नोट: ≥ ०.००४% की LSC का प्रतिशत निदान में सकारात्मक LSC के रूप में सूचित है, जबकि कट-बंद अनुवर्ती ०.०००१% है । ंयायपालिका स्टेम कोशिकाओं अनुवर्ती नमूनों में गेटिंग निदान के रूप में विश्लेषण के समान है, तथापि, स्टेम सेल आबादी में सेल संख्या बहुत छोटा हो सकता है । इसलिए पर्याप्त घटनाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता है ।

Representative Results

एएमएल के 90% रोगियों में कम से एक LAIP की पहचान की जा सकती है । निदान पर आदिम विस्फोट कोशिकाओं के LAIP + कोशिकाओं के सटीक प्रतिशत उत्पन्न करने के लिए, विस्फोट गेट की उचित सेटिंग महत्वपूर्ण है और चित्रा 3में visualized के रूप में सत्यापन की जरूरत है । CD34 + आदिम कोशिकाओं पर aberrancy के एक विशिष्ट प्रकार के बंदरगाह प्रत्येक रोगी का एक उदाहरण चित्रा 5में visualized है. फ़ॉलो-अप पर MRD के मापन के लिए, पहले से निर्धारित LAIP + कक्ष gated है और WBC के LAIP + कक्षों के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किए जाते हैं । इसलिए इस फाटक की स्थापना के लिए सही MRD परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । चित्रा 6 एक रोगी जो पूरा छूट में रहता है और एक रोगी है कि MRD सकारात्मक परिणाम होने के बाद पलटा (≥ 0.1%) प्रेरण चिकित्सा के दूसरे चक्र के बाद से पता चलता है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल केवल CD34 + कोशिकाओं में स्टेम कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए उपयुक्त है, इस डिब्बे की पूरी तरह से लक्षण वर्णन के बाद से पता चला है कि CD38-जनसंख्या अंश की तरह सबसे शक्तिशाली स्टेम सेल बंदरगाह । इस अंश के भीतर HSC से LSC को अलग करने के लिए, अतिरिक्त मार्कर का उपयोग किया जाता है । LSC भेद करने के लिए सबसे अधिक बार चयनित मार्करों CD45RA और कॉम्बी चैनल 6 विशिष्ट LSC मार्कर पीई के साथ लेबल बंदरगाह हैं । आगे नैदानिक मूल्यांकन के आधार पर, एक कट-ऑफ ≥ ०.००४% के स्तर के रूप में परिभाषित किया गया था LSC-सकारात्मक और निदान में बदतर अस्तित्व के साथ जुड़ा हुआ था, जबकि ०.०००१% की कटौती स्तर follw-up10में इस्तेमाल किया गया था ।

Figure 1
चित्र 1 : अस्थि मज्जा धब्बा. क) स्वस्थ दाता और ख) एएमएल रोगी (फैब 5 उपप्रकार) । Giemsa दाग 100x आवर्धन पर दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : जैविक तरल पदार्थ के लिए सही पैकेजिंग सामग्री । नियमों और जैविक तरल पदार्थ परिवहन के नियमों के बारे में अधिक जानकारी के रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र की वेबसाइट15 पर पाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : विस्फोट कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए गेटिंग रणनीति. अ) गेटिंग CD45dim, ब) गेटिंग CD34 + धमाकों.

Figure 4
चित्र 4 : गेटिंग लिम्फोसाइटों. A) ब्लू सेल FSC/SSC प्लाट में दिखाए WBC हैं, ख) हरी कोशिकाओं लिम्फोसाइटों CD45उच्च/SSCकम, सी) CD34 के लिए नकारात्मकता के उदाहरण, घ) CD117 और ई के लिए नकारात्मकता) CD13 के लिए नकारात्मकता के लक्षण हैं, च) विभिंन प्रकार के सेल में दिखाया जाता है एक सिंहावलोकन जनसंख्या ट्री । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : एएमएल निदान पर LAIPs । क) LAIP पर आधारित क्रॉस वंश aberrancy (CD33 व्यक्त कोशिकाओं पर CD7), ख) LAIP के आधार पर अतुल्यकालिक विभेदन (CD11b पर CD13 व्यक्त करने वाली कोशिकाएं), ग) सामान्य कोशिकाओं की तुलना में अधिक व्यक्ती पर आधारित LAIP (CD34 एक्सप्रेस कोशिकाओं परबहुत उच्च ), डी) LAIP सामान्य कोशिकाओं की तुलना में व्यक्त पर आधारित (CD33 एक्सप्रेस कोशिकाओं पर एचएलए-डॉकम ). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : LAIP चिकित्सा के दौरान पीछा किया । एक) निदान पर LAIP परिभाषा (CD34 +/CD13 +/CD33-) और अनुवर्ती के दौरान LAIP के नुकसान में एक रोगी जो सतत पूर्ण छूट में रह रहे हैं, ख) निदान पर LAIP परिभाषा (CD117 +/CD7 +/CD33 +) और अनुवर्ती के दौरान LAIP के हठ एक रोगी में जो चूक. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : स्टेम सेल गेटिंग । क) मोतियों के आधार पर भि CD34 +/CD38 आबादियों की गेटिंग (CD38कम मोतियों की ऊपरी सीमा के नीचे है, जबकि CD38बहुत कम सच नकारात्मक LSC का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कर रहे है और मोतियों की औसत से नीचे स्थित हैं), ख) दो CD45RAनेग और CD45RAपीओएस एक्सप्रेशन के आधार पर फ़ॉलो-अप पर HSC और LSC के बीच भेद वाले रोगियों के उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पर्याप्त डेटा उपलब्ध है कि MRD धनात्मकता के लिए सबूत दिखाने के गरीब अस्तित्व के साथ जुड़े जा रहा है, और इसलिए MRD आकलन अतिरिक्त शकुन जानकारी है जिस पर नैदानिक निर्णय किया जा सकता है प्रदान करके रोगी परिणाम में सुधार हो सकता है । इसलिए, इंयूनो के लिए एक सुसंगत और संगत विधि-MRD के phenotypic आकलन के लिए अंततः रोगी चिकित्सा में सुधार आवश्यक है । यह भी महत्वपूर्ण है जब विभिंन नैदानिक साइटों में नैदानिक अध्ययन की तुलना, और अंततः नैदानिक निर्णय लेने में मदद और समग्र अस्तित्व के लिए एक किराए के नैदानिक समापन बिंदु के रूप में सेवारत हो सकता है । धारणा है कि ठोस दिशा निर्देशों सटीक और सुसंगत MRD माप के लिए वारंट कर रहे है यूरोपीय ल्यूकेमिया नेटवर्क (ELN) की एक ठोस कार्रवाई करने के लिए कला के दिशा निर्देशों के राज्य डिजाइन करने के लिए नेतृत्व किया है । यह व्यापक दस्तावेज देर से प्रकाशित किया जाएगा 2017, और कई अध्ययन समूहों और आगे बढ़ने प्रयोगशालाओं के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों

MRD विश्लेषण के एक महत्वपूर्ण, और अक्सर अनदेखी पहलू MRD का सही निर्धारण पर नमूना गुणवत्ता का प्रभाव है । यह अधिक स्पष्ट है जब सामग्री को वैश्विक नैदानिक अतिरिक्त परिचालनात्मक विचार है कि इस सेटिंग में ध्यान में रखा जाना चाहिए परीक्षणों में अंय संस्थानों को ले जाया जा सकता है । रोगी की जानकारी और नमूनों की समय पर डिलीवरी को मिलाने के जोखिम को कम करने के लिए पर्याप्त प्रशासन महत्वपूर्ण है । फिर, परिवहन के इस स्तर पर सही फार्म और/या इलेक्ट्रॉनिक अस्पताल प्रणालियों में आयात का अनुरोध विश्लेषण के स्पष्ट कार्य के साथ की आवश्यकता है । MRD नमूना की चिकित्सा में मंच टिप्पण भी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह नैदानिक निर्णय लेने के लिए प्रासंगिक (चिकित्सा के दूसरे पाठ्यक्रम के बाद उदाहरण के लिए) हो सकता है और इसलिए स्पष्ट रूप से परिभाषित किया जाना चाहिए । नकली डेटा का उपयोग (जैसे उदाहरण के लिए जनवरी 1 प्रति वर्ष जन्म के) रोगियों या विश्लेषण को मिलाने का खतरा बढ़ जाता है. यदि कानून द्वारा अपेक्षित, पहचान का एक वैकल्पिक गुमनाम तरीके से इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

immunophenotyping के लिए सभी नमूनों को संग्रह के 24 ज के भीतर तरजीही रूप से संसाधित किया जाना चाहिए । हालांकि नहीं सिफारिश की, अस्थि मज्जा और परिधीय रक्त के नमूने अभी भी संसाधित किया जा सकता है और विश्लेषण जब परिवेश के तापमान पर 72 घंटे के लिए रखा । इसके अलावा, सामग्री के साथ सभी हैंडलिंग सबसे अच्छा बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया जा सकता है, तो आगे (स्थानीय) में कोशिकाओं के cryopreservation प्रासंगिक रहता है: कई नैदानिक अध्ययन के साथ ल्यूकेमिया कोशिकाओं की जांच करने के लिए अतिरिक्त विश्लेषण किया है आण्विक, इंयूनो-phenotypic के लिए संमान, और कार्यात्मक सुविधाओं के लिए एक बाद में मंच पर प्रदर्शन किया जाएगा । हालांकि इस पांडुलिपि के दायरे के भीतर नहीं है बैंकिंग का ब्यौरा ।

एक नैदानिक उपकरण के रूप में MRD का उपयोग करने से तात्पर्य है कि यह एक मांयता प्राप्त प्रयोगशाला, न केवल प्रवाह cytometry के लिए, लेकिन यह भी MRD आकलन के गुणवत्ता नियंत्रण के बारे में की जरूरत है । यह विशिष्ट संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए नमूने वितरण की आवश्यकता हो सकती है या (आरई) संदर्भ टीमों द्वारा MRD माप के साथ प्रवाह फ़ाइलों का विश्लेषण.

यह लेख अस्थि मज्जा महाप्राण संग्रह से नैदानिक नमूनों में MRD का निर्धारण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कार्यों का वर्णन-विशिष्ट कार्यों, जिंमेदारियों के साथ विशेषज्ञों की एक पूरी टीम की आवश्यकता होती है, और प्रभावी के लिए लगातार संचार के साथ लक्षण वर्णन और विश्लेषण । चूंकि प्रत्येक कार्य प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, यह प्रत्येक प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल सहित ध्वनि रसद की सिफारिश की है और वापस पर्याप्त कर्मियों जो विशेष रूप से कार्य के लिए प्रशिक्षित किया गया है । इसके अलावा, के बाद से वहां प्रक्रियाओं के भाग में कुछ अपेक्षाकृत व्यक्तिपरक कदम है (विशेष रूप से LAIP और LSC ंयायपालिका मार्कर पहचान), यह टीम द्वारा अंतिम परिणाम के बारे में विचार विमर्श किया है आवश्यक है, और अंतिम रिपोर्ट की एक टीम द्वारा अधिकृत है पर्यवेक्षकों. वर्तमान प्रयासों कंप्यूटर सॉफ्टवेयर विकास है कि मानकीकरण (LAIP और LSC) MRD विश्लेषण में मदद मिलेगी पीछा कर रहे हैं ।

संशोधन और समस्या निवारण

प्रत्येक प्रयोगशाला एंटीबॉडी का अपना सेट है कि विभिंन उपआबादी को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि मार्करों की एक मानकीकृत रीढ़ की तुलना परिणामों के लिए आवश्यक है, के रूप में MRD माप दस्तावेज़ के लिए कला के दिशा निर्देशों के ELN राज्य में उल्लिखित इसके बाद के संस्करण भेजा । चुने हुए मार्करों के बावजूद कुछ मुद्दों है कि परिणाम के विश्लेषण मुश्किल कर सकते है और ध्यान में रखा जाना चाहिए रहे हैं ।

तकनीक की सीमाएं

LAIP और LSC ंयायपालिका मार्कर अभिव्यक्ति की पहचान पहले निदान पर मूल्यांकन किया है और समय पर नजर रखी है (के दौरान और चिकित्सा के बाद) MRD phenotype के सटीक लक्षण वर्णन के लिए. जबकि रोगियों के 95% से अधिक LAIP या LSC के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है (या दोनों), अभी भी कुछ रोगियों को परिभाषित नहीं LAIPs या कोई CD34 + CD38-LSCs या CD34 नकारात्मक विस्फोटों के साथ मौजूद है, या एक लापता निदान नमूना है । इन मामलों में, यह अभी भी प्रयास करने के लिए सार्थक है और एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ MRD मापने के रूप में उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यापक अनुमति देता है और फिर सबसे विश्वसनीय का चयन करें (ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं का सबसे मजबूत भेद दे) LAIP. यह देखते हुए कि रोगियों के अनुपात जो अंततः पलटा नहीं पूरी तरह से निदान immunophenotype के समान है, एएमएल रोग के विविधता के कारण, MRD पर एंटीबॉडी के एक व्यापक पैनल को मापने किसी भी समय की सिफारिश की है । इन immunophenotypic पाली विस्फोट कोशिकाओं और LSCs शामिल हैं और चिकित्सा के दौरान होने के लिए दिखाया गया है16 और मापने वाली बीमारी इन तथाकथित आगामी आबादी पर आधारित हो सकता है । इस समय तथापि, यह निर्धारित नहीं किया गया है कि सभी immunophenotypic उप आबादी रोग पतन के लिए नेतृत्व करेंगे, और इसलिए सामांय अभ्यास के लिए MRD सिलवाया-नैदानिक परीक्षणों में इन कोशिकाओं पर आधारित चिकित्सा रिपोर्ट नहीं है । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि जनसंख्या परिवर्तन के कारण लापता LSC के जोखिम एक ट्यूब दृष्टिकोण है जिसमें सबसे महत्वपूर्ण aberrancy परिभाषित मार्करों एक प्रवाह cytometry (पीई) चैनल14में हैं द्वारा कम है ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि एक या अधिक LAIPs, जो कोशिकाओं चिकित्सा के दौरान पीछा कर रहे है की परिभाषा पर निर्भर करता है । इस विधि का एक नुकसान यह है कि यह हाल ही में दिखाया गया है कि LAIP चिकित्सा के दौरान बदल सकता है । इस तरह से विभिंन ंयायपालिका मार्करों के साथ कुछ आगामी आबादी याद किया जा सकता है । इस दरकिनार करने के लिए, यह सबसे अच्छा होगा के बजाय केवल निदान में पाया उन सभी ंयायपालिका मार्करों को मापने । यह तो "सामांय से अलग" दृष्टिकोण है कि कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयोग किया जाता है के समान होगा17।

भविष्य अनुप्रयोगों

हाल ही में, MRD उपंयास नैदानिक परीक्षण डिजाइन के लिए अतिरिक्त ध्यान प्राप्त हुआ है । विशेष उपचार के विकल्प और लक्षित ड्रग थेरेपी के युग में, एक परिणाम उपाय के रूप में MRD का उपयोग करने के लिए उपंयास उपचार के नैदानिक प्रभावकारिता स्थापित करने की जरूरत समय कम हो जाएगा, अंततः तत्काल आवश्यक चिकित्सकीय की तेजी से परिचय की अनुमति क्लिनिक में विकल्प । उचित रसद और एक संगत MRD आकलन के व्यावहारिक निष्पादन के महत्व के रूप में एफडीए वर्तमान में एक किराए समापन बिंदु के रूप में MRD का उपयोग करने की व्यवहार्यता की जांच कर रहा है भविष्य एएमएल उपचार सफलता के लिए महत्वपूर्ण है समग्र अस्तित्व 18उपाय ।

Disclosures

एंटीबॉडी कई स्वतंत्र संस्थानों में स्टेम सेल ट्यूब के सत्यापन के लिए इस्तेमाल कॉकटेल कृपया BD द्वारा प्रदान किया गया । लेखकों के पास इस पांडुलिपि के संबंध में खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध को डच कैंसर सोसायटी (ALPE 2013-6371) और Egbers फाउंडेशन फॉर VONK ने सपोर्ट किया है । हम सहयोग और सतत सुधार और एएमएल-MRD के मानकीकरण के लिए उपयोगी विचार विमर्श के लिए डच एएमएल-MRD कार्य समूह धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Biosciences 120995496,060996589 and 013729 FACS Canto II 
BD Biosciences 555360 CD7 FITC
DAKO F076701 CD2 FITC
Sanquin M1613 CD36 FITC
BD Biosciences 332778 CD15 FITC
BD Biosciences 335039 CD45RA FITC
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345785 CD14 PE
Miltenyi Biotec 130-080-801 CD133 PE
BD Biosciences 562566 Clec12a PE
BD Biosciences 565568 Tim-3 PE
BD Biosciences 332774 CD7 PE
BD Biosciences 333142 CD11b PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 347222 CD34 PERCP-CY5.5
BD Biosciences 558714 CD123 PERCP-CY5.5
Beckman Coulter B49221 CD117 PE-CY7
BD Biosciences 562854 CD33 BV421
BD Biosciences 345791 CD19 APC
BD Biosciences 333143 CD11b APC
BD Biosciences 345800 CD33 APC
BD Biosciences 345807 CD38 APC
BD Biosciences 641411 HLA-DR APC-H7
BD Biosciences 560532 CD44 APC-H7
BD Biosciences 562596 CD13 BV421
BD Biosciences 348811 CD34 PE-CY7
Beckman Coulter A96416 CD45 Krome Orange
BD Biosciences 655873 CD45 HV500c
BD Biosciences 655051 CST beads 
BD Biosciences 555899 Pharm lysing solution
BD Biosciences 644204 Multicolor CompBeads
BD Biosciences 655051 CST beads
BD Biosciences FACSDiva software
Cytognos Infinicyt 
Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Sigma-Aldrich Tuerk solution
Spherotech BCP-100-5 Blank Calibration Particles Beads
         HSA
         Azide
         ddH2O

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 133 एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया मध्यम श्रेणी के अवशिष्ट रोग ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम सेल अस्थि मज्जा आकांक्षा ल्यूकेमिया एसोसिएट immunophenotype प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर विश्लेषण
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Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J. W. M., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J. M., Kaspers, G. J. L., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

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