Summary
最小限、または測定可能な残存病変 (MRD) の検出は、リスク アセスメントを精製急性骨髄性白血病 (AML) の再発を予測するための重要な予後バイオ マーカーです。これらの包括的なガイドラインと、MRD の一貫性と正確な同定と検出のためのベスト プラクティスと推奨事項は、意思急性骨髄性白血病の治療に役立つ可能性があります。
Abstract
急性骨髄性白血病 (AML) の判定は、患者が完全寛解 (CR) を達成しているかどうかを決定する利用形態の検討と再確立近年します。約残留急性骨髄性白血病骨髄細胞の伸長による 12 ヶ月以内 CR に入った大人の患者の半数に再発します。これらの残りの最小限または測定可能な残存病変 (MRD) として知られているが、白血病細胞の定量は、堅牢なこれらの再発の予測マーカーをすることができます。 さらに、いくつかの研究の回顧的分析は、急性骨髄性白血病の患者の骨髄の MRD の存在が貧しい人々 の生存と相関することを示しています。白血病の総人口は、だけでなく、細胞、白血病をかくまっている免疫表現 (LAIP)、臨床結果に関連付けられている関連付けられているが、白血病幹細胞 (LSC) をすることができますどちらの未熟な低周波の亜種は、反映フローサイトメトリー MRD または MRD のようなアプローチで監視。特定の病気または疾患関連の機能 (異常な分子マーカーまたは異常 immunophenotypes) に基づいて残留白血病 (幹) 細胞の検出を有効にする敏感な試金の可用性が大幅に改善された MRD 評価を持ってください。アジア ・ マイル リミテッド。ただし、固有の多様性と疾患として急性骨髄性白血病の複雑さを考えると、骨髄をサンプリングし、MRD と LSC の解析を実行するためのメソッド調和させるべき可能な場合。本稿で我々 は十分な骨髄液をサンプリング詳細な方法を説明します、輸送、最適なマルチカラー フロー フローサイトメトリー評価の処理や MRD と LSC 治療決定の支援するために評価するための戦略をゲート急性骨髄性白血病の患者。
Introduction
急性骨髄性白血病 (AML) は通常造血と最終的に骨髄障害の抑制骨髄前駆細胞の異常増殖と蓄積成熟プログラムの欠陥によって特徴付けられる骨髄の悪性腫瘍.病気は治療効果や治療結果1,2だけでなく、形態・ イムノフェノ タイプ、細胞遺伝学、分子の異常と遺伝子発現シグネチャに関して極めて不均一。現在管理を含む完全寛解 (CR)、続いて寛解後治療を分子、細胞遺伝学的の結果によって導かれる主を目指す誘導療法と肺浸潤研究では、いずれかの追加化学療法または (自己または同種) 幹細胞移植3のいくつかのコース。 高い寛解率にもかかわらず大人で 5 年生存率 90% までの集中的な化学療法を約 30%-40% の開発のために主にのみ後再発一般的化学療法に抵抗性と治療するためにそれにより非常に困難であります。子供たちの結果は、約 3 分の 1 も再発が、良いです。したがって、差し迫った再発の早期発見は、満たされていない医療ニーズを満たす、寛解後療法4をガイドがあります。
治療は、すべての診断と後診断抵抗メカニズム/要因の合計を反映可能性があります後残存病変したがって予後と器楽指導の処置のための測定があります。出店残存病変 (MRD として測定可能な今呼ばれる残存病変や微少残存病変が旧称) の 5% ブラスト細胞の形態学的基準をはるかに下回るの可能性は、リスク分類の風景を変えています。現在ほとんど MRD を検出するために使用する 2 つの方法は、フロー フローサイトメトリーおよび分子に基づく、後者逆転写酵素 (RT qPCR) PCR5によって評価されて、時期尚早の段階ではあるが次世代シーケンス (NGS)。大人だけでなく子供のように多くの研究はすでに MRD のさまざまなアプローチが両方誘導と統合療法6,7、および病気の負担 (新しい定義後に急性骨髄性白血病の強力な予後情報を提供することを実証形態学的 CR に優れた) 今浮上している8。これは、MRD 評価フローおよび/または分子技術になるべきと実際にはすでに標準になり、急性骨髄性白血病のすべての臨床試験で示唆しています。
本稿では、骨髄のサンプル、骨髄サンプリングを含む、処理手順フローサイトメトリーの前で MRD の正確かつ再現性肺浸潤特性を取得する詳細な流れ cytometry 手順について説明します。診断と経過観察で質の良い骨髄サンプルの可用性は、臨床現場と臨床試験でこの測定の成功に不可欠です。実際には、極めて重要な分子 (PCR と NGS) MRD アプローチはこれらの事前分析に関する考慮事項があります。MRD の肺浸潤特性の異常発現マーカーは、通常骨髄系前駆細胞マーカー、白血病関連イムノフェノ タイプ (LAIP)9と結合されます。MRD は、組み込み関数または取得した白血病の薬剤耐性、薬力学療法、免疫監視およびコンプライアンスの動態などの治療への反応に影響を及ぼす多くの要因の結果を測定します。したがって、MRD は受信者動作特性 (ROC) 解析によって決定されるカットオフ レベルに思って下さいした臨床の結果に関連付けられている非常に強力なポスト診断予後パラメーターです。HOVON 42 a の私達の大人の急性骨髄性白血病のコホート研究、カットオフ レベルを LAIP 肯定的な細胞/総白血球細胞の 0.1% に設定します。この基準を使用すると、否定的な対正 MRD ステータスを決定するため、患者のグループ識別できます大幅に悪化再発率、無再発と全生存期間6を持っています。さらに、患者のアウトカム10の強力な予測を提供する (cd 34 + CD38-白血病幹細胞または LSC) の幹細胞のような機能を持つ未熟な, 薬剤耐性白血病細胞の測定について述べる。一緒に LAIP と LSC 形フロー フローサイトメトリーによる MRD アプローチに近づきます。LAIP アプローチは、LSC アプローチは、患者の約 80% で適用することができます中に、患者の約 90% に適しています。1 つのパラメーターまたは両方の患者の 95% が評価することができますの一緒に。
最後に、この文書は、フローサイトメトリーによる MRD を評価するために詳細な操作説明を提供します。これが含まれます: 1) 調和および/または骨髄試料採取方法の標準化、2) サンプル交通指導 3) 詳細説明白血病細胞検出の FACS 単一セル管アプローチを含むいくつかの抗体パネルを使用するとLSC、4 を特徴付ける)、FACS のセットアップは、標準化された測定、5 機) MRD 測定および 6 の分析プログラム) LSC 検出のための解析プログラム。
以来、それは究極の結果の質の重要な問題についてはほとんどサンプル準備を含むプロシージャのすべてのファセットを表示を目指しています。骨髄穿刺と生検、骨髄内の造血細胞を評価する臨床試験の手順。これらは、完全な血計算 (CBC) と血液塗抹標本と一緒に実行されます。骨髄穿刺する最適の方法は、正確な診断とフォロー アップの MRD 測定に不可欠です。さらに、正常な骨髄液は LAIP と LSC のフロー分析 (少なくとも 1000 万実行可能な細胞) を実行する十分なセルを含める必要があります。ここで、骨髄穿刺の実行方法を説明し、でを結果十分なセル サンプリング (限界希釈の可能性) に必要な正確な診断および付加的な研究のためのガイドラインを提供します。極めて重要な分子 (PCR と NGS) MRD アプローチのこれらの事前分析の考慮事項があります。診療のすべての標本コレクションの 24 h 内で優先的に処理されます。ない recommendable、骨髄および末梢血サンプルまだ処理および分析できる周囲温度で 72 h を続けたとき。さらに、後の研究/品質評価などの無菌細胞の凍結保存を有効にするために、無菌条件下で材料ですべて処理を実行必要があります。
Protocol
研究コードのガイドラインと VU 大学メディカル センターの研究倫理委員会をプロトコルに従います。
1. 骨髄穿刺およびサンプル準備
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患者および材料の準備
- 1% リドカイン 16 ゲージ針を使用して 1 つまたは 2 つの 10 mL の注射器を入力します。21 g 針の針を交換してください。
- 時計ガラス 5 %edta の 2 つの滴を置きます。
- スライド ガラスを設定 (n = 一貫した患者番号と日付の 15) の塗抹標本。
- 患者を側臥位に配置します。優れた後腸骨棘を見つけて、ペンで印をつけます。
注: 一般に、後方腸骨棘は腸骨稜と正中線の 1 つの手幅外側の遠位に位置する 1 つの手幅です。女性で実際背骨がもう少し側の, いくつかの男性は、もう少し内側にあります。 - クロルヘキシジン 0.5 1 で皮膚を消毒円で外へ向かう目的生検領域からエタノールで %。
- 滅菌手袋のパッケージを開く、滅菌手袋、滅菌フィールドを作成するテーブル上のパッケージを置きます。吸引針をパッケージを開き、滅菌フィールドの上に配置します。
- 皮膚や皮下組織と最後に骨膜に潜入します。骨膜で直径 1 cm の領域が麻酔されているような方法でリドカインを管理します。
注: 骨膜にリドカインの投与は、患者の快適さのための最も重要な要因の 1 つです。骨膜は導入針生検目的場所をタップすることで十分に麻酔されているかどうかをテストし、患者が痛みを感じているかどうかを求めます。ノートの: 子供は完全に全体の手順中に麻酔。 - 吸引針を保持 (15 Ga x 2.8") 手のひらと人差し指先端; 近くの針の金属シャフトの側面に対しての近位端でこの位置よりよい制御をことができます。
- 腸骨棘に向かって皮膚を通して (pronating supinating 運動を交互にすばやく) して回転運動針を導入し、後方腸骨棘と接触針をもたらします。
- つまり針、麻酔; 骨膜部に導入されてであることを確認します。患者は、圧力と痛みだけを感じるはずです。患者が痛みを感じている場合、針の位置を変更またはより多くのリドカインを管理します。
- 穏やかな圧力を使用して、交互のカウンター時計回り時計回りに動きで回転しながら針を進めます。骨髄腔への入口は、低下抵抗によって一般に検出されます。
- 針から、スタイレットを削除します。10 mL 空の注射器を針に付けます。
- ゆっくり引いてシリンジのプランジャーを撤回することによって否定的な圧力を適用します。彼ら可能性があります感じることけいれん感覚と痛みときに骨髄を吸引されているが、患者に警告します。十分な骨髄スピキュールがリリースされた場合別の吸引は 1 つのクイック ドローを実行必要があります。ほとんどのスピキュールは、初期のプルから得られる最初の 1-2 mL になります。試料の希釈を避けるために 1-2 mL のみを吸い出しなさい。
注: 希釈希釈になります、MRD 結果を混同するかもしれない)。 - 注射器を削除し、吸引針に、スタイレットを置き換えます。時計ガラスとヘパリン コーティング 8 mL チューブに残りの部分に骨の髄の部分を取り出します。
注: は、十分な抗凝固療法を確保するため試料管に骨髄穿刺直後に各チューブを反転します。骨髄の血液凝固は、しばしば不適切な材料の原因です。追加の骨髄は同じ場所から吸引することができますが、好ましくは、新しい吸引を行う前に針は 5-10 の mm を進められます。できれば挿入レベルごとの以上 2 の引き分けを取られるべき。最初を表す数の増加とチューブをマークすることを確認、2 番目および/または連続を描画します。最も関連性の診断分析に最初のドローを使用する一般的なルールです。 - または、挿入場所から針を撤回し、骨髄腔元の挿入場所からが数ミリに再導入、手順を繰り返します。
注: は、重要な血液汚染を避けるため、プルあたり 1-2 mL 以上を吸い出してはいけない。 - 材料は、必要に応じて頻繁に繰り返します。特定臨床試験プロトコルのための十分な材料を吸気骨髄針を削除します。
注: 低速またはそうでなければ困難な骨髄の抱負の場合事前紅潮した抗凝固剤が注射器の使用役に立つかもしれません。乾燥のタップの場合この原稿の範囲外であるトレフィン生検を行います。
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塗抹標本の形態学的検査のための準備
- 最適な形態学的評価、時計ガラスの吸引から (例えばプラスチック製のヘラを使用して) スピキュールを選ぶし、スライド ガラスの上に置きます。
- 優しく骨髄を使用してスライドを別のスライド ガラスを配置し、ゆっくりスライドさせます。任意の圧力を避けます。
注: 非常に大きな骨髄スピキュールの場合にのみわずかな圧力が出されなければ、拡散セルの厚さを減少します。検体チューブを扱うことができるアシスタントからのヘルプからプロシージャの利点。患者数と多数のシーケンシャル骨髄描きチューブの正確なラベリングが重要です。 - スライドを徹底的に乾燥し、ギムザ グリューンヴァルトの可能性があります染色 (材料の表を参照) を行います。形態を顕微鏡下で調べます (図 1参照)。
注:図 1 aは、図 1 b中の異なる機能を細胞型主に白血病細胞を急性骨髄性白血病患者で構成される健康な骨髄塗抹標本を示しています。残留白血病負担の定義より、診療を実行する必要があります。
2. さらに処理するための物質の輸送
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サンプルの輸送のための準備
- 材料がリークが発生しないとチューブが壊れないことを確認するには、するために適切なパッケージを確保する (図 2参照)。
注: から私たちと細胞の生存率を経験その他骨髄が室温で保たれるときが最高の保存状態です。長期輸送のためこれは最高、輸送中に温度安定性を支援するため室温「ジェルパック」を使用して実現されます。 - パッケージのラベル、パッケージ、長時間輸送の損失を避けるために正しいフォームを追加または患者の切り替え。
注: これは、少なくとも含める必要があります: (フォーム 1) 患者データ。これは、研究数と一般的 '誕生日' を含める必要があります。受信側のラボに到着後、素材の権利処理に不可欠な具体的に要求された研究室解析 (分子診断、診療、MRD など) このフォーム上での明確な声明です。(様式 2)住所と電話番号連絡担当者と必要に応じて、税関の論文。メールでパッケージを失うことを避けるため、常に送信所がサンプルが送信された受信のラボを通知します。「トラックとトレース」使用をお勧めします。
- 材料がリークが発生しないとチューブが壊れないことを確認するには、するために適切なパッケージを確保する (図 2参照)。
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他の機関からのサンプルを受信
- 研究所で配信されるとすぐに研究室にサンプルを受信する研究所で適切な物流が設定されていることを確認します。
注: 最適な物流組織できれば中央研究所が必要なためは受信し、地元の診療所から、外部の病院から、すべての材料を収集します。特に、総合経営研究所と明確なコミュニケーションのためのプロトコルの割り当てが欠かせません。 - サンプルを受け取った後正確にハード コピー フォームおよび MRD ID トライアル固有 ID 番号、病院登録番号、生年月日、材料送信所などの重要なフィールドが含まれているセキュリティで保護されたデータベースの適切な番号メモします。種類 (骨髄または末梢血)、白血球数 (WBC)、骨髄穿刺の日付、計測の品質のサンプルとの発言関連の測定の日。
注: このデータベースは追加データを含む (またはその他のデータベースにリンクする) 装備されても好ましくは、分析結果とさらに患者データ フォロー アップ データなど。
- 研究所で配信されるとすぐに研究室にサンプルを受信する研究所で適切な物流が設定されていることを確認します。
3. 流れの Cytometer セットアップ
注: このセクションは、Euroflow 指示に基づいています。11
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FCS SSC パラメーターとターゲット蛍光チャネル用光電子増倍管 (PMT) 電圧の設定します。
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FCS SSC のパラメーターは流れの cytometer を起動し、」Cytometer セットアップと追跡 (CST)「CST ビーズ (材料表を参照) を流れの cytometer で実行を実行します。(セクション 4.1 で説明) 健康なドナーから赤血球を溶解させます。
- 新しいテストを作成 (メニューで: 新しい実験実験選択空白の実験) 製造元のソフトウェアを使用して (材料の表参照) 対脇散布 (SSC) ドット プロット FSC と SSC のパラメーターを設定するための前方散乱 (FSC)。この実験 FSC/SCC PMT 日付を名前します。まず現在の cytometer 設定を使用 (右クリック:「現在 CST を適用」)。これらの設定は、CST キャリブレーション ビーズ (材料の表を参照) を使用して CST パフォーマンス チェックで生成されています。「グローバルな実験設定」でリンパ球を視覚化する FSC と SSC を調整します。注: 私達の流れの cytometer でこれらは、285 V、400 V それぞれ。「有効にする補償」で確認: インスペクター/楽器設定/補償。
- セル (FSC) と粒度 (SSC) のサイズを評価するためにラベルのない測定を開始は、「セルを取得」関数によって末梢血細胞を分離。リンパ球と調整/微細 tune FSC と SSC 電圧ゲート リンパ球の人口の次の平均目標値に到達するためのゲート: FSC: 100,000 (105,000 95,000 の範囲);SSC: 15,000 (13,000 17,000 の範囲)。
- 取得し、少なくとも 10,000 のイベントを測定することによりデータを記録します。FSC の意味を確認し、SSC ゲート リンパ球のための目標値と、必要に応じて再調整します。
- ターゲット蛍光の設定チャンネル PMT 電圧 8 ピーク虹ビーズ キャリブレーション粒子 (物質の表を参照) を使用します。
- 7 ピーク FACS に新しいテストを作成します。すべての必要なドット プロットとワークシート「ターゲット平均蛍光の強度 (MFI)」を作成 (n = 2;SSC は、FITC と PE と FSC)、ヒストグラム (n = 各蛍光検出器のための 8; 1 つのヒストグラム) と各蛍光チャネルの参照ピーク値 (MFI と変動 (CV) 係数) を示す統計。
- DH ソリューションでビーズをミックスする2の O を優しく渦の 1 mL の虹ビーズの 1 滴 (± 60 μ L) を含む溶液を調製たて。
- 上から FSC/SSC 電圧および 5,000 のしきい値を持つ「低」流量 (記録) することがなく「取得」関数を使用して虹ビーズの蛍光測定開始の PMT の設定を使用します。門対 SSC ドット プロット fsc 一重項ビーズ人口 P1「長方形ゲート ボタン」を使用します。7thピーク - 対 PE ドット プロット FITC で人口 P2 のゲートします。
- ビーズを定める注釈付きの MFI ターゲット チャンネルによるとターゲットの MFI の値に到達するための蛍光管内 7 ピーク虹ビーズ懸濁液および調整/微細 tune PMT 電圧の買収を続けます。
- 約 10,000 のイベントのデータを収集し、7番目の MFI をチェックする「レコード」を使用してピーク ビーズ。必要な場合は、PMT 電圧を修正します。7番目のピークの MFI ターゲット値に達すると一度、PMT の最終的な値のファイルをレコード/上書き。
- PMT の最終的な値を保存し、製造元のソフトウェアのカタログに保存される日付と PMT セットアップ ファイルの名前します。以上各蛍光色素の流出を修正するためには、この PMT セットアップを使用します。
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FCS SSC のパラメーターは流れの cytometer を起動し、」Cytometer セットアップと追跡 (CST)「CST ビーズ (材料表を参照) を流れの cytometer で実行を実行します。(セクション 4.1 で説明) 健康なドナーから赤血球を溶解させます。
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蛍光補正設定
- 無染色のコントロールと各螢光色素共役抗体のための管のラベル (使用される螢光色素のテーブル S1 を参照)。各チューブにバッファーの 100 μ L をピペットします。
- 渦多色補償ビーズのバイアル (材料の表を参照) 徹底的にし、各チューブにこれらのビーズの 1 完全なドロップ (± 60 μ L) を追加。
注: は、各チューブにそれらを追加するとき、管の側面の下のビーズを滴下を避けてください。これはビーズを低濃度につながることができます、補償行列の結果に影響を与える可能性があります。 - 適切なボリュームが十分な蛍光色素標識された抗体の 1 つのテストの計算 (106細胞を染色するのに十分だろう)、ピペット対応する管と渦に徹底的に。無染色制御管に抗体を追加しないでください。常温 (RT) 暗闇の中で 15 〜 30 分間インキュベートします。
- 4 mL の洗浄バッファーを追加 (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)/0.05% azide-0.1% ひと血清アルブミン (HSA) (材料の表参照)) 各管に。300gチューブを遠心分離機の 10 分は、上澄みを除去し、各チューブに 0.2 mL の洗浄バッファーを追加することによってビード ペレットを再懸濁します。渦管徹底的に。
- 製造元の解析ソフトウェアを開く (材料の表参照) 新しいテストを作成し、(メニューで: 新しい実験実験選択空白の実験)、現在日付の補正ファイルとして名前を変更します。
- 「Cytometer 設定」に移動し、セクション 3.1 から PMT 設定を使用。5,000、FSC のしきい値は、使用されるすべての螢の補正値がゼロであることを必ずです。
- 必要に応じてラベル固有チューブを含む補正コントロールを作成します。無染色のコントロールを必ず入れてください。メニューから選択: 補正コントロールを作成する実験、補償セットアップ。
- 無染色コントロール チューブをロードし一重項ビーズ人口周り P1 ゲートを調整し、P1 ゲートに一重項ビーズだけが含まれていることを確認します。
- P1 ゲートを右クリックし、「適用をすべて補正コントロール」を選択します。すべての単一のラベルの付いた蛍光管用データを記録。P2 ゲート各蛍光ヒストグラムに肯定的な人口を包含するを確認します。場合は、ゲートを調整する必要があります。
- 補償金を計算します。選択実験、補償のセットアップは、賠償額を計算します。
- 補償の計算に失敗した場合は、エラー メッセージが表示されます。必要な調整を行い、再計算します。補償の計算が成功した報酬設定の名前の入力を求めるダイアログが表示されます。
- (例えば YY-MM-DD 8 色セットアップ) の名前を入力、クリックして、リンクおよび保存します。補償のセットアップは、補償セットアップ カタログに保存されます。
注: 同じの同時を使用してすべての実験の同じ設定を使用できます。
4. 流れフローサイトメトリー評価 (LAIP ・ LSC)
注: ここで我々 は WBC の最寄りの濃度を染色することができます染色前に一括溶解手順をについて説明します。ほとんどの MRD プロトコルは、いくつかは正常に溶解する前に染色などその他のオプションを使用しているがこの方法を使用します。全体の骨髄が溶解する前に染色優遇セル損失12を最小限に抑えられますが、予測不可能なあまりにも低濃度の欠点があります。
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セルの一括溶解
注意: 非操作サンプル水平常温では、フロー cytrometric 買収は、全体の手順に次の日を開始するために同じ日を実行できない場合。- サンプルを数回反転による同質性に抗凝固療法の骨髄サンプルを再懸濁します。細胞染色液 Tuerk とチャンバーを数えるセルを用いた骨髄細胞 (白血球数 (WBC)) の濃度 (材料の表を参照)。
- 別 15 mL チューブに骨髄の必要な量をピペットで移しなさい。細胞の量は染色の個別のチューブ; 数に依存1 染色 (1 つの管) LAIP 測定や LSC 管の測定 8 × 106白血球の約 2 × 106白血球細胞を使用します。
- 溶解のソリューションを追加することで赤血球を溶解 (材料の表を参照)。ソリューションを溶解の必要量は、細胞懸濁液の 10 倍の量をする必要があります。
- 優しく、逆解析による混合し、室温 10 分間インキュベート(例えば、真空ポンプやパスツール ピペット) 清 RT。 破棄で 7 分 800 g の遠心分離機します。リン酸緩衝生理食塩水で細胞ペレットを再懸濁します (PBS)/0.05% azide-0.1% ひと血清アルブミン (HSA) (材料の表参照) 使用したチューブの最大の音量で。
- 室温 7 分 800 g の遠心(真空ポンプまたはパスツール ピペット) などで上澄みを廃棄します。再 PBS/0.05% azide-0.1% HSA 100 × 106 WBC/mL の細胞濃度で細胞ペレットを中断し、意図したチューブの数を除算します。
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フローサイトメトリー用の細胞の染色
- ピペット モノクローナル抗体 (MoAb) カクテル ソリューションは、適切な蛍光活性化細胞選別機 (FACS) チューブにミックスし、暗闇の中で 15 分間分離骨髄細胞で孵化させなさい。
注: これはタンデム染料が使用されるとき非常に重要です。たとえば、標準研究室 (テーブル S1) で使用されるパネルのミックスを参照してください。 - 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% セルは洗ってください。400gで 5 分間細胞を遠心します。(例えば、真空ポンプやパスツール ピペット) 清と 300 μ L PBS/0.05% azide-0.1%HSA の細胞ペレットを再懸濁します破棄します。
- LSC 測定: 400 μ L PBS/0.05% azide-0.1% HSA で細胞ペレットを再懸濁し、空白のビーズの 4 μ L を追加 (例: Spherotech、材料の表を参照してください) 陰性対照の人口分析として使用します。
- MRD または LSC 実験レイ-を開く、FACS に (材料の表参照) の MRD 少なくとも 100,000 WBC 測定ゲートの診断で 1 × 106 WBC フォロー アップでのサンプリングが急性骨髄性白血病の急性骨髄性白血病患者のサンプルの測定イベントと。LSC の実験は少なくとも 4 × 106 WBC 診断と信頼性の高い LSC 結果のフォロー アップの両方を測定します。
- 結果の分析のための標準化された適切なファイル名を使用してデータを保存します。急性骨髄性白血病細胞と急性骨髄性白血病幹細胞 (正、負、上/下式) の異なる測定マーカーの目録を作り、実験室ジャーナルにこれらのデータを格納します。
- LAIP 利用可能な診断がない場合に、あらゆる可能な測定可能な LAIP 可能性があります異なるから通常の方法で識別することを確認するフォロー アップですべての 4 つの管を測定します。
- 診断で最も信頼性の高い LAIP(s)13を選択し、可能な限りできるだけ多くのイベントを取得が、> 最小番号が定義されています。
- ピペット モノクローナル抗体 (MoAb) カクテル ソリューションは、適切な蛍光活性化細胞選別機 (FACS) チューブにミックスし、暗闇の中で 15 分間分離骨髄細胞で孵化させなさい。
5. 白血病関連免疫表現型 (LAIP) の同定: 異なる細胞集団の解析
注: (材料の表参照) の異なる細胞集団の最適な可視化のためのいくつかのソフトウェア プログラムを FCS ファイルを分析できます。
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白血球細胞の人口
- ゲート CD45 陽性細胞および、FSC/SSC プロット; 内低 FSC (非実行可能なセル、赤芽球系細胞) を残しての現われる生菌WBC (図 3 a私) が含まれます。WBC を表示し、(たとえば CD34;プリミティブのマーカーの 1 つを使用図 3Aii) ・ デ ・ CD45dim 地区 (図 3 aiii) 爆発の最終的な位置を確認するために。
- CD45dim 細胞をゲートし、戻ってゲート (図 3B私) FSC/SSC プロット内のセル。% 細胞がこの門でプログラムの人口ツリー % 爆発を報告している間 (図 3Bii) CD34 ゲートを削除します。SSC/CD34 で爆発プロットおよび CD34 陽性細胞 (図 3Biii) をゲートを表示します。
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リンパ球
- 内部統制としてリンパ球を使用: 陰性対照および肯定的な制御としてリンパ球集団として骨髄性集団。
- 白血細胞 (図 4 a) から開始します。CD45 の高い/SSC低の人口 (図 4 b) としてゲート リンパ球。
- CD13 負/CD33 陰性細胞 (図 4C E) の CD34、CD117、CD13、CD33、ゲートを用いたゲートで骨髄系細胞がないことを確認してください。人口ツリー (図 4 階) でこの人口 '球' を呼び出します。
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診断 LAIP
- ゲートの爆発とその後 SSC/cd34 陽性の CD34 陽性細胞をプロットし、人口ツリーのこれらの 'プリミティブ マーカー' を呼び出します。
- この場合 CD34 陽性のリンパ球の新しいプロットで、原始的な細胞を骨髄系マーカー (CD33) に対するリンパ球のマーカー (CD7) とプロットします。ゲートの異常な人口 (ガイドライン補足ファイル 1 を参照)、人口ツリーで 'LAIP 肯定的な' を呼び出します。
注: 最後の LAIP を選択は、爆発の人口の %laip として報告されます。感度、特異性、安定性、LAIPs の MRD 測定で、十分な経験を持つ担当者だけで確立できます。これらのパラメーターの合計は、LAIP の品質を決定します。診断の 4 つの異なる LAIP 評価の例としては、図 5 A Dで与えられます。 - LAIPs (爆発の %) の発現を決定やデータベースにこれらのデータを保持する excel ファイルです。
- FACS 解析のレポートおよび MRD 測定で使用されなければならない LAIPs のノートを作る。
注: をフォローで正確な MRD 測定にとって不可欠な機能ですので、LAIPs の定義は専門家のチームで承認されます。
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フォロー アップで MRD
- 説明 5.1 時間ポイントによって治療後に爆発をゲートします。この門の正確な評価は困難な可能性があります。診断に設立された LAIP の表現型に注目し、未熟な人口をゲートします。
- 5.1 に記述されています。見つける正しいブラスト ゲートに基づいて定義された aberrancy とゲートのそれらをするために骨髄や通常の表現を再生成するのに注意してください。
- すべてのフォロー アップのポイント戦略をゲートと同じことを繰り返すし、全白血球細胞人口の LAIP 細胞のパーセンテージとして MRD を決定します。図 6Aおよび6Bの例についてを参照してください。
- MRD の % が ≥ MRD 陽性を報告、白血球細胞の 0.1%。MRD チーム相談毎週標準的な形式で解析したデータを印刷します。合意に達した後は、結果を登録します。結果を臨床医に通信する前に、スーパーバイザーによって承認される結果をみましょう。
6. 幹細胞 MRD (LSC 単管)14の解析
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診断と経過観察に LSC の解析
- セクション 5.1 で説明したブラスト細胞のゲートします。
- CD38-潜在的なネガティブ コントロールとして赤血球画分 (すなわち赤い血液細胞換散、SSC低/FSC低と CD45陰性として特徴付けられる後に残り) をゲートします。必要に応じて、死んだ細胞や細胞断片がこの陰謀に余分なゲートで除外できます。
- 白血病ブラスト ゲート内 CD34 の式を持つ個体を決定します。この人口 CD34 内で select+ CD38-細胞 (カットオフとして使用: 空白キャリブレーション ビーズ閾値決定のための上部のボーダー (材料の表を参照)、赤分数または使用 10 カットオフ ポイントとして3 )。この人口 'CD38低前駆' を呼び出します (図 7)。
注: 設定について補足のファイル 1 を参照してください CD38-遮断レベル。 - 人口を決定この CD38低人口内真 cd 34 + CD38非常に低い幹細胞、赤の端数、空白キャリブレーション ビーズの下端の中央値を使用または 10 を選択2カットオフ ポイント (図 7).CD38-遮断レベルの設定の詳細については、補足のファイル 1 を参照してください。
- パネルで提供されている各白血病のマーカーを分析することによって通常の造血幹細胞 (LSC 対 HSC) 対白血病幹細胞をゲート両方の人口の内で (すなわち CD45RA コンビ 6 (CLEC12A、CD56 PE ですべて、CD22 CD11b CD7 ティム 3)、CD44、CD33 CD123)。
- その他の幹細胞マーカー陽性/陰性陽性/陰性の他のマーカーとを比較して HSC 周波数対 LSC を微調整すると興味の幹細胞のマーカーをプロットします。
- 未熟な芽球、リンパ球、CD34 陽性細胞の割合を報告します。すべての個別のマーカー CD38低と CD38、極めて小さい数の合計と肯定的な (およびこうして腫瘍) のマーカーである CD38低と CD38、極めて小さい番号をリストします。
- さらなる分析のための白血病幹細胞と正常の造血幹細胞を最高区別マーカーを選択します。合計 WBC の割合として LSC と HSC の割合を計算します。
注: カットオフはフォロー アップで 0.0001%、LSC ≥ 0.004% の割合が LSC 診断で陽性として報告をされます。フォロー アップのサンプルでゲート異常の幹細胞は、診断、しかし、茎セル人口の細胞数することができます非常に小さな分析に似ています。それゆえ十分なイベントを取得する必要性。
Representative Results
急性骨髄性白血病患者の 90% に少なくとも 1 つの LAIP を識別できます。LAIP + 診断で原始的なブラスト細胞の細胞の正確な割合を生成するために、ブラスト ゲートの適切な設定は図 3の可視化としての検証が必要、欠かせません。Aberrancy プリミティブ CD34 陽性細胞上の特定の種類を抱いてそれぞれの患者の例を図 5に可視化します。によるフォロー アップ時の MRD の計測、以前定義された LAIP + セル ゲートして WBC の LAIP + 細胞の割合として定義します。このゲートの設定右の MRD の結果を達成することが重要です。図 6は、誘導療法の 2 番目のサイクル後完全寛解は、患者と MRD の肯定的な結果 (≥ 0.1%) をした後再発患者を示します。
現在のプロトコルは、この区画の徹底した特性 CD38 人口港湾分数のような最も強力な幹細胞であることを示しているので、CD34 陽性細胞、幹細胞を定義に適していますのみ。この分数内 HSC から LSC を分離するために追加のマーカーが使用されます。LSC を区別するためにほとんどの場合選択したマーカーは CD45RA と PE の付いた 6 特定 LSC のマーカーをかくまっているコンビ チャネルです。さらに臨床的評価に基づき、≥ 0.004% のカットオフ レベルとして定義されて LSC 正、0.0001% のカットオフ レベル継続調査10で使われていた診断で悪化の生存と関連していた。
図 1:骨髄塗抹します。A) 健康なドナーと患者 B) 急性骨髄性白血病 (FAB 5 サブタイプ)。ギムザ染色の 100 倍の倍率で表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 体液の包装材料を修正します。疾病管理・予防センターのウェブサイト15規則および規制の体液の輸送に関する詳細を見つけることが。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 爆発のセルを定義するための戦略をゲーティングします。A) CD45dim、B ゲート) ゲート cd34 爆発します。
図 4: リンパ球をゲーティングします。A) 青色のセルは WBC B) 緑の細胞がリンパ球 CD45高/SSC低、C によって特徴付けられる FSC/SSC プロットで示されて) CD34、D) CD117 と E)、CD13 の否定の否定のための否定的な例 F) 異なった細胞のタイプを示しますが、概要人口ツリー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 急性骨髄性白血病の診断で LAIPs です。A) LAIP に基づいて系統 aberrancy クロス (CD7 CD33 発現細胞)、B) LAIP は、非同期の分化に基づく (CD13 発現細胞の CD11b)、C) LAIP (CD34 で非常に高いCD13 発現細胞)、正常な細胞に比べて過剰発現に基づく D)。LAIP は、underexpression (HLA)、低CD33 の発現細胞の正常な細胞と比較してに基づいています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: LAIP 続いて療法中。診断で A) LAIP 定義 (CD34 + CD13 + CD33-) と連続完全寛解、診断で B) LAIP 定義に残った患者のフォロー アップ中に LAIP の損失 (CD117 + CD7 + CD33 +) と LAIP の患者のフォロー アップ中に永続性人再発。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 幹細胞のゲーティングします。異なる cd34 陽性) のゲーティング + ビーズ (CD38非常に低いLSC を表す真の否定的な細胞として定義され、ビーズの中央下にある中、ビーズの上部のボーダー以下は CD38低)、に基づいて B) 2 CD38 集団CD45RAnegと CD45RApos式に基づいてフォロー アップで HSC と LSC の区別の患者の例です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
十分なデータは、貧しい人々 の生存に関連付けられている MRD 陽性のための証拠を示す利用可能な MRD の評価、時に臨床の意思決定を行うことができます追加の予後に関する情報を提供することにより患者の転帰を改善するため。したがって、一貫性のある、調和のとれた MRD の免疫表現型の評価法は最終的に患者の治療を改善するために不可欠です。異なる臨床サイト間で臨床研究を比較するときこれも重要です、可能性があります最終的に臨床に役立つ意志決定と生存のサロゲートの臨床的エンドポイントとして提供します。確固たる指針が正確かつ一貫した MRD 測定保証されます概念は、最先端のデザイン ガイドライン ヨーロッパ白血病ネットワーク (ELN) の協調行動につながっています。この包括的な文書公開後半 ~ 2017 年になります、多くの研究グループと研究所の前進のために尽力されます。
プロトコルの中で重要なステップ
MRD の分析の重要な頻繁に見落された面は、MRD の正確な定量における試料の品質の影響です。これは、素材はこの設定で考慮する必要がある追加の操作上の注意を与えられたグローバルな臨床試験で他の機関に運ばれるより明らかです。患者は、混同のリスクを軽減するには、情報とサンプルの適切な管理のタイムリーな配信は欠かせません。もう一度、輸送のこの段階で正しいフォームおよび/または要求された分析の割り当てのクリアと電子病院システムへのインポートが必要です。MRD サンプリングの療法でステージを指摘し (たとえば後療法の第 2 コース) 臨床的意思決定に関連することがあるためにも重要です、したがって明確に定義する必要があります。モック データ (例えば 1 月 1 日出生の年間) などの使用患者や分析は、混同のリスクが高まります。法律によって要求された場合、匿名識別の方法を使わなければなりません。
診療のすべての標本コレクションの 24 h 内で優先的に処理されます。ない recommendable、骨髄および末梢血サンプルまだ処理および分析できる周囲温度で 72 h を続けたとき。さらに、材料をすべて処理最高実行できます無菌条件の下で (ローカル) バイオバンクの細胞のそれ以上の凍結保存も依然、: 多くの臨床研究がある白血病細胞をさらに調査の追加分析尊敬する分子、免疫表現型と後の段階で実行する機能。しかし biobanking の詳細は本稿の範囲を超えています。
MRD を診断ツールとして使用して、フローサイトメトリー用のみならず、MRD 評価の品質管理についても、公認の実験室が必要がありますを意味します。これは特定の参照実験室または (再) 参照チームによる MRD 測定フロー ファイルの分析のサンプルを配布する必要があります。
骨髄吸引コレクションから効果的な責任、特定のタスクとの頻繁なコミュニケーションの専門家のチーム全体を必要とする臨床サンプルの MRD の決定への最も重要なアクションについて説明します評価と解析。各タスクの手順に重要なので、各研究所と十分なバックアップ人員はタスクの特に訓練されたプロトコルを含む音の物流にそれをお勧めします。さらに、プロシージャ (特に LAIP と LSC 異常マーカーの識別) の一部にいくつかの比較的主観的な手順なのでそれはチームによって最終的な結果についての議論を有しのチームによって承認された最終報告書に不可欠です監督者。現在の取り組みは、(LAIP と LSC) MRD 分析の標準化に役立つコンピュータ ソフトウェアの開発を追求しています。
変更とトラブルシューティング
各演習は MRD 測定文書に対する今回の ELN 最先端のガイドラインに記載されている同等の結果を得るには、不可欠ですマーカーの標準化されたバックボーンを持つが、異なる集団を定義するために使用できる抗体の独自のセットを持つことができます。上記に呼ばれます。関係なく選択したマーカーの結果の分析を難しくことができ、考慮する必要がありますいくつかの問題があるのです。
技術の限界
LAIP と LSC の異常マーカー発現の識別まず診断で評価、MRD 表現型の正確な特性評価 (中および治療後) の時間にわたって監視します。まだ何人かの患者ない定義された LAIPs またはなしの cd 34 + CD38-LSCs がある CD34 陰性の爆発で提示または行方不明の診断サンプルを持っている以上、患者の 95% は、LAIP または LSC (またはその両方) で評価できる中、。 これらのケースでそれはまだしようとする使用できるセル数ができ、最も信頼性の高いの (与える) の白血病細胞の最も強い区別を選択とは違った抗体のパネルと MRD を測定価値がある LAIP。検討して最終的に再発を行う患者の割合診断イムノフェノ タイプの急性骨髄性白血病の病気の多様性により、完全に似ていないことをとにかく推奨は MRD で抗体の広いパネルを測定します。これらの肺浸潤シフトがブラスト細胞 LSCs など療法16の間に発生することが示されているし、測定可能な病気は、これらのいわゆる今後人口に基づいて可能性があります。この時点でしかし、それ決定されていないかどうかすべての肺浸潤サブ集団は病気の再発につながるし、したがって臨床試験のこれらのセルに基づく MRD 調整療法を報告する一般的なないです。1 つの管のアプローチでは最も重要な aberrancy 定義するマーカーが 1 つフローサイトメトリー (PE) チャンネルは14LSC 人口転位のために行方不明者のリスクを軽減するに注意してくださいすることが重要です。
既存のメソッドの意義
このプロトコルで説明する方法は、どの細胞が治療中に続いている 1 つまたは複数の LAIPs の定義に依存します。この方法の欠点は、それが表示されたこと最近、LAIP 療法の間に変わるかもしれないことです。このように異なる異常マーカーといくつかの今後の集団を見逃す可能性があります。これを回避するには、最高の診断で見つけたものだけでなくすべての異常なマーカーを測定することです。これはいくつかの研究所17によって使用される「普段と違う」の手法と同様になります。
将来のアプリケーション
最近では、MRD は新規臨床試験デザインの特別な注意を受けています。MRD のアウトカム指標としての使用、専門的な治療オプションとターゲットを絞った薬物療法の時代に最終的に許可の高速の導入急務治療、新しい治療法の臨床効果を確立するために必要な時間が短縮されます。診療所にオプション。適切な物流の重要性と調和の MRD 評価の実用的な実行 FDA は現在、全生存期間ではなく代理エンドポイントとして MRD を使用しての可能性を調査中です、将来の急性骨髄性白血病の治療の成功に重大であります。18を測定します。
Disclosures
いくつかの独立した協会の幹細胞管の検証に使用される抗体カクテルは、BD によって提供された親切。著者が本稿に関連して開示する何もありません。
Acknowledgments
この研究は、フォンクのオランダのがん学会 (アルペ 2013年-6371) と Egbers 財団によってサポートされています。コラボレーションのオランダ急性骨髄性白血病-MRD ワーキング グループと継続的な改善と AML MRD の標準化のための有意義な議論に感謝します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Biosciences | 120995496,060996589 and 013729 | FACS Canto II | |
| BD Biosciences | 555360 | CD7 FITC | |
| DAKO | F076701 | CD2 FITC | |
| Sanquin | M1613 | CD36 FITC | |
| BD Biosciences | 332778 | CD15 FITC | |
| BD Biosciences | 335039 | CD45RA FITC | |
| BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
| BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
| BD Biosciences | 345785 | CD14 PE | |
| Miltenyi Biotec | 130-080-801 | CD133 PE | |
| BD Biosciences | 562566 | Clec12a PE | |
| BD Biosciences | 565568 | Tim-3 PE | |
| BD Biosciences | 332774 | CD7 PE | |
| BD Biosciences | 333142 | CD11b PE | |
| BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
| BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
| BD Biosciences | 347222 | CD34 PERCP-CY5.5 | |
| BD Biosciences | 558714 | CD123 PERCP-CY5.5 | |
| Beckman Coulter | B49221 | CD117 PE-CY7 | |
| BD Biosciences | 562854 | CD33 BV421 | |
| BD Biosciences | 345791 | CD19 APC | |
| BD Biosciences | 333143 | CD11b APC | |
| BD Biosciences | 345800 | CD33 APC | |
| BD Biosciences | 345807 | CD38 APC | |
| BD Biosciences | 641411 | HLA-DR APC-H7 | |
| BD Biosciences | 560532 | CD44 APC-H7 | |
| BD Biosciences | 562596 | CD13 BV421 | |
| BD Biosciences | 348811 | CD34 PE-CY7 | |
| Beckman Coulter | A96416 | CD45 Krome Orange | |
| BD Biosciences | 655873 | CD45 HV500c | |
| BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
| BD Biosciences | 555899 | Pharm lysing solution | |
| BD Biosciences | 644204 | Multicolor CompBeads | |
| BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
| BD Biosciences | FACSDiva software | ||
| Cytognos | Infinicyt | ||
| Spherotech | Euroflow RCP-30-5a | ||
| Sigma-Aldrich | Tuerk solution | ||
| Spherotech | BCP-100-5 | Blank Calibration Particles Beads | |
| HSA | |||
| Azide | |||
| ddH2O |
References
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