Summary
Um protocolo é apresentado para a síntese de nanocristais de núcleo-casca dopado com lantanídeos upconversion (UCNs) e seus aplicativos de celulares para regulamento de proteína canal sobre iluminação de infravermelho próximo (NIR).
Abstract
Nanocristais dopado com lantanídeos upconversion (UCNs) têm atraído muita atenção nos últimos anos, com base em suas propriedades ópticas promissoras e controláveis, que permitem a absorção de luz de infravermelho próximo (NIR) e posteriormente podem convertê-lo em multiplexados de emissões que se estendem sobre uma escala larga das regiões de UV para o visível para o NIR. Este artigo apresenta detalhados procedimentos experimentais para a síntese de co-precipitação de alta temperatura de núcleo-casca UCNs que incorporar íons lantanídeos diferentes em nanocristais para converter eficientemente a excitação de NIR penetrável de tecidos profundos (808 nm) em uma forte emissão azul em 480 nm. Controlando a modificação da superfície com polímero biocompatível (ácido poliacrílico, PAA), os preparado como UCNs adquire grande solubilidade em soluções tampão. Os nanocristais hidrofílicos são ainda mais acrescidas com ligantes específicos (cyclooctyne, dibenzyl, DBCO) para a localização na membrana celular. A luz NIR (808 nm) a irradiação, a emissão de upconverted azul pode efetivamente ativar a proteína de canais dependentes de luz sobre a membrana celular e regulam especificamente o influxo de cátion (por exemplo, Ca2 +) no citoplasma. Este protocolo fornece uma metodologia viável para a síntese de núcleo-casca dopado com lantanídeos UCNs e subsequente modificação da superfície biocompatível para mais aplicativos de celulares.
Introduction
Nos últimos anos, nanocristais dopado com lantanídeos upconversion (UCNs) têm sido amplamente utilizados como uma alternativa aos corantes orgânicos convencionais e pontos quânticos em aplicações biomédicas, que se baseiam principalmente na sua excelente química e propriedades ópticas, incluindo o excelente biocompatibilidade, alta resistência ao fotobranqueamento e largura de banda estreita de emissão1,2,3. Mais importante, eles podem servir como um promissor nanotransducer com tecido excelente penetração profundidade na vivo para converter a excitação de infravermelho próximo (NIR) para uma ampla gama de emissões de UV, visível e as regiões NIR através de um fóton multi upconversion processo4,5. Essas propriedades exclusivas faça dopado com lantanídeos UCNs servir como um vetor particularmente promissor para detecção biológica, imagem biomédica e doenças theranostics6,7,8.
Os componentes gerais de UCNs baseiam-se principalmente sobre os íons lantanídeos dopados na matriz isolante de host contendo um sensibilizador (por exemplo, Yb3 +,3 +Nd) e um ativador (por exemplo, Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) dentro do cristal homogeneamente9. A emissão ótica diferente dos nanocristais é atribuída à transição eletrônica localizada dentro os 4 orbitaisf dos dopantes lantanídios devido a sua escada, como arranjado energia nível10. Portanto, é fundamental para controlar com precisão o tamanho e morfologia de UCNs sintetizados com dopantes multicomponente lantanídeos. Por certo, alguns métodos promissores foram bem estabelecidos para a preparação de UCNs dopado com lantanídeos, incluindo a decomposição térmica de alta temperatura co-precipitação, síntese hidrotermal, processamento sol-gel, etc.11 , 12 , 13 entre essas abordagens, o método de co-precipitação de alta temperatura é uma das estratégias mais populares e convenientes para a síntese de UCNs, que pode ser estritamente controlada para preparar desejado nanocristais de alta qualidade com forma uniforme e distribuição de tamanho em um relativamente curto tempo de reação e de baixo custo14. No entanto, maioria das nanoestruturas sintetizadas por esse método são principalmente tampadas com ligantes hidrofóbicas, tais como o ácido oleico e oleylamine, que geralmente dificultam sua bioapplication mais devido o limitada de solubilidade de ligante hidrofóbicas em solução aquosa 15. portanto, é necessário executar técnicas de modificação de superfície adequado para preparar UCNs biocompatíveis em aplicações biológicas in vitro e em vivo.
Aqui, apresentamos o procedimento experimental detalhado para a síntese de nanoestruturas de UCNs núcleo-casca através do método de co-precipitação de alta temperatura e uma técnica de modificação viável para funcionalizar polímero biocompatível na superfície de UCNs mais aplicativos de celulares. Este nanoplatform de UCNs incorpora três íons lantanídeos (Yb3 +3 +Nd e Tm3 +) na nanocristais de adquirir forte emissão azul (~ 480 nm) após excitação luz de NIR em 808 nm, que tem maior profundidade de penetração no tecido vivo. É sabido que Nd3 +-UCNs dopados exibir efeitos de absorção e superaquecimento de água minimizado na janela espectral (808 nm) em comparação com UCNs convencionais em cima de 980 nm irradiação16,17, 18. Além disso, para utilizar os UCNs em sistemas biológicos, os ligantes hidrofóbicos (ácido oleico) na superfície de UCNs em primeiro lugar são removidos pelo sonication em solução ácida19. Então os ligante livre UCNs são modificados com um polímero biocompatível (ácido poliacrílico, PAA) para adquirir grande solubilidade em soluções aquosas de20. Além disso, como um prova de conceito em aplicativos de celulares, os UCNs hidrofílicos são ainda mais acrescidas com ligantes moleculares (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) para uma localização específica no N3-com a tag da membrana celular. A luz NIR (808 nm) irradiação, a emissão de upconverted azul em 480 nm pode efetivamente ativar uma proteína canal dependentes de luz, channelrhodopsins-2 (ChR2), na superfície de células e, assim, facilitar o afluxo de cátion (por exemplo, íon de Ca2 + ) através da membrana das células vivas.
Este protocolo de vídeo fornece uma metodologia viável para síntese de UCNs dopado com lantanídeos, modificação da superfície biocompatível e UCNs bioapplication em células vivas. Quaisquer diferenças nas técnicas de síntese e reagentes químicos usados no crescimento de nanocrystal influenciará os espectros tamanho distribuição, morfologia e upconversion luminescência (UCL) de nanoestruturas de UCNs finais usados em experimentos de célula. Este protocolo detalhado vídeo está disposto a ajudar novos pesquisadores neste campo para melhorar a reprodutibilidade de UCNs com o método de co-precipitação de alta temperatura e evitar os erros mais comuns na modificação da superfície UCNs biocompatível para mais aplicativos de celulares.
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Protocol
atenção: favor consultar todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar a síntese de UCNs em alta temperatura (~ 290 ° C), incluindo o uso de controles de engenharia (coifa) e equipamentos de proteção individual (por exemplo, óculos de segurança, luvas, jaleco, comprimento total de calças e sapatos fechados).
1. síntese de NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristais de núcleo-casca de Nd(20%)
- síntese de NaYF 4: nanostructure de núcleo Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)
- Preparação do RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F metanol solução
Nota: as terras raras (RE) íons lantanídeos incluem o ítrio (Y), itérbio (Yb), Thulium (Tm) e neodímio (Nd).- Dissolver 500 mg de acetato de Yttrium(III) hidratar em 5 mL de metanol (100mg/mL), hidrato de acetato de itérbio (III) em 5 mL de metanol (50 mg/mL), 10 mg de hidrato de acetato de Thulium (III) em 1 mL de metanol (10 mg/mL), de 250 mg e 10 mg de hidrato de acetato de neodímio (III) em 1ml metha Nol (10 mg/mL) em frascos de vidro com um banho de limpeza ultra-sônica de 2 min.
- Combinar 400 mg NaOH num tubo de centrífuga de 50 mL com 20 mL de metanol com banho de limpeza ultra-sônico para preparar solução NaOH (20 mg/mL).
- Combinar 600mg NH 4 F em um tubo de centrífuga de 50 mL com 30 mL de metanol com banho de limpeza ultra-sônico para preparar solução NH (20 mg/mL) 4 F.
Nota: Coloque a solução de complexos de lantanídeos, NaOH e NH 4 F em frascos de vidro, selar com parafilm e armazená-los no frigorífico, a ~ o 4 ° C até ser necessário. As soluções estoque preparado metanol são substituídas uma vez cada 2 semanas.
- De preparação de NaYF 4: Yb/Tm/Nd núcleo nanostructure
- Pipetar 3 mL de ácido oleico e 7 mL de 1-octadecene para um balão de três-pescoço de 50 mL. Solução de
- combinar 1.089 mL da solução estoque de Y (CH 3 CO 2) 3, 0,608 mL da solução estoque de Yb (CH 3 CO 2) 3, 83,6 µ l do estoque 3 Tm (CH 3 CO 2), e 128.5 µ l da solução estoque 3 Nd (CH 3 CO 2) para o balão de.
- Caber um termômetro (escala de 0 - 360 ° C) no frasco e deixe que sua ponta toque a solução. Coloque o frasco em um recipiente de vidro com óleo de silicone fenilmetil.
- Aquecer a solução a 100 ° C, com uma chapa quente para evaporar fora o metanol. Ligar o balão a uma linha de Schlenk com um colector de duplo vácuo/gás para remover o metanol residual e manter a mistura de reação sob vácuo durante 2-3 min, agitando.
- Aumentar a temperatura para 150 ° C e manter esta temperatura de 60 min. manter uma velocidade de agita de 700 rpm durante a síntese.
Nota: Defina uma moderada velocidade de agitação para evitar salpicos solução. - Parar o prato quente e manter o frasco em temperatura ambiente para permitir que a solução esfriar lentamente.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
Solução - combinar 2 mL de NaOH-metanol e 2,965 mL de NH 4 solução F-metanol em um tubo de centrífuga de 15 mL. Aperte o tubo com a tampa e misture a solução vortexing poderoso para 5 s.
- Adicionar a mistura de F NaOH-NH 4 lentamente para o balão por uma pipeta de vidro mais 5 min.
- Aumentar a temperatura da mistura para 50 ° C e manter esta temperatura por 30 min.
Nota: Definir a temperatura a não mais de 50 ° C, porque a alta temperatura irá promover a nucleação de cristais e crescimento. - Aumentar a temperatura (~ 100 ° C) para evaporar fora do metanol e ligar o balão para uma linha de Schlenk com um colector de duplo vácuo/gás para remover o metanol residual e manter a mistura de reação sob vácuo durante 2-3 min.
- Mudar a posição da torneira para encher o balão com nitrogênio.
- Aumento da temperatura a 290 ° C, a uma taxa de aquecimento de ~ 5 ° C/min. manter a mistura de reação a 290 ° C por 1,5 h.
- Parar o prato quente e retirar o frasco para permitir a mistura reacional esfriar em temperatura ambiente, agitando lentamente.
Cuidado: Tenha cuidado com a chapa com alta temperatura (> 400 ° C) para evitar queimaduras graves em contato com a pele. - Transferir a mistura no frasco para um tubo de centrífuga de 50 mL. Lavar o balão com 30 mL de etanol e transferir a solução para o tubo de centrifugação.
- o produto a 4.000 × g por 8 min à temperatura de centrifugação e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 10 mL de hexano para o tubo de centrifugação e re-dispersar o produto com sonication (60 kHz, 240 W) 2 min. Adicionar 30 mL de etanol ao tubo de
- . Spin para baixo o produto a 4.000 × g por 8 min e em seguida, descartar o sobrenadante.
- Re-dispersar os produtos sólidos no fundo do tubo de centrífuga com 5 mL de hexano. Armazenar a solução no frigorífico, a ~ o 4 ° C para um próximo passo.
Nota: A emissão de upconversion de núcleo-casca UCNs é testada por irradiar as soluções com um laser de 808 nm (2 W).
- Preparação do RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F metanol solução
- De preparação de NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristais de núcleo-casca de Nd(20%)
- combinar 3 mL de ácido oleico e 7 mL de 1-octadecene em um frasco de 50 mL 3-pescoço. Adicionar 1,082 mL da solução-mãe Y (CH 3 CO 2) 3 e 2,87 mL da solução-mãe Nd (CH 3 CO 2) 3 para o balão de.
- Adicionar o núcleo obtidos nanostructure (80 mg em 5 mL de hexano da etapa 1.1.2.18) para o balão, agitando.
- Caber um termômetro (escala de 0 - 360 ° C) no frasco e deixe que sua ponta toque a mistura. Coloque o frasco em um recipiente de vidro com óleo de silicone fenilmetil.
- Aquecer a mistura a 100 ° C no topo da placa de quente para evaporar o metanol e hexano. Ligar o balão a uma linha de Schlenk com um colector de duplo vácuo/gás para remover o solvente residual e manter a mistura de reação sob vácuo durante 2-3 min, agitando.
- Aumentar a temperatura para 150 ° C e mantê-lo por 60 min. manter a velocidade de agita a 700 rpm na síntese.
Nota: Defina uma moderada velocidade de agitação para evitar salpicos solução. - Parar o prato quente e retirar o frasco para deixar a solução arrefecer lentamente à temperatura ambiente.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
Solução - pipeta 2 mL de NaOH-metanol e 2,965 mL de NH 4 solução F-metanol em um tubo de centrífuga de 15 mL. Aperte o tubo com a tampa e misture a solução vortexing poderoso para 5 s.
- Adicionar a mistura para o balão por uma pipeta de vidro lentamente mais 5 min.
- Aumentar a temperatura da mistura para 50 ° C e mantê-lo a 50 ° C por 30 min.
Nota: Definir a temperatura não superior a 50 ° C, porque a alta temperatura irá promover a nucleação de cristais e crescimento. - Aumentar a temperatura (~ 100 ° C) para evaporar fora do metanol e ligar o balão para uma linha de Schlenk com um colector de duplo vácuo/gás para remover o metanol residual, mantendo a mistura de reação sob vácuo durante 2-3 min.
- Mudar a posição da torneira para encher o balão com nitrogênio.
- Aumentar a temperatura para 290 ° C a uma taxa de aquecimento de ~ 5 ° C/min. manter a mistura de reação a 290 ° C por 1,5 h.
- Parar o prato quente e retirar o frasco para permitir a mistura reacional esfriar lentamente à temperatura ambiente, mexendo em.
Cuidado: Tenha cuidado com a chapa com alta temperatura (> 400 ° C) para evitar queimaduras graves em contato com a pele. - Transferir a mistura no frasco para um tubo de centrífuga de 50 mL. Lavar o balão com 30 mL de etanol e transferir a solução para o tubo de centrifugação.
- o produto a 4.000 × g por 8 min à temperatura de centrifugação e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 10 mL de hexano para o tubo de centrifugação e re-dispersar o produto com sonication (60 kHz, 240 W) 2 min. Adicionar 30 mL de etanol ao tubo de
- . Spin para baixo o produto a 4.000 × g por 8 min e em seguida, descartar o sobrenadante.
- Re-dispersar os produtos sólidos no fundo do tubo de centrífuga com 5 mL de hexano. Armazenar a solução no frigorífico, a ~ o 4 ° C até ser necessário.
Nota: A emissão de upconversion de núcleo-casca UCNs é testada por irradiar as soluções com um laser de 808 nm (2 W).
2. Síntese de nanoestruturas de UCNs biocompatível
- preparação de nanopartículas de UCNs ligand-free
- combinar 30 mL de etanol com a preparado como oleato-tampado UCNs solução (etapa 1.2.18) num tubo de centrífuga de 50 mL. Centrifugue a mistura a 4.000 × g por 8 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
- Combinar 10 mL de solução aquosa ácido (pH = 4) ajustado pelo HCl (0,1 M) com o precipitado no tubo de centrífuga de 50 mL e dissolver o precipitado pelo sonication (60 kHz, 240 W) por 30 min.
- Transferência a solução em um vidro frasco com vigorosa agitação por 2 h.
- Extrair a solução aquosa com 30 mL de éter dietílico para remover o ácido oleico, repetir três vezes.
- Adicionar 10 mL de água nas camadas de éter combinada com agitação suave.
- Recolher o aquosa fase juntos (20 mL) e adicionar 20 mL de acetona com utilização do Vortex para 5 s.
- Spin para baixo o produto em 35.000 × g durante 10 minutos e em seguida, descartar o sobrenadante. Dissolver o precipitado em 2 mL de água.
- Preparação de polímero modificado UCNs (PAA-UCNs)
- combinar 200 mg de ácido poliacrílico (PAA, Mw = 1.800) com 20 mL de água por sonication (60 kHz, 240 W) por 20 min. Adicione os referido UCNs ligante livre na solução PAA com agitação vigorosa.
- Ajustar o valor de pH para 7,4 por solução de NaOH (1m) com sonication (60 kHz, 240 W) por 30 min. manter a mistura por 24 horas à temperatura ambiente, mexendo em.
- Recolher o precipitado por centrifugação a 35.000 × g por 10 min. Ressuspender o produto em 10 mL de água por sonication (60 kHz, 240 W) por 5 min e centrifugar novamente 35.000 × g por 10 min. repetem este passo 3 vezes.
- Re-dispersar o produto em 8 mL de água por sonication (60 kHz, 240 W) por 5 min. armazenar a solução no frigorífico, a ~ o 4 ° C até ser necessário.
- Preparação de nanopartículas DBCO-UCNs funcional
- Spin-down o PAA@UCNs como-preparados (1 mg) por centrifugação a 35.000 × g por 10 min. Ressuspender o precipitado em 1 mL seco DMF pelo sonication (60 kHz, 240 W) por 1 min e centrifugar novamente 35.000 × g por 10 min. repetir esta etapa duas vezes. Dissolver o precipitado em 200 µ l de
- seco DMF em um frasco de vidro. Adicionar HOBT (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) e DIPEA (16 µ l) no frasco com agitação magnética para 24 h.
- Recolher o produto por centrifugação a 35.000 × g por 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1ml DMSO e centrifugar novamente 35.000 × g por 10 min. Repita este passo 3 vezes.
- Dispersar o produto em 0,2 mL de DMSO e armazenar no frigorífico, a ~ 4 ° C antes do uso.
3. Bioapplications de DBCO-UCNs nos canais do Regulamento da membrana, em células vivas
- cultura o HEK293 células em Dulbecco ' s Modified Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% FBS, 100 unidades/mL penicilina, estreptomicina 100 µ g/mL e manter em uma incubadora umidificada com 5% CO 2 a 37 ° C. Seed 1 × 10 5 as células em 1 mL DMEM/poço em uma placa de 12 e mantê-lo na incubadora para 24 h.
- Combinar o plasmídeo (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µ g) com o reagente de transfeccao P3000 (2 µ l) em Eagle ' s mínimo essencial Media (MEM) (100 µ l) em microcentrifuga tubo A e adicionar o reagente de transfeccao (1,5 µ l) em MEM (100 µ l) no tubo B.
- Incubar a mistura das soluções em tubos A e B durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Combinar a solução no tubo A e B com 400 µ l de MEM. Lavar as células com 1 mL soro livre duas vezes DMEM.
- Adicionar a mistura de transfeccao 600 µ l em cada poço de uma placa de 12 e incube as celulas na incubadora 37 ° C por 4 h. Retire o meio e lavar duas vezes com 1 mL DMEM.
- Adicionar 1 mL DMEM contendo 1 µ l Ac 4 ManNAz (50 milímetros em DMSO) no poço e mantê-lo na incubadora por 2 dias.
- Remover o meio e lave uma vez com 1 mL de PBS. Adicione 1 mL de solução de tripsina-EDTA (0,25%) em cada poço da placa 12-bem e incubar a 37 ° C, até que as células têm destacado (~ 2 min). Re-cultura de células em um prato confocal no 1 × 10 5 células/poço em 1 mL DMEM pernoitar.
- Remover o meio e adicione 1 mL de DMEM fresca com 2 µ l DBCO-UCNs (50 mg/mL) no prato para 2 h a 37 ° C. Para a imagem latente confocal, lavar as células duas vezes com DMEM e adicionar 1 µ l Rhod-N 3 (10 mM) por 30 min.
- Para análise de cálcio intracelular, Incube as celulas com a mistura de 1 µ l Rhod-3 AM (10 mM), 10 µ l probenecide (250 mM) e o amortecedor do carregamento 10 µ l (Pluronic surfactante polyols,0.1% w/v)) em 1 mL de meio de DMEM por 30 min no escuro.
- Lavar as células com DMEM isento de soro e a irradiação com luz NIR 808 nm na dosagem de 0.8 W/cm 2 por 20 min (5 min após 5 min iluminação de ruptura).
- Registo dos resultados de imagens no microscópio confocal (fonte de laser: 561 laser nm; detector alcance: 610/75 nm; lente: 100 x 1.4 at óleo, tempo de exposição: 100 ms). Adicione 1 mL de solução de tripsina-EDTA (0,25%) em cada poço e incubar a 37 ° C, até que as células têm destacado (~ 2 min). Ressuspender as células em 1 mL de PBS para análise de fluxo cytometry (FCM) (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).
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Representative Results
O processo de síntese esquemática do núcleo-casca dopado com lantanídeos UCNs são mostrados na Figura 1 e Figura 2. A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e imagens de microscopia eletrônica (HRTEM) de transmissão de alta resolução do núcleo e núcleo-shell UCNs nanoestruturas foram coletadas respectivamente (Figura 1). Os ligante livre UCNs são preparados através da remoção do ácido oleico hidrofóbico na superfície de UCNs em solução ácida e modificados com polímero hidrofílico (PAA). Então os COOH-tampado PAA-UCNs são acrescidas com DBCO-NH2 por uma reação de condensação de Amida. As imagens TEM de ligante livre UCNs, PAA-UCNs e DBCO-UCNs são mostradas na Figura 2. A difusão dinâmica da luz (DLS), resultados de potencial zeta e espectros de luminescência (UCL) upconversion de DBCO-UCNs são coletados, respectivamente (Figura 3). A transformada de fourier transform (FTIR) espectroscopia de infravermelho de DBCO-NH2, PAA-UCNs e DBCO-UCNs são apresentados na Figura 4.
Em experimentos de célula, a expressão bem sucedida de ChR2 na membrana celular é confirmada pelo marcador óbvio de proteína verde fluorescente (GFP) (Venus) utilizando microscopia confocal (Figura 5A). Os DBCO-UCNs são especificamente localizadas na superfície das células HEK293 ChR2-expressando pela reação de clique (Figura 5A). A análise de cálcio intracelular após estimulação luminosa NIR é igualmente confirmada pela confocal imaging e fluxo cytometry (FCM) com base em um padrão Ca2 + indicador fluorescente, Rhod-3 AM (Figura 5B, C).
Figura 1. Síntese do núcleo-shell lantanídeos dopado com UCNs. (A) ilustração esquemática do processo de síntese de UCNs. (B, C) Temperatura do núcleo (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1 %)) e núcleo-shell (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanoestruturas. Barra de escala: 50 nm. Baixo-relevo: Imagens HRTEM de nanoestruturas de UCNs núcleo e núcleo-shell. Barra de escala: 5 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Síntese de nanoestruturas de UCNs funcionais. (A) ilustração esquemática do processo de síntese do ligante livre UCNs, PAA-UCNs e DBCO-UCNs, respectivamente. (B, C, D) TEM imagens de ligante livre UCNs, PAA-UCNs e DBCO-UCNs. Barra de escala: 100 nm no painel B e 50 nm no painel C/D. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Espectroscopia FTIR de DBCO-NH2, PAA-UCNs e DBCO-UCNs, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Caracterização de DBCO-UCNs em solução tampão. (A) resultados DBCO-UCNs DLS. (B) resultados potenciais de Zeta de PAA-UCNs e DBCO-UCNs (média ± DP). Espectros UCL (C) do núcleo e núcleo-shell UCNs em hexano (1 mg/mL), PAA-UCNs e DBCO-UCNs em água (1 mg/mL) separadamente (Ex: 808 nm). Baixo-relevo: luminescência foto UCNs com irradiação de nm 808. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Aplicativos celulares de DBCO-UCNs sobre NIR luz iluminação. (A) imagem latente Confocal de ChR2-expressando N3-com a tag células HEK293 incubadas com DBCO-UCNs (topo) e PAA-UCNs (inferior) por 2 h a 100 µ g/mL. Verde: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), azul: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Barra de escala: 20 µm. (B) celular Ca2 + imagem com Rhod-3 AM antes e após a irradiação de luz-NIR (0.8 W/cm2 por 20 min). Ex: 561 nm, Em: 610/75 nm. Barra de escala: 10 µm. (C) FCM quantitativos análise da intensidade da fluorescência normalizados do celular Ca2 + com iluminação de diferentes dosagens de luz (média ± DP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo apresentou um método para a síntese de nanocristais de núcleo-casca dopado com lantanídeos upconversion (UCNs) e sua modificação da superfície com partes funcionais para aplicativos de celulares. Este romance nanomaterial possui excelentes propriedades ópticas, que podem emitir luz UV e visível em cima da excitação de luz de NIR através de um processo multi fóton upconversion. Neste protocolo, as núcleo-casca UCNs nanoestruturas (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) são preparados por um método de alta temperatura co-precipitação em uma mistura de ácido oleico e 1-octadecene. Imagens TEM demonstram a morfologia destes núcleo e núcleo-casca nanocristais são esféricos em forma com um diâmetro de 20 nm e 30 nm respectivamente, implicando uma espessura da casca de cerca de 5 nm (Figura 1). A arquitetura de núcleo-casca é também revelada pelas imagens de alta resolução TEM na inserção da Figura 1, que mostra semelhante franjas de treliça com isso do núcleo UCNs nanoestruturas. Além disso, um típico d-espaçamento em torno de 0,52 nm concorda bem com o espaçamento do plano (100) do β-NaYF4, indicando que todas as nanoestruturas UCNs núcleo e núcleo-shell são altamente cristalizadas e mantêm a mesma estrutura de cristal. Além disso, os espectros de luminescência upconversion demonstram as nanocristais de núcleo-casca emitem forte emissão azul com uma intensidade muito maior em 480 nm do que as partículas do núcleo sobre excitação com um laser de diodo para alcançar uma onda contínua em 808 nm ( Figura 4). A emissão melhorada de núcleo-casca UCNs é atribuída à superfície reprimida, extinguendo o efeito de Yb3 +3 +Nd e Tm3 + íons que são incorporados na camada interior da concha-núcleo nanocristais21. Estes resultados confirmam fortemente a preparação bem sucedida dos lantanídeos dopado com núcleo-casca UCNs nanomaterial nesta proposta.
Existem várias etapas essenciais na síntese desses nanocristais co-precipitação de alta temperatura. Em primeiro lugar, o volume adicionado de solução-mãe de iões lantanídeos no processo de síntese de UCNs o núcleo e núcleo-shell deve ser estritamente controlado (etapa 1.1.2.2). Alto nível de dopagem íons irá resultar em um cruz-relaxamento relacionados com concentração ou têmpera efeito devido à interação íon-íon os nanocristais21. Em segundo lugar, a temperatura deve ser mantida a menos de 50 ° C para garantir a nucleação completa depois de NaOH e NH4F são adicionados para o balão (passo 1.1.2.9 e passo 1.2.9), que é fundamental para garantir uma morfologia uniforme, promovendo o crescimento de cristal com base em Ostwald amadurecimento de efeitos22. Em terceiro lugar, o tamanho e propriedades ópticas de nanopartículas de núcleo-concha podem ser principalmente controladas ajustando a quantidade de íons lantanídeos nos precursores de shell (Y3 + e3 +Nd) e núcleo preparado como partículas (etapa 1.2.1). Também é importante que a morfologia da concha-núcleo nanocristais é baseada sobre o crescimento de concha anisotrópica de diferentes tipos de partículas do núcleo, que é útil para as diferentes emissões ópticas de UCNs sobre NIR iluminação23de modulação.
Além disso, também é um desafio considerável para converter efetivamente UCNs hidrofóbicos hidrofílico UCNs nanopartículas para mais aplicações biológicas. Embora alguns métodos têm sido relatados para melhorar a biocompatibilidade de UCNs em solução-tampão, incluindo troca de ligante, revestimento de sílica, capturando com oleato oxidação do ligante, etc, eles sofrem de agregação inesperada, demorada, e procedimentos complexos de25,24,26. Neste documento, desenvolvemos uma abordagem simples para obter dispersáveis em água livre de ligante UCNs nanoestruturas, removendo o ácido oleico na superfície de UCNs oleato-tampado em uma solução de água ácida (pH = 4). O valor de pH ajustado pelo HCl é fundamental para controlar a liberação de ligante oleato e afetar a luminescência de UCNs. Mais importante, um polímero biocompatível (ácido poliacrílico, PAA) com um grande número de carboxila grupos podem vincular com os íons lantanídeos na superfície de UCNs pela interação de coordenação, que proporcionará mais grupos funcionais para o produto químico mais modificação. Portanto, nós funcionalizar as metades de2 DBCO-NH na superfície de UCNs para mais específico N3-com a tag localização da membrana celular. As imagens TEM de ligante livre UCNs PAA-UCNs e DBCO-UCNs na Figura 2 demonstram a grande dispersity e solubilidade dessas nanoestruturas em solução tampão após a modificação da superfície. Além disso, espectroscopia de infravermelho (FTIR) fourier transform foi realizada para caracterizar a modificação da superfície dos grupos DBCO UCNs nanoplatform. Como mostrado na Figura 3, a banda forte em torno de 3.430 cm-1 é devido a vibração de H-O alongamento dos grupos carboxila, e as duas bandas centradas em 1550 cm-1 e 1458 cm-1 são associadas com o assimétrica e alongamento simétrica modos de vibração dos ânions carboxilato, indicando o revestimento bem sucedido de COOH grupo contendo polímeros (PAA) na superfície UCNP. Após reação com partes de DBCO-NH2 , uma banda óbvia no 1.635 cm-1 está presente com base na C = C alongamento vibração no anel aromático de grupos DBCO, que é consistente com o espectro FTIR de partes de DBCO-NH2 ao mesmo número de onda. Além disso, o resultado de difusão dinâmica da luz (DLS) indica o aumento diâmetro hidrodinâmico de DBCO-UCNs em solução aquosa (96.4±10.4 nm) (Figura 4A). Os resultados de potencial zeta também indicam a superfície negativa do PAA-UCNs (-26.1±4.4 mV) e DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) respectivamente (Figura 4B), demonstrando a grande solubilidade e estabilidade dessas nanoestruturas em solução-tampão. Além disso, os espectros UCL do PAA-UCNs e DBCO-UCNs demonstram que eles podem emitir semelhante de emissão de upconverted em 480 nm após 808 nm luz radiação (Figura 4), que pode ser utilizada para mais NIR mediada por luz photoactivation em biológicas sistemas.
Além disso, como um prova de conceito, a fim de demonstrar a bioapplication de UCNs funcionalizados em células vivas, uma proteína de canal dependente de luz (ChR2) é projetada na superfície da célula de regular as funções celulares mediando o influxo de íons cátion (por exemplo, Ca2 +) no citoplasma27,28,29. A expressão bem-sucedida de ChR2 na membrana da linha de células HEK293 é confirmada pela presença do marcador de proteína verde fluorescente (GFP) (Venus) utilizando microscopia confocal (Figura 5A). Além disso, a localização de UCNs no N3-etiquetada membrana celular obviamente é visualizada na superfície das células (azul) após incubação de 2 h, que pode ser atribuída ao fato de que os grupos DBCO residuais na superfície de nanoestruturas UCNs estão manchados com uma contendo azida tintura fluorescente (5-tetrametilrodamina-azida, Rhod-N.3) através do opaco sem cobre clique reação. Além disso, luz NIR (808 nm) é utilizada para irradiar o nanotransducer UCNs localizada na superfície da pilha, que pode ativaro ChR2 luz-gated canal proteínas e facilitar Ca2 + íon influxo através da membrana. Como mostrado na Figura 5B, um aumento significativo de fluorescência vermelha no citosol é observado por um padrão indicador2 + Ca fluorescente, sou Rhod-3, enquanto nenhum incremento aparente da fluorescência é gravado na ausência de luz. A análise quantitativa do fluxo cytometry (FCM) Figura 5 também demonstra que o tal reforço de fluorescência NIR-luz-responsivo é luz-dose-dependente, sugerindo claramente que as DBCO-UCNs biocompatíveis podem efetivamente regular o proteínas de canal na membrana celular após irradiação de luz-NIR.
Em resumo, baseado nos resultados acima mencionados, prevemos que o presente protocolo não só fornece detalhada de procedimentos experimentais para a síntese de co-precipitação de alta temperatura de núcleo-casca UCNs nanoestruturas, mas também desenvolve um simples técnica para modificação da superfície biocompatível de UCNs para mais NIR mediada por luz photoactivation em aplicações biológicas. Mais importante, baseia a lógica por trás deste método, as propriedades ópticas de UCNs mais é regulável por diferentes tipos de íons lantanídeos de doping (por exemplo, Erbium (III), hólmio (III), etc.) os cristais para emitir UV, verde, vermelho, e NIR a luz em cima de irradiação de luz 808 nm30. Além disso, a superfície de UCNs pode ser modificada também com vários grupos funcionais (por exemplo,peptídeo, proteínas, lipídios, direcionamento de ligante, etc) para aplicações biomédicas ainda mais31,32. Estas vantagens fazem-biocompatível UCNs nanomaterial um candidato adequado para o estudo dos processos fisiológicos in vitro e em vivoe, assim, podem atuar como nanomedicina personalizada para clínica theranostics no futuro.
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Disclosures
Nós não temos nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pela NTU-AIT-NAM MUV/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) e (RG 15/35) concedido em Nanyang Technological University, Singapore e Nacional Natural Science Foundation da China (NSFC) (n º 51628201).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
| oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
| Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
| Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
| Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
| Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
| Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
| Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
| Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
| Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
| polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
| Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
| HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
| opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
| N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
| Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
| 5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
| Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
| 1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
| Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
| Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
| 12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
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