Summary
En protokoll er presentert for syntese av kjerne-shell transisjonsmetall-dopet upconversion nanokrystaller (UCNs) og deres cellular programmer for kanal protein regulering på nær infrarød (NIR) lys belysning.
Abstract
Transisjonsmetall-dopet upconversion nanokrystaller (UCNs) har fått mye oppmerksomhet de siste årene basert på deres lovende og kontrollerbar optiske egenskaper, som tillater absorpsjon av (NIR) røyken og kan deretter konvertere den til multiplekset utslipp som spenner over en rekke områder fra UV til synlig å NIR. Denne artikkelen presenterer detaljerte eksperimentelle prosedyrer for høy temperatur co nedbør syntese av kjerne-shell UCNs som innlemme forskjellige transisjonsmetall ioner i nanokrystaller for å effektivt konvertere dype vev penetrable NIR eksitasjon (808 NM) i en sterk blå utslipp på 480 nm. Ved å kontrollere overflaten endring med biokompatible polymer (polyacrylic acid, PAA), som forberedt UCNs kjøper store løslighet i buffer løsninger. De hydrofile nanokrystaller er videre functionalized med bestemte ligander (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for lokalisering på cellemembranen. På NIR lys (808 nm) bestråling, upconverted blå utslipp kan effektivt aktivere lys-gated kanal protein på cellemembranen og spesifikt regulerer kasjon (f.eks, Ca2 +) tilstrømningen i cytoplasma. Denne protokollen gir en mulig metode for syntese av kjerne-shell transisjonsmetall-dopet UCNs og påfølgende biokompatible overflaten modifikasjon for videre mobilnettet søknader.
Introduction
De siste årene, har transisjonsmetall-dopet upconversion nanokrystaller (UCNs) er mye brukt som et alternativ til konvensjonelle organisk fargestoffer og kvante prikker i biomedisinsk programmer, som er hovedsakelig basert på deres enestående kjemisk og optiske egenskaper, inkludert store biocompatibility, høy motstand mot photobleaching, og begrense båndbredde utslipp1,2,3. Enda viktigere, kan de tjene som en lovende nanotransducer med utmerket vev penetrasjon dybde i vivo konvertere nær infrarød (NIR) eksitasjon i et bredt spekter av utslipp fra UV, synlig, og regionene NIR gjennom et multi Foton upconversion prosessen4,5. Disse unike egenskaper gjør transisjonsmetall-dopet UCNs tjene som en særlig lovende vektor biologiske sensing, biomedisinsk bildebehandling og sykdommer theranostics6,7,8.
De generelle komponentene i UCNs er hovedsakelig basert på de dopet transisjonsmetall ionene i isolerende vert matrisen som inneholder sensibiliserende (f.eks, Yb3 +, Nd3 +) og aktivator (f.eks, Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) i crystal homogent9. Forskjellige optisk utslipp fra nanokrystaller tilskrives lokaliserte elektronisk overgangen i 4f orbitale transisjonsmetall dopants på grunn av deres stige som arrangerte energi nivå10. Derfor er det viktig å kontrollere nøyaktig størrelse og morfologi av syntetisk UCNs med multicomponent transisjonsmetall dopants. Høyre, er noen lovende metoder godt etablert for utarbeidelse av transisjonsmetall-dopet UCNs, inkludert Termisk nedbrytning, høy temperatur co nedbør, hydrotermal syntese, sol-gel bearbeiding, etc.11 , 12 , 13 blant disse tilnærmingene, metoden høy temperatur co nedbør er en av de mest populære og praktiske strategier for UCNs syntese, som kan kontrolleres strengt for å forberede ønsket høykvalitets nanokrystaller med uniform form og størrelsesDistribusjon i en relativt kort reaksjonstid og rimelig14. Men er de fleste nanostrukturer syntetisert av denne metoden hovedsakelig lysere hydrofobe ligander som oljesyre og oleylamine, som vanligvis hindrer deres ytterligere bioapplication på grunn av aksjeselskapet av hydrofobe ligand løslighet i vandig løsning 15. det er derfor nødvendig å utføre egnet overflaten modifikasjon teknikker for å forberede biokompatible UCNs biologiske programmer i vitro og i vivo.
Her presenterer vi detaljerte eksperimentelle prosedyren for syntese av kjerne-shell UCNs nanostrukturer gjennom metoden høy temperatur co nedbør og en mulig endring teknikk for å functionalize biokompatible polymer på UCNs overflate for Videre mobilnettet søknader. Denne UCNs nanoplatform inneholder tre transisjonsmetall ioner (Yb3 +Nd3 +og Tm3 +) til nanokrystaller å få sterke blå utslipp (~ 480 nm) på NIR lys eksitasjon på 808 nm, som har større gjennomtrenging dyp i levende vev. Det er velkjent at Nd3 +-dopet UCNs vise minimerte vann absorpsjon og overoppheting effekter på dette spectral vinduet (808 nm) sammenlignet med konvensjonelle UCNs på 980 nm bestråling16,17, 18. videre for å utnytte UCNs i biologiske systemer, de hydrofobe ligander (oljesyre) på overflaten av UCNs er først fjernet av sonication i sur løsning19. De ligand-fri UCNs endres deretter videre med en biokompatible polymer (polyacrylic acid, PAA) å skaffe stor oppløselighet i vandige løsninger20. Som en proof-of-concept i mobilnettet programmer, de hydrofile UCNs er videre functionalized med molekylær ligander (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for bestemte lokalisering på N3-merket celle membran. På NIR lys (808 nm) bestråling, upconverted blå utslipp på 480 nm kan effektivt aktivere en lys-gated kanal protein, channelrhodopsins-2 (ChR2), på celle overflaten og dermed forenkle kasjon (f.eks, Ca2 + ion) tilstrømningen over membranen av levende celler.
Denne video protokollen gir en mulig metode for transisjonsmetall-dopet UCNs syntese, biokompatible overflaten modifikasjon og UCNs bioapplication i levende celler. Eventuelle forskjeller i syntese teknikker og kjemiske reagenser i nanocrystal vekst vil påvirke de størrelse distribusjon, morfologi og upconversion luminescence (UCL) spektra av siste UCNs nanostrukturer celle forsøk. Denne detaljerte video protokollen er forberedt på å hjelpe nye forskere i dette feltet til å forbedre reproduserbarhet av UCNs med høy temperatur co nedbør metoden og unngå de vanligste feilene i UCNs biokompatible overflaten modifikasjon for ytterligere mobilnettet programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
forsiktig: ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablader (MSDS) før bruk. Kan bruke alle nødvendige sikkerhets praksis når syntese av UCNs ved høy temperatur (~ 290 ° C), inkludert bruk av engineering kontroller (avtrekksvifte) og personlig verneutstyr (f.eks, vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser og lukket-toe sko).
1. syntese av NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokrystaller
- syntese av NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) core nanostructure
- Forberedelse til RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F metanol lagerløsning
Merk: den sjeldne-earth (RE) transisjonsmetall ioner inkluderer Yttrium (Y), Ytterbium (Yb), Thulium (Tm) og neodym (Nd).- Oppløse 500 mg Yttrium(III) acetate hydrat 5 mL metanol (100 mg/mL), 250 mg Ytterbium (III) acetate hydrat i 5 mL metanol (50 mg/mL), 10 mg Thulium (III) acetate hydrat i 1 mL metanol (10 mg/mL), og 10 mg Neodymium (III) acetate hydrat i 1 mL metha Nol (10 mg/mL) i hetteglass med ultralydbad med rengjøring for 2 min.
- Kombinerer 400 mg NaOH i et 50 mL sentrifuge rør med 20 mL metanol med rengjøring ultralydbad å forberede NaOH lagerløsning (20 mg/mL).
- Kombinerer 600 mg NH 4 F i en 50 mL sentrifuge tube med 30 mL metanol med rengjøring ultralydbad å forberede NH 4 F lagerløsning (20 mg/mL).
Merk: Plassere lagerløsning transisjonsmetall komplekser, NaOH og NH 4 F i hetteglass, tetning med parafilm og lagre dem i et kjøleskap på ~ 4 ° C inntil nødvendig. Forberedt metanol lager løsninger er erstattet en gang annenhver uke.
- Forberedelse av NaYF 4: Yb/Tm/Nd kjernen nanostructure
- Pipetter 3 mL oljesyre og 7 mL av 1-octadecene i en 50-mL tre-hals kolbe.
- Kombinerer 1.089 mL av Y (CH 3 CO 2) 3 lager løsningen, 0.608 mL av Yb (CH 3 CO 2) 3 lager løsningen, 83.6 µL av Tm (CH 3 CO 2) 3 aksjer løsning, og 128,5 µL av Nd (CH 3 CO 2) 3 lager løsningen i flasken.
- Passer et termometer (0 - 360 ° C område) i flasken og la spissen sin touch løsningen. Plassere flasken i en glassbeholder med phenylmethyl silikonolje.
- Varme løsningen 100 ° c med en varm plate å fordampe av metanol. Koble kolbe til en Schlenk linje med en dobbel vakuum/gass manifold fjerne gjenværende metanol og holde reaksjonsblandingen under vakuum for 2-3 minutter under omrøring.
- Øke temperaturen til 150 ° C og holde denne temperaturen i 60 min. vedlikeholde en omrøring hastigheten på 700 rpm under syntese.
Merk: Angi en moderat omrøring hastigheten å unngå spruting løsningen. - Stopper kokeplate og holde flasken ved romtemperatur å tillate løsningen kjølig ned sakte.
Merk: Protokollen kan pauses her. - Kombinere 2 mL av NaOH-metanol lagerløsning og 2.965 mL NH 4 F-metanol lagerløsning inn i et 15 mL sentrifuge rør. Stramme røret med sin lua og blande løsningen ved kraftig vortexing for 5 s.
- Legg til NaOH-NH 4 F blandingen langsomt i flasken av en glass pipette over 5 min.
- Øke temperaturen på blandingen til 50 ° C og holde denne temperaturen i 30 min.
Merk: Still inn temperaturen på mer enn 50 ° C fordi den høye temperaturen vil fremme krystall nucleation og vekst. - Øke temperaturen (~ 100 ° C) fordampe av metanol og koble kolbe til en Schlenk linje med en dobbel vakuum/gass manifold fjerne gjenværende metanol og holde reaksjonsblandingen under vakuum for 2-3 min.
- Bytte posisjonen til stopcock fylle kolbe med nitrogen.
- Øke temperaturen 290 ° c med en oppvarming hastighet på ~ 5 ° C/min. holde reaksjonsblandingen ved 290 ° C i 1,5 h.
- Slutter kokeplate og fjerne flasken for å tillate reaksjonsblandingen å kjøle ned sakte i romtemperatur stirring.
FORSIKTIG: Vær forsiktig med kokeplate med høy temperatur (> 400 ° C) å unngå alvorlige forbrenninger på hudkontakt. - Overfører blandingen i flasken til en 50 mL sentrifuge rør. Skyll kolbe med 30 mL av etanol og overføre løsningen til sentrifuge røret.
- Sentrifuge produktet på 4000 × g i 8 min ved romtemperatur og kast nedbryting.
- Legge til 10 mL Heksan sentrifuge rør og å spre produktet med sonication (60 kHz, 240 W) for 2 min.
- Legge til 30 mL av etanol røret. Nedspinning produktet på 4000 × g i 8 min og deretter kaste nedbryting.
- Spre re solid produktene i bunnen av sentrifuger rør med 5 mL Heksan. Lagre løsningen i kjøleskap ved ~ 4 ° C i en neste steg.
Merk: Upconversion utslipp av kjerne-shell UCNs er testet av irradiating løsninger med en 808 nm laser (2 M).
- Forberedelse til RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F metanol lagerløsning
- Forberedelse av NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokrystaller
- kombinerer 3 mL oljesyre og 7 mL av 1-octadecene til en 50-mL tre-hals kolbe. Legge til 1.082 mL av Y (CH 3 CO 2) 3 lager løsningen og 2,87 mL Nd (CH 3 CO 2) 3 lager løsningen i flasken.
- Legge innhentet kjernen nanostructure (80 mg i 5 mL Heksan fra trinn 1.1.2.18) i flasken stirring.
- Passer et termometer (0 - 360 ° C område) i flasken og la spissen sin touch blandingen. Plassere flasken i en glassbeholder med phenylmethyl silikonolje.
- Varm blandingen ved 100 ° C på kokeplate å fordampe av metanol og Heksan. Koble kolbe til en Schlenk linje med en dobbel vakuum/gass manifold fjerne gjenværende løsemiddelet og holde reaksjonsblandingen under vakuum for 2-3 minutter under omrøring.
- Øke temperaturen til 150 ° C og beholde den for 60 min. vedlikeholde omrøring hastigheten på 700 rpm i syntesen.
Merk: Angi en moderat omrøring hastigheten å unngå spruting løsningen. - Slutter kokeplate og fjerne flasken for å tillate løsningen å kjøle ned sakte ved romtemperatur.
Merk: Protokollen kan pauses her. - Pipette 2 mL av NaOH-metanol lagerløsning og 2.965 mL NH 4 F-metanol lagerløsning inn i et 15 mL sentrifuge rør. Stramme røret med sin lua og blande løsningen ved kraftig vortexing for 5 s.
- Legg til blandingen i flasken av en glass pipette sakte over 5 min.
- Øke temperaturen på blandingen til 50 ° C og holde det ved 50 ° C for 30 min.
Merk: Still inn temperaturen ikke høyere enn 50 ° C fordi den høye temperaturen vil fremme krystall nucleation og vekst. - Øke temperaturen (~ 100 ° C) fordampe av metanol og koble kolbe til en Schlenk linje med en dobbel vakuum/gass manifold fjerne gjenværende metanol, holde reaksjonsblandingen under vakuum for 2-3 min.
- Bytte posisjonen til stopcock fylle kolbe med nitrogen.
- Øke temperaturen 290 ° c minst en oppvarming ~ 5 ° C/min. holde reaksjonsblandingen 290 ° C i 1,5 h.
- Slutter kokeplate og fjerne flasken for å tillate reaksjonsblandingen å kjøle ned sakte ved romtemperatur stirring.
FORSIKTIG: Vær forsiktig med kokeplate med høy temperatur (> 400 ° C) å unngå alvorlige forbrenninger på hudkontakt. - Overfører blandingen i flasken til en 50 mL sentrifuge rør. Skyll kolbe med 30 mL av etanol og overføre løsningen til sentrifuge røret.
- Sentrifuge produktet på 4000 × g i 8 min ved romtemperatur og kast nedbryting.
- Legge til 10 mL Heksan sentrifuge rør og å spre produktet med sonication (60 kHz, 240 W) for 2 min.
- Legge til 30 mL av etanol røret. Nedspinning produktet på 4000 × g i 8 min og deretter kaste nedbryting.
- Spre re solid produktene i bunnen av sentrifuger rør med 5 mL Heksan. Lagre løsningen i kjøleskap ved ~ 4 ° C inntil.
Merk: Upconversion utslipp av kjerne-shell UCNs er testet av irradiating løsninger med en 808 nm laser (2 M).
2. Syntese av biokompatible UCNs nanostrukturer
- utarbeidelse av ligand-fri UCNs hydrogenion
- kombinerer 30 mL etanol med som forberedt oleate-capped UCNs løsning (trinn 1.2.18) i et 50 mL sentrifuge rør. Sentrifuge blandingen på 4000 × g i 8 min ved romtemperatur og kast nedbryting.
- Kombinerer 10 mL sur vandig løsning (pH = 4) justert av HCl (0.1 M) med utløse i 50 mL sentrifuge rør og oppløse utløse av sonication (60 kHz, 240 W) i 30 min.
- Overføre løsningen i et glass medisinglass med energisk stirring på 2 h.
- Ekstra vandig løsningen med 30 mL diethyl Eter å fjerne oljesyre, repeter tre ganger.
- Legge 10 mL vann i kombinert Eter lag med mild skjelvende.
- Samle den vandige fasen sammen (20 mL) og legge til 20 mL aceton med vortexing for 5 s.
- Spinn ned produktet 35.000 × g på 10 min og deretter kaste nedbryting. Oppløse bunnfall i 2 mL vann.
- Utarbeidelse av polymer modifisert UCNs (PAA-UCNs)
- kombinerer 200 mg polyacrylic syre (PAA, Mw = 1800) med 20 mL vann av sonication (60 kHz, 240 W) i 20 min. legge de nevnte ligand-fri UCNs i PAA løsningen med energisk omrøring.
- Justere pH verdien 7,4 av NaOH løsning (1 M) med sonication (60 kHz, 240 W) for 30 min. holde blandingen for 24 timer ved romtemperatur stirring.
- Samle utløse med sentrifugering 35.000 × g for 10 min. re suspendere produktet i 10 mL vann av sonication (60 kHz, 240 W) for 5 min og sentrifuger igjen på 35.000 × g for 10 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- å spre produktet i 8 mL vann av sonication (60 kHz, 240 W) for 5 min. lagre løsningen i kjøleskap ved ~ 4 ° C inntil.
- Utarbeidelse av funksjonelle DBCO-UCNs hydrogenion
- Nedspinning som forberedt PAA@UCNs (1 mg) med sentrifugering 35.000 × g for 10 min. suspendere re bunnfall i 1 mL tørke DMF ved sonication (60 kHz, 240 W) for 1 min og sentrifuge igjen 35.000 × g for 10 min. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Oppløsning bunnfall i 200 µL tørr DMF i et hetteglass. HOBT (12.2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) og DIPEA (16 µL) i ampullen med magnetiske omrøring for 24 h.
- Samle produktet av sentrifugering 35.000 × g for 10 min. fjerne nedbryting og å suspendere bunnfall i 1 mL DMSO og sentrifuger igjen på 35.000 × g for 10 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Spre produktet i 0,2 mL DMSO og oppbevares i kjøleskap på ~ 4 ° C før bruk.
3. Bioapplications av DBCO-UCNs i regulering av membran kanaler i levende celler
- kultur HEK293 cellene i Dulbecco ' s endret Eagle ' s Medium (DMEM) med 10% FBS, 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og opprettholde i en fuktet inkubator med 5% CO 2 på 37 ° C. frø 1 × 10 5 celler i 1 mL DMEM/godt i en 12-vel plate og holde det i inkubator for 24 h.
- Kombinerer plasmider (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µg) med P3000 transfection reagens (2 µL) i Eagle ' s Minimum Essential Media (MEM) (100 µL) i microcentrifuge rør A, og legge til hva reagens (1,5 µL) i MEM (100 µL) i rør B.
- Ruge blanding av løsninger i rør A og B for 10 min ved romtemperatur.
- Kombinerer løsningen i rør A og B med 400 µL MEM. Vask cellene med 1 mL serum-free DMEM to ganger.
- Legge til 600 µL transfection blandingen i hver brønn av en 12-vel plate og ruge cellene på 37 ° C inkubator for 4 h. fjerne mediet og vaske to ganger med 1 mL DMEM.
- Legge til 1 mL DMEM som inneholder 1 µL Ac 4 ManNAz (50 mM i DMSO) i godt og holde den i inkubator for 2 dager.
- Fjerne mediet og vask en gang med 1 mL PBS. Legg 1 mL Trypsin-EDTA (0,25%) løsning i hver brønn av 12-vel plate og ruge på 37 ° C før celler har frittstående (~ 2 min). Nytt kultur cellene i en AC confocal rett på 1 × 10 5 celler/godt i 1 mL DMEM for overnatting.
- Fjerner mediet og legger 1 mL ferske DMEM med 2 µL DBCO-UCNs (50 mg/mL) i retten for 2t på 37 ° C. AC confocal bildebehandling, vaske celler to ganger med DMEM og legge til 1 µL Rhod-N 3 (10 mM) for 30 min.
- For intracellulær kalsium analyse, ruge cellene med blanding av 1 µL Rhod-3 AM (10 mM), 10 µL Probenecid (250 mM), og 10 µL lasting buffer (Pluronic surfactant polyols,0.1% w/v)) i 1 mL DMEM medium i 30 min i mørket.
- Vask cellene med serum-free DMEM og irradiate med 808 nm NIR lys på 0,8 W/cm 2 for 20 min (5 min pause etter 5 min belysning) dosen.
- Registrere bildebehandling på AC confocal mikroskopet (laser kilde: 561 nm laser; detektor utvalg: 610/75 nm, linse: 100 x 1.4 NA olje, eksponeringstid: 100 ms). Legg 1 mL Trypsin-EDTA (0,25%) løsning i hver brønn og ruge på 37 ° C før celler har frittstående (~ 2 min). Nytt suspendere cellene i 1 mL PBS for flyt cytometri (FCM) analyse (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk synteseprosessen med core-shell transisjonsmetall-dopet UCNs er vist i figur 1 og figur 2. Overføring elektronmikroskop (TEM) og høyoppløselige elektronmikroskop (HRTEM) bilder av kjernen og kjerne-shell UCNs nanostrukturer ble samlet henholdsvis (figur 1). De ligand-gratis UCNs er utarbeidet ved å fjerne den hydrofobe oljesyre på overflaten av UCNs i sur løsning, og endret med hydrofile polymer (PAA). Deretter er COOH snødekte PAA-UCNs functionalized med DBCO-NH2 av en amid kondens reaksjon. TEM bilder av ligand-fri UCNs PAA-UCNs og DBCO-UCNs er vist i figur 2. Dynamisk lysspredning (DLS), zeta potensielle resultater og upconversion luminescence (UCL) spektra av DBCO-UCNs er samlet henholdsvis (Figur 3). Fourier transformere infrarød (FTIR) spektroskopi av DBCO-NH2, PAA-UCNs og DBCO-UCNs presenteres i Figur 4.
I celle eksperimenter, er vellykket uttrykket av ChR2 i cellemembranen bekreftet av åpenbare grønne fluorescerende protein (GFP) markøren (Venus) bruker AC confocal mikroskopi (figur 5A). DBCO-UCNs er spesielt lokalisert på overflaten av ChR2-uttrykke HEK293 celler av Klikk reaksjon (figur 5A). Intracellulær kalsium analyse på NIR lys stimulering er også bekreftet av AC confocal imaging og flyt cytometri (FCM) basert på en standard fluorescerende Ca2 + indikatoren, Rhod-3 AM (figur 5B, C).
Figur 1. Syntese av kjerne-shell transisjonsmetall-dopet UCNs. (A) skjematisk illustrasjon av syntese UCNs. (B, C) TEM av kjernen (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0,5/1 %)) og kjerne-shell (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostrukturer. Skala bar: 50 nm. Innfelt: HRTEM bilder av kjernen og kjerne-shell UCNs nanostrukturer. Skala bar: 5 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Syntese av funksjonelle UCNs nanostrukturer. (A) skjematisk illustrasjon av syntese ligand-fri UCNs PAA-UCNs og DBCO-UCNs, henholdsvis. (B, C, D) TEM bilder av ligand-fri UCNs PAA-UCNs og DBCO-UCNs. Skala bar: 100 nm i panelet B og 50 nm i panelet C/D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. FTIR spektroskopi av DBCO-NH2, PAA-UCNs og DBCO-UCNs, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Karakterisering av DBCO-UCNs i buffer løsning. (A) DLS resultatene av DBCO-UCNs. (B) Zeta muligheter resultater av PAA-UCNs og DBCO-UCNs (mener ± SD). (C) UCL spektra av kjernen og kjerne-shell UCNs i heksan (1 mg/mL), PAA-UCNs og DBCO-UCNs i vann (1 mg/mL) separat (Ex: 808 nm). Innfelt: luminescence fotografi av UCNs med 808 nm bestråling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Mobilnettet anvendelser av DBCO-UCNs på NIR lys belysning. (A) AC Confocal imaging uttrykk for ChR2 N3-merket HEK293 celler inkubert med DBCO-UCNs (øverst) og PAA-UCNs (nederst) for 2t på 100 µg/mL. Grønn: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), blå: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Skala bar: 20 µm. (B) Cellular Ca2 + bildebehandling med Rhod-3 før og etter NIR lys bestråling (0,8 W/cm2 for 20 min). Ex: 561 nm, Em: 610/75 nm. Skala bar: 10 µm. (C) kvantitative FCM analyse av normalisert fluorescens intensiteten av mobilnettet Ca2 + med forskjellige lys doser belysning (gjennomsnittlig ± SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen har presentert en metode for syntese av kjerne-shell transisjonsmetall-dopet upconversion nanokrystaller (UCNs) og overflate endringen med funksjonell moieties for mobilnettet programmer. Denne romanen nanomaterial har enestående optiske egenskaper, som kan avgi UV og synlig lys NIR lys eksitasjon gjennom en multi Foton upconversion. I denne protokollen, core-shell UCNs nanostrukturer (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) er utarbeidet av en høy temperatur co nedbør metode i en blanding av oljesyre og 1-octadecene. TEM bilder viser morfologi av disse kjernen og kjerne-shell nanokrystaller er sfærisk i form med en diameter på 20 nm og 30 nm henholdsvis antyde shell tykkelse på ca 5 nm (figur 1). Kjerne-shell arkitekturen er også avslørt av høy oppløsning TEM bildene i rammemargen i figur 1, som viser lignende gitter frynser med at av kjernen UCNs nanostrukturer. Dessuten, en typisk d-avstand rundt 0.52 nm stemmer godt avstanden mellom (100) flyet av β-NaYF4, som angir at alle kjernen og kjerne-shell UCNs nanostrukturer er svært krystallisert og opprettholde den samme krystallstruktur. Videre til upconversion luminescence spectra vise kjernen-shell-nanokrystaller avgir sterke blå utslipp med en mye høyere intensitet på 480 nm enn kjernen partikler på eksitasjon med en diode laser til å oppnå en kontinuerlige bølgen på 808 nm ( Figur 4C). Forbedret utslipp av kjerne-shell UCNs tilskrives undertrykt overflaten slukke effekten av Yb3 +, Nd3 +og Tm3 + ionene som er innebygd i det indre laget av kjerne-shell nanokrystaller21. Disse resultatene bekrefter sterkt vellykket utarbeidelse av transisjonsmetall-dopet core-shell UCNs nanomaterial i dette forslaget.
Det er flere viktige trinn i høy temperatur co nedbør syntese av disse nanokrystaller. Først lagt mengden transisjonsmetall ion lager løsning for synteseprosessen av kjernen og kjerne-shell-UCNs bør være strengt kontrollert (trinn 1.1.2.2). Høy doping ioner vil resultere i en konsentrasjon-relaterte kryss-avslapping eller slukke virkning ion-ion samhandling i nanokrystaller21. Andre bør temperaturen holdes på mindre enn 50 ° C å sikre fullstendig nucleation når NaOH og NH4F er lagt til i flasken (trinn 1.1.2.9 og 1.2.9), som er avgjørende for å sikre en ensartet morfologi ved å fremme krystall veksten basert på Ostwald modning effekter22. Tredje, størrelse og optiske egenskaper av kjerne-shell nanopartikler hovedsakelig kontrolleres ved å justere mengden transisjonsmetall ioner i forløperne til skallet (Y3 + og Nd3 +) og som forberedt kjernen partikler (trinn 1.2.1). Det er også viktig at morfologi av kjerne-shell nanokrystaller er basert på Anisotrop skallet av ulike typer kjernen partikler, som er nyttig for modulerende forskjellige optisk utslipp av UCNs på NIR lys belysning23.
I tillegg er det også en betydelig utfordring effektivt konvertere hydrofobe UCNs til hydrofile UCNs nanopartikler for videre biologiske søknader. Selv om noen metoder har blitt rapportert å forbedre biokompatibilitet av UCNs i buffer løsning, inkludert ligand exchange, silica belegg, oleate-capping ligand oksidasjon, etc., de lider uventet aggregering, tidkrevende, og komplekse prosedyrer24,25,26. Her, vi utvikle en enkel tilnærming for å få vann-dispergerbare ligand-fri UCNs nanostrukturer ved å fjerne oljesyre på overflaten av oleate-capped UCNs i en syre vann (pH = 4). PH verdien justert av HCl er viktig å kontrollere utgivelsen av oleate ligand og påvirke luminescence av UCNs. Enda viktigere, en biokompatible polymer (polyacrylic acid, PAA) med et stort antall carboxyl grupper kan koble med transisjonsmetall ioner på overflaten av UCNs av koordinering interaksjon, som vil gi mer funksjonelle grupper for ytterligere kjemisk modifisering. Derfor vi functionalize DBCO-NH2 moieties på overflaten av UCNs for ytterligere bestemt N3-merket celle membran lokalisering. TEM bilder av ligand-fri UCNs PAA-UCNs og DBCO-UCNs i figur 2 viser den store dispersity og Løseligheten av disse nanostrukturer i buffer løsning etter overflate endring. I tillegg ble fourier transform infrarødspektroskopi for (FTIR) utført for å karakterisere overflaten endring av DBCO grupper på UCNs nanoplatform. Som vist i Figur 3, sterk bandet rundt 3,430 cm-1 skyldes H-O strekker vibrasjoner av carboxyl grupper, og de to bandene sentrert i 1550 cm-1 og 1458 cm-1 er tilknyttet den asymmetriske og symmetrisk strekker vibrasjonsmodi av carboxylate anioner, indikerer vellykket belegget av COOH gruppe inneholder polymerer (PAA) på UCNP overflaten. Etter reaksjon med DBCO-NH2 moieties finnes en tydelig band på 1,635 cm-1 basert på C = C strekk på den aromatiske ringen av DBCO grupper, hvilke er gjennomført med FTIR spekteret av DBCO-NH2 moieties på samme wavenumber. Videre dynamisk lysspredning (DLS) resultatet indikerer økt etter diameteren på DBCO-UCNs i vandig løsning (96.4±10.4 nm) (figur 4A). Zeta potensielle resultatene også angi negative overflaten av PAA-UCNs (-26.1±4.4 mV) og DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) henholdsvis (figur 4B), viser den store løselighet og stabilitet av disse nanostrukturer i buffer løsning. I tillegg til UCL spectra PAA-UCNs og DBCO-UCNs viser at de kan sende lignende upconverted utslipp på 480 nm på 808 nm lys bestråling (figur 4C), som kan benyttes for videre NIR lys-mediert photoactivation i biologisk systemer.
Som en proof-of-concept, for å vise bioapplication av functionalized UCNs i levende celler, er en lys-gated kanal protein (ChR2) konstruert på celleoverflaten til å regulere cellular funksjonene formidling tilstrømningen av cation ioner (f.eks, Ca2 +) i cytoplasma27,28,29. Vellykket uttrykk for ChR2 på membranen av HEK293 celle linjen er bekreftet av tilstedeværelsen av grønne fluorescerende protein (GFP) markøren (Venus) bruker AC confocal mikroskopi (figur 5A). Videre lokalisering av UCNs på N3-merket celle membran er tydelig visualisert på celleoverflaten (blå) etter 2t inkubasjon som kan tilskrives at de gjenværende DBCO gruppene på overflaten av UCNs nanostrukturer er farget med en azide inneholder fluorescerende farge (5-carboxytetramethylrhodamine-azide, Rhod-N3) gjennom bioorthogonal kobber-fri Klikk reaksjon. Videre NIR lys (808 nm) benyttes for å irradiate lokaliserte UCNs nanotransducer på celleoverflaten, som kan aktivereChR2 lys-gated kanal proteiner og rette Ca2 + ion strøm over membranen. Som vist i figur 5B, en betydelig økning av røde fluorescens i stoffer er observert av en standard fluorescerende Ca2 + indikator, Rhod-3 AM, mens ingen tydelig fluorescens tilvekst registreres i fravær av lys belysning. Kvantitativ flyt cytometri (FCM) analyse i figur 5C også viser at slike NIR-lys-responsive fluorescens ekstrautstyr er lys-doseavhengig, tydelig antyder at de biokompatible DBCO-UCNs kan effektivt regulere den kanal proteiner på cellemembranen på NIR lys bestråling.
I sammendraget, basert på nevnte resultatene, forventer vi at den nåværende protokollen gir ikke bare detaljert eksperimentelle prosedyrer for høy temperatur co nedbør syntese av kjerne-shell UCNs nanostrukturer, men utvikler også en enkel teknikk for biokompatible overflaten endring av UCNs for ytterligere NIR lys-mediert photoactivation i biologiske programmer. Enda viktigere, basert på begrunnelsen bak denne metoden, den optiske egenskapene av UCNs kan videre justeres av forskjellige typer transisjonsmetall ioner (f.eksErbium (III), Holmium (III), etc.) i krystaller å avgi UV, grønn, rød, og NIR lys på 808 nm lys bestråling30. Videre kan UCNs overflaten også endres med ulike funksjonelle grupper (f.ekspeptid protein, lipid, målretting ligand, etc.) for ytterligere biomedisinsk programmer31,32. Disse fordelene gjør biokompatible UCNs nanomaterial en passende kandidat for studiet av fysiologiske prosesser i vitro og i vivo, og kan dermed fungere som personlig nanomedicine for klinisk theranostics i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av NTU-AIT-MUV NAM/16001 EnergiledelsesSystemer, RG110/16 (S), (RG 11/13) og (RG 35/15) tildelt Nanyang Technological University, Singapore og National Natural Science Foundation av Kina (NSFC) (nr. 51628201).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
| oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
| Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
| Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
| Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
| Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
| Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
| Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
| Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
| Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
| polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
| Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
| HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
| opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
| N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
| Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
| 5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
| Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
| 1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
| Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
| Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
| 12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
References
- Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10 (12), 968-973 (2011).
- Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543 (7644), 229-233 (2017).
- Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28 (24), 3987-4011 (2016).
- Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
- Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136 (6), 2248-2251 (2014).
- Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44 (6), 1416-1448 (2015).
- Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3 (5), 317-330 (2013).
- Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51 (25), 6121-6125 (2012).
- Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
- Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6 (8), 560-564 (2012).
- Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22 (30), 3266-3271 (2010).
- Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4 (1), 129-154 (2014).
- Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44 (6), 1346-1378 (2015).
- Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25 (28), 3758-3779 (2013).
- Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1608-1634 (2015).
- Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
- Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54 (27), 7915-7919 (2015).
- Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11 (2), 835-840 (2011).
- Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44 (6), 1379-1415 (2015).
- Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F. Photon upconversion in core-shell nanoparticles. Chem Soc Rev. 44 (6), 1318-1330 (2015).
- Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9 (7), 1634-1644 (2014).
- Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1680-1713 (2015).
- Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51 (13), 3125-3129 (2012).
- Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1526-1560 (2015).
- Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45 (36), 14101-14108 (2016).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56 (11), 3031-3035 (2017).
- Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5173-5178 (2016).
- Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47 (10), 3052-3060 (2014).
- Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9 (11), 3698-3718 (2017).
- Ai, X., Mu, J., Xing, B. Recent Advances of Light-Mediated Theranostics. Theranostics. 6 (13), 2439-2457 (2016).
