Summary
Un protocole simple pour la surexpression et la purification de la cis- prényltransférase humaine optimisée par codon, dans des conditions non dénaturantes, d' Escherichia Coli , est décrit, avec un dosage d'activité enzymatique. Ce protocole peut être généralisé pour la production d'autres protéines de cis- prenyltransférase en quantité et en qualité adaptées aux études mécanistiques.
Abstract
Les prényltransférases (PT) sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l'aide d'isopentényl diphosphate (IPP) par de multiples réactions de condensation. DHDDS (déshydrodolichyl diphosphate synthase) est une e-eucaryote à longue chaîne cis -PT (formant des doubles liaisons cis de la réaction de condensation) qui catalyse l'allongement de la chaîne du farnesyl diphosphate (FPP, un diphosphate allylique) par de multiples condensations avec le diphosphate d'isopentényle (IPP). DHDDS est d'une importance biomédicale, car une mutation non conservatrice (K42E) dans l'enzyme résulte en une rétinite pigmentaire , entraînant finalement la cécité. Par conséquent, le présent protocole a été développé afin d'acquérir de grandes quantités de DHDDS purifié, adapté aux études mécanistiques. Ici, l'utilisation de la fusion de protéines, des conditions de culture optimisées et l'optimisation des codons ont été utilisées pour permettre la surexpression et la purification de DHDDS humain fonctionnellement actif dans
Introduction
Les prenyltransférases sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l'aide d'isopentényl diphosphate (IPP) via de multiples réactions de condensation 1 , 2 . Z enzymes de type catalysent la formation de doubles liaisons cis à partir de la réaction de condensation, alors que les enzymes de type E catalysent la formation de double liaison trans 3. Les cis- phényltransférases ( cis -PT, enzymes de type Z) sont classiquement classées en fonction de leur longueur de chaîne de produit en chaîne courte (C 15 ), moyenne chaîne (C 50-55 ) et longue chaîne (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) est un cis -PT à chaîne longue eucaryote qui catalyse l'allongement de la chaîne du farnesyl diphosphate (FPP, un diphosphate allylique) par de multiples condensations avec le diphosphate d'isopentényle (IPP) 1, 5 , 6 . Il en résulte la formation de déshydrodolichyl diphosphate, un diphosphate de polyprinyle C 55-100 servant de précurseur pour le dolichylpyrophosphate, la molécule de support de glycosyle impliquée dans la glycosylation 1 de la protéine N. Parmi les juifs ashkénazes, une mutation non conservatrice à l'échec (K42E) dans DHDDS entraîne une rétinite pigmentaire autonome récessive 7 , 8 . Par conséquent, le présent protocole a été développé afin d'acquérir des DHDDS purifiés pour les études mécanistiques.
Escherichia coli est considérée comme l'hôte le plus pratique et le plus rentable pour l'expression de protéines recombinantes et est donc également l'hôte le plus utilisé. Cependant, lorsque l'on tente de surexprimer de manière hétérologue les protéines dans E. coli , des considérations spécifiques aux protéines devraient être faites. Obtenir correctement plié, activéE protéines recombinantes d' E. coli , n'est pas une question simple en raison des propriétés distinctes de différentes protéines. De nombreuses approches ont été développées pour surmonter ces obstacles. Ici, l'utilisation de la fusion de protéines, des conditions de culture optimisées et l'optimisation des codons ont été utilisées pour permettre la surexpression et la purification de DHDDS humaines fonctionnellement actives dans E. coli . Il est à noter qu'une tentative précédente de surexpression de la levure de cis -PT sans fusion de protéines a été infructueuse en raison de l'insolubilité complète, même en présence de détergent 12 . Le protocole décrit est simple, rentable, épargnant du temps et permet d'obtenir des préparations DHDDS adaptées aux études mécanistiques. Compte tenu de l'homologie de cis -PT parmi les différentes espèces, nous suggérons que ce protocole puisse être appliqué pour d'autres eucaryotes cis -PT aussi.
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Protocol
1 . Clonage de cis -PT pour surexpression à E. coli
- Obtenir le vecteur d'expression pET-32b, conçu pour le clonage et l'expression de haut niveau de séquences de protéines fusionnées avec la protéine 17aa thioredoxine (TRX) 17 et la séquence de codage 18 codée par E. codifié E. coli de cis -PT à longueur totale.
- Prenez soin d'avoir un site de clivage TEV-protease (protéine du virus de la gravité du tabac) (ENLYFQ / G, où "/" indique le point de clivage) 9 suivi d'un petit lieur flexible (SGSGSG, pour améliorer l'accessibilité du site de clivage) en amont du cis - séquence de TP ( Figure 1 A ). Ajoutez également des sites de restriction 5 'et 3' appropriés pour le clonage.
- Cloner la construction d'ADN synthétisée dans le vecteur pET-32b en utilisant des techniques de ligature standard 10 .
2. OverexpreSsion de Human DHDDS à E. coli
- Transformer E. coli T7 exprimer les cellules compétentes avec la construction DHDDS TRX-fusion selon les instructions du fabricant.
- Placer les cellules transformées selon les instructions du fabricant sur la LB-agar dans des conditions sélectives à l'ampicilline (200 mg / L).
- Inoculer des colonies sélectionnées dans 100 ml de milieu LB dans 250 mL de flocons de cultures initiales avec 100 mg / L d'ampicilline et incuber pendant une nuit à 37 ° C avec un tremblement constant à 200 tr / min.
- Inoculer 80 mL de la culture dans deux flacons de 5 L (40 mL par flacon), chacun contenant 1,5 L de milieu 2x YT (16 g / L de triptonne, 10 g / L d'extrait de levure, 5 g / L de NaCl) avec 100 mg / L ampicilline.
- Incuber la culture à 37 ° C avec un tremblement constant à 180 tr / min jusqu'à atteindre OD 600 nm = 0,5.
- Abaisser la température à 16 ° C et induire les cellules en ajoutant 0,5 -mm isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ConContinuer à incuber dans le même état pendant 16-20 h pour l'expression des protéines.
- Récolter les cellules par centrifugation (10 000 x g pendant 10 min).
Remarque: Le protocole peut être mis en pause ici; Le culot des cellules doit être maintenu à -80 ° C jusqu'à purification.
3. Purification de DHDDS humain
- Remettre en suspension les cellules dans du tampon A (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 à 0,1%, 10-β-mercaptoéthanol 10 mM), 1 μg / mL d'ADNase I et un mélange inhibiteur de protéase.
- Homogénéiser les cellules en utilisant un homogénéisateur verre-teflon.
- Perturber les cellules en utilisant un microfluidiseur ou équivalent à 12,000 - 15,000 psi 11 .
- Centrifuger le lysat cellulaire à 40 000 xg pendant 45 minutes à 4 ° C. Récupérer le surnageant, contenant la fraction soluble.
- Charger le surnageant sur une colonne de 5 à 10 ml de chromatine d'affinité avec du cobalt-immobilisé (Co 2+ -MIAC) 12 avec 10MM d'imidazole, suivi d'un lavage approfondi avec un tampon A et 10 mM d'imidazole pour réduire la liaison des protéines non spécifiques.
- Eluire les protéines surexprimées avec un tampon A complété par 250 mM d'imidazole.
- Enlever l'imidazole en utilisant une colonne de dessalage preparatif de 53 ml équilibrée avec le tampon A.
- Ajouter une protéase TEV marquée par 6xHis (1 mg de protéase TEV par protéine 50 mg) aux protéines éluées pour éliminer leur protéine de fusion TRX marquée par 6xHis à 4 ° C pendant une nuit.
- Charger les protéines clivées sur une colonne Co 2+ -IMAC, équilibrée avec un tampon A additionné d'imidazole 5 mM, pour éliminer la protéine de fusion TRX et la protéine TEV scindée à 6x.
- Recueillir l'écoulement et concentrer à 3 - 4 mL en utilisant un filtre centrifuge coupé 30 KDa de poids moléculaire.
- Charger la protéine concentrée sur une colonne de Chromatographie d'exclusion de taille superdex-200 équilibrée avec un tampon A pour purification finale. La protéine élue comme un dimère (~ 76 kDa). Sélectionnez les fractions appropriées en comparant le profil d'élution à une courbe d'étalonnage de colonne.
- Évaluer la pureté de la préparation en utilisant SDS-PAGE.
- Déterminer la concentration de protéines nécessaire à l'expérimentation en aval et alliper les aliquotes de protéines concentrées purifiées dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
4. Chromatographie analytique de taille-exclusion (SEC)
- Pour assurer la capacité de la protéine à endurer les cycles de congélation-décongélation, décongeler une aliquote des protéines congelées et centrifuger à 21 000 x g pendant 10 minutes pour éliminer les agrégats insolubles. Recueillir le surnageant.
- Charger les protéines sur une colonne analytique superdex-200 pré-équilibrée avec Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 à 0,02%, 10 -mercaptoéthanol 10 mM, en utilisant un système de Chromatographie liquide à ultra-performance 13 , 14 .
- Surveiller le fluide tryptophaneScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) pour détecter le profil d'élution éluant des protéines. Assurez-vous d'avoir une courbe d'étalonnage valide pour l'évaluation du poids moléculaire - ces courbes sont disponibles via les fabricants de colonne SEC.
5. Enzyme Kinetics - Temps dépendant Activité 15 , 16 , 17
- Afin d' assurer l'activité de la protéine purifiée, mélanger 5 uM de DHDDS purifiés avec 10 uM et 50 uM FPP 14 C-IPP pour initier la réaction dans le tampon A avec 0,5 mM de MgCl2 à 22 - 30 ° C.
Remarque: Les conditions de réaction exactes peuvent varier selon les préparations de cis -PT différentes de DHDDS. En outre, l'activité de DHDDS dépend également de la température et [Mg 2+ ].
Attention: 14 C-IPP est radioactif et doit être utilisé conformément aux réglementations locales en matière de radioprotection. Retirer 15 μL d'échantillons de la réaction à 0, 2, 4 et 6 h, après immersion immédiate de la réaction par addition de 15 μL de tampon A 20 mM d'EDTA 20 mM (jusqu'à une concentration finale d'EDTA 10 mM). - Ajouter 1 ml de 1-butanol saturé à l'H 2 O et tourbillonner à fond pour extraire les produits de réaction.
Remarque: Le protocole peut être arrêté ici et les échantillons peuvent être conservés pour une lecture ultérieure. - Ajouter un cocktail de scintillation aux échantillons et, à l'aide d'un compteur de scintillation, quantifier les produits de réaction dans la phase de butanol englobant 14 C, conjointement avec la radioactivité de 15 μL du mélange réactionnel, ce qui représente la radioactivité totale.
- Soustraire les lectures d'arrière-plan mesurées en utilisant les échantillons de 0 h de chaque point de temps et calculer le pourcentage de 14 C-IPP utilisé.
- Calculer l'incorporation nette de 14 C-IPP à chaque point de temps en calculant le pourcentage utilisé à partir du total 14 14 C-IPP avec le temps est attendue.
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Representative Results
Un aperçu général de la construction utilisée ici et le processus de purification sont illustrés à la figure 1 . Les échantillons obtenus à chaque étape de purification sont représentés sur la figure 2 . Cette analyse SDS-PAGE montre la purification par étapes de DHDDS, ce qui donne un produit hautement purifié. La figure 3 montre les résultats de la SEC analytique de l'enzyme purifiée, révélant que la protéine n'est observée que comme homodimère. La figure 4 montre un dosage d'activité représentatif du temps. 14 L'incorporation de C-IPP augmente clairement pendant 6 h, en vérifiant que l'enzyme purifiée est fonctionnelle.
Figure 1: Clonage et purification DHDDS humain . (
Figure 2: Purification de DHDDS humain . Analyse SDS-PAGE des étapes de purification d'affinité DHDDS humaines. Voie 1, marqueur de poids moléculaire (kDa); Voie 2, extrait brut; Lane 3, Co 2+ -IMAC flow-through. La flèche indique la protéine de fusion TRX-DHDDS; Lane 4, élu Co 2+ -IMAC; Lane 5, protéine-TEV protéase mélange suite à une incubation pendant la nuit; Lane 6, Co 2+ -IMAC flow-through suivant le clivage TEV; Lane 7, éluant Co 2+ -MIAC suite au clivage TEV; Voie 8, DHDDS humain purifié (indicPar une flèche) après la chromatographie d'exclusion de taille. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Analytical SEC of Purified Human DHDDS. La fluorescence du tryptophane a été surveillée comme décrit dans le protocole. Selon la courbe d'étalonnage de cette colonne, DHDDS forme un homodimère (77,4 kDa). La flèche indique le volume vide. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : TiActivité dépendante de moi de DHDDS humain purifié. L' activité in vitro de DHDDS humaine purifiée dans la réaction avec 10 μM FPP et 50 μM 14 C-IPP comme substrat est exprimée sous forme d'incorporation d'IPP par protéine (mol / mol). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ici pour la purification de la DHDDS humaine fonctionnelle dans les cellules de E. coli est simple et efficace, permettant de surexprimer et de purifier la protéine en 3 à 4 jours une fois qu'une construction appropriée est disponible. De tels protocoles pour la purification des protéines sont d'une importance particulière compte tenu des percées dans le séquençage du génome, ce qui a fourni une pléthore d'informations concernant la génétique de nombreuses maladies 18 , ce qui nécessite le développement de méthodes à haut débit pour caractériser les mécanismes pathogènes au niveau des protéines 19 .
Pour surmonter les pièges communs dans la surexpression et la purification des protéines hétérologues, plusieurs mesures ont été prises ici, ce qui est essentiel pour obtenir des protéines solubles et fonctionnelles avec succès. Tout d'abord, DHDDS a été surexprimé en tant que TRX-fusion. TRX facilite le pliage de protéines de fusion et augmente la solubilité de la protéine de fusion, empêchant l'inclusion bFormation hippie 20 . Ensuite, pour augmenter le rendement en protéines, la construction d'ADN a été optimisée par codon pour l'expression dans E. coli 21 . Enfin, pour réduire davantage la probabilité d'inclusion de la formation du corps, l'expression de la protéine a été induite à 16 ° C pour ralentir le taux de synthèse des protéines, ce qui pourrait aider le pliage des protéines 22 .
En tenant compte de l'homologie de cis -PT entre différentes espèces, nous suggérons que ce protocole puisse être appliqué pour d'autres eucaryotes cis -PT aussi 1 . En utilisant le protocole actuel comme point de départ, et compte tenu des directives générales critiques pour l'expression DHDDS, cette méthode peut être modifiée pour une expression optimale de différents CP- cis . Par exemple, on peut tenter différents partenaires de fusion (tels que la protéine de liaison au maltose) ou encore optimiser les conditions de culture pour la protéine spécifique à étudier.
<P class = "jove_content"> Avec leur signification biomédicale et biotechnologique 1 , 7 , 8 , l'utilisation future du protocole décrit pour obtenir de grandes quantités de DHDDS fonctionnel purifié, ainsi que d'autres cis -PT, permettant la poursuite de leur caractérisation structurelle et fonctionnelle . Par exemple, d'autres études moléculaires de DHDDS résoudront les mécanismes qui sous-tendent la rétinite pigmentaire liée à DHDDS, ce qui pourrait conduire à la découverte et au développement de nouvelles approches thérapeutiques. En outre, comme les composés cis -PT procaryotes sont impliqués dans la synthèse de la paroi bactérienne, ce groupe d'enzymes peut former de nouvelles cibles pour les nouveaux agents antibactériens. En effet, une caractérisation approfondie des études des enzymes eucaryotes et procaryotes peut permettre le développement rationnel de médicaments antimicrobiens sélectifs pour le cis -PT procaryote. Enfin, comme le caoutchouc naturel est synthétisé bY membres de la famille cis -PT, l'approche décrite ici peut trouver une utilisation future dans la synthèse industrielle du caoutchouc naturel.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Centre d'excellence en recherche (I-CORE) de la Science Israel Science Foundation (1775/12) et la Fondation scientifique israélienne accorde 1721/16 et 2338/16 (YH) et 825/14 (DK ). Le soutien de Fields Estate Foundation à DK est très apprécié. Ce travail a été réalisé par Ilan Edri et Michal Goldenberg dans l'accomplissement partiel des exigences de thèse MD de la Faculté de médecine de Sackler, Université de Tel Aviv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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