Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Laminotomy för ländryggen dorsalrotsganglier Ganglion tillgång och injektion hos svin

doi: 10.3791/56434 Published: October 10, 2017

Summary

Vi beskriver en metod för laminotomy hos svin som ger tillgång till ländryggen dorsalrotsganglier (DRG) intraganglionic injektionsvätska. Injektion är övervakas intraoperatively och histologiskt bekräftat upp till 21 dagar efter operation. Detta protokoll kan användas för framtida prekliniska studier med DRG injektion.

Abstract

Dorsalrotsganglier (DRG) är anatomiskt väl definierade strukturer som innehåller alla primära sensoriska nervceller under chefen. Detta faktum gör DRG attraktiva mål för injektion av nya behandlingar som syftar till att behandla kronisk smärta. I små djurmodeller, har laminektomi använts för att underlätta DRG injektion eftersom det innebär kirurgiskt avlägsnande av det vertebrala benet kring varje DRG. Vi visar en teknik för intraganglionic injektion av ryggradens DRG i en stor djurart, nämligen svin. Laminotomy utförs för att ge direkt tillgång till DRG använder standard Neurokirurgiska tekniker, instrument och material. Jämfört med mer omfattande bone borttagning via laminektomi, genomför vi laminotomy för att bevara spinal anatomi samtidigt uppnå tillräcklig DRG åtkomst. Intraoperativa förloppet för DRG injektion kontrolleras med hjälp av en giftfri färg. Efter eutanasi på postoperativ dag 21 avgörs framgången för injektion av histologi för intraganglionic distribution av 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI). Vi injicerar en biologiskt inaktiva lösning för att visa protokollet. Denna metod kan vara tillämpad i framtiden prekliniska studier till målet terapeutiska lösningar på DRG. Vår metodik bör underlätta testning i översättbarhet av intraganglionic små djur paradigm i en stor djurarter. Dessutom kan detta protokoll tjäna som en viktig resurs för dem som planerar prekliniska studier av DRG injektion hos svin.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dorsalrotsganglier (DRG) är anatomiskt diskret, neuronala samlingar ligger längs ryggraden. Varje DRG innehåller den primära sensoriska nervceller som koda och relä perifera stimuli till det centrala nervsystemet (CNS) från specifika kroppen regioner. Exempelvis börjar smärtan av artros när smärtreceptorer som ligger ca en gemensam uppfattar skadliga stimuli. Denna process kallas nociception. Långsiktiga medvetenheten om skadliga stimuli leder till kronisk smärta 1.

Kronisk smärta är ofta föremål för preklinisk studie 2 där ett mål är att utveckla användbara metoder för riktade leverans av analgetika till DRG, såsom intraganglionic injektion 3. DRG är dock svåra att komma åt eftersom de är bosatta inom boney intervertebral foramina 4. Flera grupper har framgångsrikt övervinna detta hinder genom användning av ryggkirurgi i gnagare 5,6,7,8,9,10.

I kliniken, laminektomi är en gemensam operation i ryggraden och refererar till kirurgiskt avlägsnande av den vertebrala lamina, därmed unroofing ryggradskanalen 11. Införlivandet av kirurgiska tekniker till direkta DRG tillgång har varit framgångsrika i gnagare 5,12, översättning kan emellertid orealistiskt att betrakta skillnader i storlek av relevanta strukturer och hur det påverkar farmakokinetik eller teknisk genomförbarhet 13,14. Till exempel fastställt en studie tvärgående ryggmärgen diametern på T10 vara 3.0, 7.0 och 8,2 mm för råtta, gris och människa, respektive 15. Således modeller stort djur bättre ungefärliga mänskliga dimensioner av nervös strukturer.

Hos svin används Raore et al. multi-level laminektomi för att få tillgång till den cervikala ryggmärgen för flera intraspinala injektioner 16. Behandlingen tolererades väl och ledde till en fas I klinisk prövning där jämförbara kirurgiska resultat var dokumenterade 17. Dessa resultat uppmuntra fortsatt användning av prekliniska stora djurmodeller som prediktorer för teknisk genomförbarhet och säkerhet hos människor.

Hittills finns ingen detaljerad metod för kirurgiska tillgång och injektion av DRG i en stor djurarter. För att begränsa denna translationell lucka, rapporterar vi ett protokoll för DRG exponering och injektion via laminotomy hos svin. Standard Neurokirurgiska tekniker, instrument och material användes och metoden var utformade för att efterlikna modern kirurgisk praxis. Vi demonstrerar intraganglionic injektion med en vattenlösning för ländryggen DRG och bekräfta framgångsrik leverans via histologi efter postoperativ dag 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Mayo Clinic.

1. förutsättningar av stringens och reproducerbarhet

  1. att säkerställa noggrannheten i design, följer nationella standarder för god laboratoriesed praxis vid alla tidpunkter och få inre godkännande av IACUC (eller liknande kommitté) före varje djur engagemang i experiment.
    Obs: Detta protokoll var avsedd att upprätthålla en kliniskt trogen strategi. Alltså beskrivs det material, instrument och tekniker som används på ett sätt som är identiskt med de högsta kliniska normerna hos människor. Exempelvis strikt steril teknik följs och utgångna material bör aldrig användas.
  2. Att stödja reproducerbarhet av denna metod i en experimentell miljö, utveckla interna standardrutiner och styra för variabilitet i svin ras, vikt, kön och ålder mellan separata kohorter.
    Obs: Utformningen av detta protokoll var baserade på användning av svin som väger 38-53 kg.

2. Preoperativ djur hand

  1. Administrera profylaktisk intramuskulärt (IM) ceftiofur, ges vid 5 mg/kg, 1 dag före proceduren.
  2. Snabb djur av fast föda och begränsa djur från kosmetiska behandlingar, dvs olja bad, 12 h före proceduren.
  3. Framkalla narkos inom 1 h i förfarandet, med hjälp av IM Tiletamin och zolazepam, ges som Telazol på 5 mg/kg, och IM xylazin, ges vid 2 mg/kg.
  4. När inducerad, administrera subkutana (SC) buprenorfin ihållande release (SR), med tanke på 0,18 mg/kg.
  5. Placera en ear-ven katetern och utföra snabb följd intubation för att placera en endotrakealtub.
  6. Bifoga en pulsoximeter med hjärtfrekvens övervakning funktion att tungan för att övervaka syresättning och hjärtfrekvens.
  7. Placera djuret i liggande position och klippa huden över handryggen med en elektrisk clipper. Klippa hår över ett stort, bilaterala område sträcker sig från mittlinjen sagittalplanet till mittlinjen koronalt planet och longitudinellt från den sakrala apexen till skulderblad taggar. Använd tejp för att ta bort hår och friflytande hud.
  8. Skrubba området klippt upp till 3 gånger med varmt vatten och tvål och torka huden med en luddfri handduk.
  9. Mark bilaterala anatomiska landmärken använder en kirurgisk märkning penna. Markera den sista revben, iliaca kammar, spindelkrabba processer och tvärgående processerna.
    Obs: Genom att markera den sista revben, iliaca kammar och tvärgående processer, ländryggen är avgränsat längs dess överlägsna, sämre och laterala gränser, respektive. Detta protokoll har utformats för att vägleda tillgång och injektion av någon ländryggen DRG sevärdheter. För referens, överlägsen iliaca kammar anpassa nivån L3 eller L4 vertebrala.
  10. Täcka djuret med en varm filt för transport till operativa sviten.

3. Positionering i operativa Suite

  1. försiktigt lift och ställning djuret benägna till en modifierad stor Human djur sele med vadderad buk bländare.
    Obs: Buken bländare möjliggör minskning av buktryck liknar Wilson ramen används under mänskliga kirurgi av ryggraden. Detta minskar i sin tur intraoperativ blödning från spinal blodkärlen. Selen är fördelaktigt eftersom benen får hänga fritt genom vadderad öppningar som skyddar djuret mot perifera nerver impingement. Men eftersom sling stomme av metall, bör det vara stoppad med isolering för att undvika elektrisk kortslutning och oavsiktlig djur bränna. En filt rulle kan placeras för att placera huvud och hals i en bekväm ställning, beroende på djurets storlek.
  2. Underhåll narkos med 1-3% inandning (IH) isofluran, titreras till effekt. Fukta ögonen med oftalmologiska salva och försiktigt tejpa dem shut.
  3. Plats rader för övervakning av vitala tecken till dokumentet temperatur, blodtryck, puls och syresättning. Övervaka ventilation av capnography.
  4. Placera en självhäftande, disponibel elektrokirurgiska dispersiva elektroden över vänstra eller högra skulderbladet.
  5. Administrera värmde laktat Ringer ' s som underhåll vätskor genom örat-ven katetern. Ge vätska med en hastighet på 5-10 mL/kg/h.
  6. Placera en Tvingad-luft uppvärmningen enheten över regionen thorakala och cervikala och undvika täcker sista revbenen.

4. Sterila utarbetandet av operativa fältet en vänstersidig injektionsvätska

Obs: från denna punkt framåt, fortsätter i strikt steril mode.

  1. Förbered huden överliggande ländryggen början med bred tillämpning av 0,7% jod povacrylex och 74% isopropylalkohol enligt tillverkaren ' anvisningar. För att säkerställa att guide nålen senare kan placeras i en steril mode, lateralize tillämpning vid sidan av planerade injektion genom att utvidga antisepsis mot mittlinjen koronalt plan tidigare markerade tvärgående processerna.
  2. Placera kirurgiska engångshanddukar i rektangulära mode att beskriva webbplatsen planerade snitt, vilket är över mittlinjen längs de Markera ländryggen spindelkrabba processerna.
  3. Applicera en adhesiv som är antimikrobiell incisionsfilm drapera över de operativa handdukarna och utsatt hud. Klämma draperier på plats och utöka draperi kanten av fältet operativa.
  4. Säkra en vertikal draperi till polerna på huvudet av lyftselen mellan det operativa fältet och den övervakning teknikern.
  5. Secure linjer för sug- och elektrokirurgi inom operativa av fastspänning till de sterila draperier. Passera de fria ändarna av rör och kablar ur det sterila fältet.

5. Huden snitt och Subperiosteal dissektion

  1. palpera de lumbala spindelkrabba processerna längs mittlinjen och identifiera 3 på varandra följande vertebrala nivåer.
  2. Använda #15 skalpell för att öppna ett 8-12 cm mittlinjen sagittala snitt genom incisionsfilm drapera direkt posteriort spindelkrabba processerna. Bibehålla hemostas med gasväv tamponad och monopolär elektrokirurgi.
    Obs: Bör vara försiktig att inte avvika från mittlinjen som snittet är avancerade i anterior riktning eftersom detta begränsar blödning från paraspinal musklerna. Periodiska palpation för spindelkrabba processer underlättar avancemang. Själv behåller Weitlaner, Meyerding eller Gelpi upprullningsdon kan placeras och flyttas som behövs för att underlätta dissektion. Sug används för att upprätthålla synlighet.
  3. Dissekera den subkutana vävnaden och fett med monopolär elektrokirurgiska tills torakolumbala fascian nås. Palpera spindelkrabba processer djupt till torakolumbala fascian och skär fascian längs mittlinjen att exponera den supraspinous ligament som spänner mellan spindelkrabba processer.
    Obs: Torakolumbala fascian identifieras som en organiserad, aponeurotic skidan med en bindväv-säd som väver samman i en sned, lateral till medial riktning. Vid denna punkt, snittet kan förlängas i antingen bättre eller sämre riktning så att 3 spindelkrabba processer är fullt synlig med Center spindelkrabba processen linje i mitten av fältet dissektion.
  4. Använda ett #15 blad för att placera en 2 mm djupa parasagittal snitt genom den supraspinous ligamentet posteriort varje spindelkrabba process. Placera varje snitt längs den vänstra tredje av den bakre ytan av spindelkrabba processen.
  5. Försiktigt släppa den supraspinous ligamentet på varje nivå längs varje incision använder en friare hiss 5-mm.
  6. Identifiera subperiosteal planet och dissekera inom detta plan längs den laterala ytan av varje spindelkrabba process.
  7. Utför subperiosteal dissektion vid varje spindelkrabba process i en parallell sätt att säkerställa att en mild, även dissektion uppnås.
  8. Incisionsfilm paraspinal muskel fastsättning längs interspinous utrymmen med monopolär elektrokirurgiska i konsert med subperiosteal dissektion.
  9. Identifiera lamina på varje nivå och fortsätta subperiosteal dissektion sidled för att nå den laterala kanten av 2 zygapophyseal lederna som ansluter 3 exponerade kotorna och nå den laterala kanten av lamina mellan lederna, kallas parsna interarticularis.
    Obs: De pars interarticularis är den bakre gränsen av intervertebral foramen vari DRG är bosatt. Ibland uppstår en liten ven en foramen ligger på den bakre ytan av lamina. Dessa vener har en tendens att brista under subperiosteal dissektion. Hemostas uppnås enkelt genom att använda en kombination av bipolär elektrokirurgi och ben vax appliceras till foramen.

6. En-nivå Laminotomy

  1. identifiera målet för laminotomy som den Center lamina ligger mellan och mediala till 2 zygapophyseal lederna.
  2. Spåra lamina till sämre kanten, till en punkt som bara mediala till sammanhängande sämre artikulära processen av stjärtfenan zygapophyseal gemensamma.
  3. Använd en 5 mm friare hiss eller kyrett för att palpera övergången mellan caudalmost kanten av lamina och centrala kanalen.
    Obs: Man är inte tvinga det palpating instrumentet främre som detta kommer att kontakta dural sac och ryggmärgen. Observera att ryggmärgen hos svin sträcker sig förbi den ländrygg 18. En intervertebrala rongeur kan användas för att ta bort extra mjuk vävnad överliggande detta område för att underlätta palpationen.
  4. Använd en 2 mm upp-bita, 45 graders Kerrison rongeur extrahera ben på ett piece-wise sätt. Ta bort ben längs basen av spindelkrabba processen mycket fint till en nivå som bara stjärtfenan på kaudala ytan av BLOMSTJÄLK och ut sidled till fullo.
  5. Använda vinklade ben rongeurs att hjälpa till med bone borttagning. Lämna den sämre artikulära process som var ansluten till lamina på plats tills laminotomy är i stort sett klar.
  6. Bekräfta att den sämre artikulära processen är fritt mobil och bifogade endast av zygapophyseal ledkapseln. Incisionsfilm kapseln med hjälp av en #15 eller #11 blad.
  7. Ta bort de sämre artikulära processen på ett piece-wise sätt men lämna den angränsande överlägsna artikulära processen intakt.
    Obs: Eftersom laminotomy är klar utförs hemostas med bipolär elektrokirurgi. Monopolar elektrokirurgiska används inte på grund av närheten av neurala strukturer. Ben vax kan placeras längs platser för blödning från utsatt ben och absorberbara Gelatinsvampar kan användas för att uppnå hemostas nära mjuk vävnad. Cottonoid är ett användbart verktyg för att veken serös vätska och blod från dissektion.

7. Dissektion av DRG

  1. Evacuate epidurala fettet i en piece-wise mode från ytlig till djup början medialt och fortsätter sidled. Ta bort fett genom skonsam dissektion med bipolär pincett och sug med 6-10 franska Frazier sug tips.
    Obs: Lupp förstoring eller användning av dissekera Mikroskop är bra att ge detaljnivån som behövs för att säkert evakuera epidurala fettet och uppnå noggrann hemostas av epidural venösa plexus med bipolär elektrokirurgi.
  2. Identifiera dural sac längs mittlinjen körs i en superoinferior riktning, parallellt med axeln av huden snittet. Ta bort epidural fett längs dural sac tills dural sac kan anses ge upphov till dural nerve root ärmen.
  3. Spåra dural hylsan sidled och inferiorly av epidural fat evakuering tills det syns att förstora runt DRG.
    Obs: Identifiera DRG för dess oval form och gult till orange färg. På mitten av lumbala ryggraden är DRG normalt 4-6 mm i storlek, längsta i mediala laterala riktningen, och ligger direkt sämre eller 2-3 mm mediala till dess respektive BLOMSTJÄLK. En trubbig, rätt-metade nerv krok kan användas att försiktigt palpera för BLOMSTJÄLK.
  4. Evakuera epidural fett i sidled förbi DRG, tills den angränsande spinal nerven ses.
    Obs: Om durotomy uppstår, reparera den genom vattentäta stängning med 6-0 nylon sutur och smidig micro nål föraren i en enkel rinnande stich.

8. Injektion av DRG

  1. Använd en 22 gauge spinal nål att vägleda banan för en 32-gauge konvektion förbättrade delivery (CED) nål. Punktering 22 gauge guide nålen genom muskler i hud och paraspinal.
    Obs: CED nålen är utformad för att uppnå vätska konvektion i vävnad, kallas även bulkflöde, på grund av trycket lutningar 19 , 20.
  2. Sikta guide nålen längs en bana som approximerar den längsgående axeln av DRG och resultat i nålspetsen framväxande från laterala paraspinal väggen i fältet dissektion.
  3. Fine tune sökvägen nålen tills nållumenet ligger i linje med mitten av DRG.
    Obs: Guide nålen bör aldrig tillåtas att kontakta DRG.
  4. Upprätta sterila injectate i en steril spruta och Anslut sprutan till sterila infusion slangen.
  5. Säkra slangen på CED nålen och lämna ut sprutan ur det sterila fältet. Anslut sprutan till en programmerbar sprutpumpen.
    Obs: Slang är beredd till en längd av 5 fot att säkerställa att sterilitet och rörlighet upprätthålls. Det är också av största vikt att inga luftbubblor införs i lösning.
  6. Avancerar i injectate tills uttryck är sett från CED kanylspetsen.
  7. Placera CED nålen inom guide nållumenet och avancera långsamt CED nålen tills framgår det guide nålspetsen. Se till att DRG inte punkteras under nålen justering.
  8. Fininställa guide nål position längs den långa axeln dess bana att avgöra den slutliga läge av CED spetsen.
  9. Secure guiden nål och CED nål tillsammans med samverkande nål hubs när djup och justering av guide och CED nålar uppnås.
  10. Bekräfta att alla injektion apparater anslutningar är fullt ut säkrade, inklusive guide nål, CED nål, och anslutna slangar laddad med injectate.
  11. Förväg guide nålen längs dess längdaxel att tillnärma CED nålspetsen och DRG.
  12. Punktera DRG med CED kanylspetsen.
  13. Doppa CED kanylspetsen i tredimensionella mittpunkt i DRG.
    Obs: eftersom DRG är en tredimensionell struktur av varierande storlek och form, DRG exponering måste slutföras för att exakt Placera nålspetsen CED sant i mitten av DRG. Det sanna DRG-centret är beläget i dess tre anatomiska axlarnas skärningspunkt, nämligen den främre till bakre, lateral till medial, och överlägsen underlägsna yxor.
  14. Levererar 100 μL av injectate av CED med hjälp av en graderad hastighet och volym av 3 steg.
  15. Levererar 4 μl på 2 μL/min för det första steget. Leverera 8 μl vid 4 μL/min för det andra steget. Leverera 88 μL 8 μl/min för det tredje och sista steget.
    Obs: Tillåter en 3-minuters paus mellan steg och efter det sista steget att tillåta tryck Jämviktstiden.
  16. Dra tillbaka injektion apparaten efter den sista injektionen steg och 3-minuters paus längs dess längdaxel i en jämn och skonsam motion.
    Obs: För injicerade lösningar som är färglösa, färgade färgämne ingår i lösningen vid en koncentration av 0,1% vikt/volym att bistå i visuell bedömning av injectate distribution 12. Också, det vitala färgämnet 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) ingår i lösning med en koncentration på 0,25 μg/μL när studiedesign kräver histologisk bedömning av injectate fördelning 5.

9. Avslutande

  1. Applicera 3 rundor av varm koksaltlösning bevattning till operationsområdet innan stängning att mobilisera och spola platsen för skräp, dvs benfragment. Använda sug för att återställa den saltlösning och skräp.
    Obs: Noggrann hemostas säkerställs när bevattning förblir klar. Hemostatiska medel (gelatinsvamp) och cottonoid avlägsnas vid denna tid. Se till att alla material och instrument har rensats från webbplatsen snitt före stängning.
  2. Använda en 3-lager teknik för stängning.
  3. Sutur av torakolumbala fascia med 0 sutur i en enkel, avbruten, noninverted mode. Placera en stich var 5-8 mm för att uppnå vattentäta stängning.
  4. Sutur den subkutana vävnaden med 2-0 sutur i en enkel, avbruten, inverterad mode med stygn placeras varje 5 - till 8-mm för att uppnå tillräcklig styrka.
  5. Nära huden med 0 sutur i en enkel, löpande eller avbruten mode.
  6. Använda en nål räknare så att inga vassa föremål är oredovisad for.
  7. Vattna huden med koksaltlösning, torka huden och placera plåster remsor vinkelrätt mot snittet.
  8. Plats gasväv ovanpå bandaget remsor och bifoga ett sista lim antimikrobiella incisionsfilm drapera.

10. Postoperativ djur hand

  1. Extubate, täck med varma filtar och transportera djuret att återhämtning.
  2. Följer standard institutionella operativa förfaranden för postoperativ övervakning och återhämtning från överlevnad kirurgi. På ett minimum, Observera djuret varje 15 min till återkomst av medvetandet, varje timme tills full narkos återhämtning uppnås, och två gånger dagligen därefter.
  3. Ge postoperativ smärtlindring genom att administrera IM eller muntliga karprofen, med tanke på 4 mg/kg en gång dagligen i 5 dagar börjar postoperativ dag 0. Administrera SC buprenorfin SR, ges på 0,18 mg/kg, en gång på postoperativ dag 2.
  4. Administrera postoperativ antisepsis genom att ge IM ceftiofur, ges vid 5 mg/kg, en gång på postoperativ dag 4.
  5. Ta bort bandaget på postoperativ dag 5-7. Ta bort suturerna när sårläkning är klar, vanligtvis på postoperativ dag 10-14.
  6. Ett humant sätt avliva djuret enligt standard institutionella operativa förfaranden när studien slutpunkten är nådd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Histologisk bedömning av injectate spridning
Framgångsrik leverans av injectate till DRG bestäms av histologisk bedömning av DAPI sprida. Tekniken innebär positionering kanylspetsen i stadens tredimensionella DRG. Därför, framgångsrik leverans bestäms genom att utvärdera omfattningen av DAPI färgning från histologisk sektioner både nära (centrala DRG avsnitt) och avlägsna (perifera DRG avsnitt) till nålspetsen. Figur 1A och figur 1B representerar en framgångsrik injektion av en DRG. DAPI färgning var jämnt spridda genom både centrala och perifera DRG parenkymet. Således, en framgångsrik DRG-injektion illustreras av den diffusa spridningen av DAPI färgning hela den tredimensionella DRG-arkitekturen. Suboptimal injektion illustreras av inkonsekvent färgning. Till exempel anger minimal färgning (figur 1 c) eller fokala färgning längs ytterkanten men inte inre aspekt av DRG parenkymet (figur 1 d) misslyckad injektion. Dessutom illustrerar betraktas tillsammans, figur 1 c (centrala DRG avsnitt) och figur 1 d (perifera DRG avsnitt) en brist på konsekvent färgning inom tre dimensioner för detta enda ländryggen DRG.

Figure 1
Figur 1 : Tredimensionella bedömningen av DAPI Distribution i injicerade DRG. (A) en mittdel från en injicerade ländryggen DRG som är representativa för ett lyckat resultat. Färgningen av markör färgämnet DAPI är jämnt spridda över hela den hela DRG i två dimensioner. (B) en parallell, perifera delen av den samma DRG (a), som illustrerar konsekvens av DAPI utspridda inom ett andra plan i avsnitt, bekräftar en framgångsrik injektion i tre dimensioner. (C) en mittdel från en injicerade ländryggen DRG som är representativa för ett optimalt resultat. Minimal till ingen färgning av DAPI ses förutom enstaka foci. (D) en parallell, perifer del av den samma DRG i (C), illustrerar delvis distribution av DAPI längs DRG periferin. Blå: DAPI. Red: autofluorescens. Skala barer = 500 μm (A och C), 100 μm (B och D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi försökte beskriva en metod för kirurgisk exponering av DRG via laminotomy och intraganglionic injektion i en hälsosam stora djurarter, specifikt, svin. Hos gnagare har en liknande metod för att leverera konventionell farmakologiska agenter 8,10 och virala vektorer 6,7,9,12 till DRG och detaljerad 12 . Resultaten från ovanstående små Djurstudier är lovande och vi hoppas våra protokoll kommer att bana väg för andra att översätta dessa tidigare fynd till svin. Friska och sjuka djur användes i ovanstående studier stöder nyttan av smådjur i preklinisk forskning. Oundvikligen, stora djurmodeller kommer att behöva göra bästa tillgängliga jämförelsen till människors DRG när det gäller storlek och injectate distribution. Skillnaderna i DRG storlek framgår exempelvis tydligt mellan råttor och människor. L5 DRG i vuxen, hanråttor mäter cirka 2,6 x 1,5 mm 5 jämfört med 11,6 mm x 6,6 mm i vuxen, manlig människor 21. Baserat på levande radiografisk mätningar hos svin, befanns L5 DRG vara cirka 8,0 x 6,0 mm 22. Därför ligger svin som särskilt användbar art för preklinisk studie på grund av strukturella likheter med människans nervsystem och närliggande rörelseorganens anatomi. Detta framgår av omvänd översättningen används för att utforma detta protokoll enligt som utförs på kliniken. Dessutom svin är användningen av djur och av ökande betydelse inom biomedicinsk forskning. Detta protokoll kommer att stödja prekliniska studier intraganglionic leverans av injicerbara lösningar att avancera tidigare fynd från arbete hos gnagare till stora djur. Detta protokoll kan därmed, främja nya strategier för behandling av kronisk smärta som integrerar anatomiskt selektiv leverans tekniker med romanen molekylärt selektiv ombud, som, vi förutsäga, kan ha potential att förvandla smärta medicin 3.

Ytterligare anteckningar framgångsrik DRG injektionsvätska

Prelaminar periostet på ländryggen vertebrala nivåer hos svin fortsätter kraniellt i stället för den ligamentum flavum. Under laminotomy, periostet lätt kan separeras genom placering av den Kerrison rongeur och kan imitera utseendet på dura mater. Det är ett viktigt steg för att skilja den ligamentum flavum, periostet, epidural fett och dura sac som dissektion utförs. Dessutom exponering av epiduralrummet är mer effektiv och medför mindre blödningar om periostet avlägsnas samtidigt med lamina. Om periostet inte tas bort tillsammans med ben, kan det vara anskäras med #11 blad och bort för att avslöja underliggande epidurala fettet.

För att inte skada är högprioriterat och detta måste balanseras med målet att DRG tillgång och injektion. Således tas hand inte att avancera evakueringen av epidural fett längre anteriorly eller anteromedially än som behövs för att möjliggöra positiv identifiering av dural sac, dural nerve root ärm och DRG. Dissektion i anteromedial riktning där dural sac ger upphov till dural nerve root hylsan är särskilt farligt som en längsgående epidural ven kommer att påträffas. Dissektion i denna riktning ökar dessutom risken för oavsiktliga durotomy, signalerat av utflödet av ryggmärgsvätska från ytan av dural sac.

En sista kritiska punkten är att identifiera dural sac, dorsal rötter, DRG i dess helhet, och spinal nerv. Detta hjälper till att upprätta 4 bitar av konvergerande anatomiska bevis för att säkerställa fullständig DRG definition. Definiera DRG i sin helhet krävs för att placera kanylspetsen på dess tredimensionella, som tillåter CED nålen att upprätta en konsekvent tryckgradient samtidigt maximera avståndet till omgivande anatomiska gränser. Både faktorer öka kraftigt volymer levereras och utbud av intraparenchymal sprida 19,20. Leverans av injectate på en plats som inte är sann anatomiska center resultaten i suboptimala injektion eftersom inkonsekvent påtryckningar leda när injectate läcker från den närliggande platsen DRG punktering 20.

En svårighet med hjälp av en CED nål DRG injektionsvätska är efterlevnad. När injektionen har startat, nålspetsen måste hållas så stilla som möjligt, annars trycket lutningar kommer att försvinna på grund av plötsliga förändringar i överensstämmelse 20. Respiratoriska rörelse är en källa till kontinuerlig rörelse under injektionen. Men är risken för nålen rörelsen sekundärt till respiratorisk utflykt till stor del bort genom att förankra CED och guide nålen inom de paraspinal muskulatur före punktion av DRG som både nål och DRG flytta synkront med andning. Injektion varaktigheten för en volym av 100 μL summor 24 min i stegvis takt som beskrivs här. Försiktighet bör iakttas att begränsa yttre störningar av hela injektionen apparaten under denna tid. Arrangemang av operationsområdet, personal och omgivande hinder bör ändras som behövs innan injektionen startas för att säkerställa en ostörd gränssnitt mellan CED nålspetsen och DRG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen; Författarna har inga intressekonflikter som avser denna studie.

Acknowledgments

Studien utfördes med stöd av stiftelsen Schulze familj (till A.S.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Large humane animal sling Britz & Company 002539 Modified to include abdominal aperture
Adhesive patient return electrode - 9 inch Medtronic E7506 -
Ranger blood & fluid warming system 3M 24500 -
Lactated Ringer's fluid Hospira 0409-7953-09 -
Force air warming device 3M 77500 -
Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) 3M 8630 -
Sterile disposable surgical towels Medline MDT2168286 -
Ioban 2 incise drape 3M 6651EZSB -
Disposable suction canister and tubing Medline DYND44703H -
Button switch electrosurgical monopolar pencil Medtronic E2450H -
Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch Bovie A826 -
#15 blade Miltex 4-315 -
#11 blade Miltex 4-311 -
4 x 4 surgical gauze Dynarex 3262 -
Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch Miltex 11-618 -
Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch Sklar 42-2078 -
Gelpi self-retaining retractor, 7 inch Sklar 60-6570 -
Freer elevator, 5 mm Medline MDS4641518F -
Bone wax Ethicon W31G -
Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm Sklar 42-2852 -
Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm Medline MDS4052802 -
Leksell angled rongeur, 2 mm Sklar 40-4097 -
Gelfoam, size 50 Pfizer AZL32301 -
Cottonoid patty Medtronic 8004007 -
Frazier suction tip, 6 Fr Sklar 50-2006 -
Frazier suction tip, 10 Fr Sklar 50-2010 -
Dandy blunt right angle nerve hook Medline MDS4005220 -
Nylon suture, 6-0 Ethicon 697G -
Castroviejo smooth micro needle holder Medline MDG2428614 -
22 gauge Quinke point spinal needle Halyard Health 18397 -
32 gauge CED needle with locking Luer hub See comments n/a As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014).
Polyethylene tubing, 5 feet Scientific Commodities BB31695-PE/05 -
Monoject syringe, 3 mL Kendall SY15352 -
NanoJet syringe pump Chemyx 10050 -
DAPI Sigma-Aldrich D9542 -
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 -
Bulb irrigation syringe Medline DYND20125 -
Fine-toothed Adson forceps Medline MDS1000212 -
Vicryl suture, 0 Ethicon J603H -
Vicryl suture, 2-0 Ethicon J317H -
Needle counter Medline NC20FBRGS -
Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch 3M R1547 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millan, M. J. The induction of pain: An integrative review. Prog Neurobiol. 57, (1), 1-164 (1999).
  2. Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. (2016).
  3. Pleticha, J., Maus, T. P., Beutler, A. S. Future directions in pain management: integrating anatomically selective delivery techniques with novel molecularly selective agents. Mayo Clin Proc. 91, (4), 522-533 (2016).
  4. Standring, S. The anatomical basis of clinical practice. Elsevier Churchill. Edinburg. (2005).
  5. Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199, (1), 43-55 (2011).
  6. Zhao, X., et al. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 16, (8), 1024-1031 (2013).
  7. Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., Huang, L. Y. M. Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 14, (9), 897-906 (2003).
  8. Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177, (2), 397-402 (2009).
  9. Mason, M. R. J., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18, (4), 715-724 (2010).
  10. Jelicic Kadic, A., Boric, M., Kostic, S., Sapunar, D., Puljak, L. The effects of intraganglionic injection of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitors on pain-related behavior in diabetic neuropathy. Neurosci. 256, 302-308 (2014).
  11. Greenberg, M. S. Handbook of neurosurgery. Thieme. (2010).
  12. Yu, H., Fischer, G., Hogan, Q. H. AAV-mediated gene transfer to dorsal root ganglion. Methods Mol Biol. 1382, 251 (2016).
  13. Yaksh, T. L., et al. Pharmacology and toxicology of chronically infused epidural clonidine HCL in dogs. Toxicol Sci. 23, (3), 319-335 (1994).
  14. Federici, T., et al. Surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs. J Vis Exp. (70), e4371 (2012).
  15. Lee, J. H. T., et al. A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. J Neurotrauma. 30, (3), 142-159 (2013).
  16. Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, (3), e164 (2011).
  17. Riley, J., et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: A phase I safety trial, technical note, and lumbar safety outcomes. Neurosurg. 71, (2), 405-416 (2012).
  18. Olmarker, K., Holm, S., Rosenqvist, A., Rydevik, B. Experimental nerve root compression. A model of acute, graded compression of the porcine cauda equina and an analysis of neural and vascular anatomy. Spine. 16, (1), 61-69 (1991).
  19. Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, (6), 2076-2080 (1994).
  20. Lonser, R. R., Sarntinoranont, M., Morrison, P. F., Oldfield, E. H. Convection-enhanced delivery to the central nervous system. J Neurosurg. 122, (3), 697-706 (2015).
  21. Shen, J., Wang, H. Y., Chen, J. Y., Liang, B. L. Morphologic analysis of normal human lumbar dorsal root ganglion by 3D MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 27, (0195–6108 (Print)), 2098-2103 (2006).
  22. Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121, (4), 851-858 (2014).
Laminotomy för ländryggen dorsalrotsganglier Ganglion tillgång och injektion hos svin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).More

Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter