Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Laminotomy for lumbal dorsalrods Ganglion adgang og injektion i svin

doi: 10.3791/56434 Published: October 10, 2017

Summary

Vi beskriver en metode til laminotomy i svin, der giver adgang til lumbal dorsalrodsganglier (DRG) for intraganglionic injektion. Injektion fremskridt overvåges intraoperatively og histologisk bekræftet op til 21 dage efter operationen. Denne protokol kan bruges til fremtidige prækliniske undersøgelser der involverer DRG injektion.

Abstract

Dorsalrodsganglier (DRG) er anatomisk veldefineret strukturer, der indeholder alle primære sensoriske neuroner under hovedet. Dette faktum gør DRG attraktive mål for injektion af roman therapeutics rettet mod behandling af kroniske smerter. I små dyremodeller, er laminektomi blevet brugt til at lette DRG injektion, fordi det indebærer kirurgisk fjernelse af vertebrale knoglen omkring hver DRG. Vi demonstrere en teknik til intraganglionic injektion af lumbal DRG i en stor dyrearter, nemlig svin. Laminotomy udføres for at give direkte adgang til DRG ved hjælp af standard neurokirurgiske teknikker, instrumenter og materialer. Sammenlignet med mere omfattende fjernelse af knogle via laminektomi, gennemfører vi laminotomy hen til conserve spinal anatomi samtidig opnå tilstrækkelig DRG adgang. Intraoperativ fremskridt af DRG injektion overvåges ved hjælp af et ikke-giftige farvestof. Efter eutanasi postoperative dag 21, injektion succes afhænger af histologi for intraganglionic fordeling af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Vi indsprøjte en biologisk inaktiv løsning for at demonstrere protokollen. Denne metode kunne være anvendt i fremtiden prækliniske undersøgelser til target terapeutiske løsninger på DRG. Vores metode bør lette translatability af intraganglionic små dyr paradigmer i en stor dyrearter. Derudover kan denne protokol tjene som en vigtig ressource for dem, der planlægger prækliniske undersøgelser af DRG injektion i svin.

Introduction

Dorsalrodsganglier (DRG) er anatomisk diskret, neuronal samlinger placeret langs rygsøjlen. Hver DRG indeholder de primære sensoriske neuroner, der indkode og relæ perifere stimuli til centralnervesystemet (CNS) fra specifikke kroppen regioner. For eksempel, begynder smerten ved slidgigt når smerte receptorer placeret omkring et fælles opfatter skadelige stimuli. Denne proces kaldes nociception. Langsigtet bevidsthed om skadelige stimuli fører til kroniske smerter 1.

Kroniske smerter er en hyppig genstand for prækliniske undersøgelse 2 hvor ét mål er at udvikle nyttige metoder til målrettet levering af analgetika til DRG, såsom intraganglionic injektion 3. DRG er imidlertid vanskeligt at adgang, fordi de opholder sig inden for boney rammerne af intervertebral foramina 4. Flere grupper har med held overvinde denne hindring ved hjælp af rygsøjlen kirurgi i gnavere 5,6,7,8,9,10.

I klinikken, laminektomi er en fælles operation, rygsøjlen og henviser til kirurgisk fjernelse af vertebrale lamina, hvorved unroofing rygmarvskanalen 11. Indarbejdelse af kirurgiske teknikker Råd direkte DRG adgang til har været vellykket i gnavere 5,12, oversættelse kan imidlertid være urealistisk at opfatte forskelle i størrelse af relevante strukturer og hvordan det påvirker farmakokinetik eller teknisk gennemførlighed 13,14. For eksempel, fastslået en undersøgelse tværgående rygmarven diameter på T10 3.0, 7.0 og 8,2 mm for rotte, svin og human, henholdsvis 15. Således modeller store dyre bedre omtrentlige menneskelige dimensioner af nervøs strukturer.

Hos svin anvendes Raore et al. multi-level laminektomi til at få adgang til den cervikale rygmarv til flere intraspinal injektioner 16. Proceduren var veltolereret og ført til en fase jeg klinisk forsøg hvor sammenlignelige kirurgisk resultater var dokumenteret 17. Disse resultater fremme fortsatte brug af prækliniske store dyremodeller som prædiktorer for teknisk gennemførlighed og sikkerhed hos mennesker.

Til dato, findes ingen detaljerede metoder for kirurgisk adgang og injektion af DRG i en stor dyrearter. Hvis du vil indsnævre denne translationel kløft, rapporterer vi en protokol for DRG eksponering og injektion via laminotomy i svin. Neurokirurgiske standardteknikker, instrumenter og materialer blev brugt og metoden blev designet til at efterligne moderne kirurgisk praksis. Vi demonstrere intraganglionic injektion ved hjælp af en vandig opløsning for lumbal DRG og bekræft vellykket levering via histologi efter postoperative dag 21.

Protocol

alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Mayo Clinic.

1. forudsætninger af stringens og reproducerbarhed

  1. at sikre stringens i design, følger nationale standarder for god laboratorie praksis er på alle tidspunkter og opnå intern godkendelse af IACUC (eller lignende udvalg) forud for ethvert dyr deltagelse i eksperimenter.
    Bemærk: Denne protokol var designet til at opretholde en klinisk trofaste tilgang. Således, materialer, instrumenter og teknikker involveret er beskrevet på en måde identisk med de højeste kliniske standarder i mennesker. For eksempel, strenge steril teknik er fulgt og udløbne materialer bør aldrig anvendes.
  2. Til at støtte reproducerbarhed af denne metode i en eksperimentel indstilling, udvikle interne standardprocedurer og kontrollere for variation i svin race, vægt, køn og alder mellem separate kohorter.
    Bemærk: Design af denne protokol var baseret på anvendelse af svin vejer 38-53 kg.

2. Præoperativ Animal Care

  1. administrere profylaktisk intramuskulær (IM) ceftiofur, givet på 5 mg/kg, 1 dag før proceduren.
  2. Hurtigt dyr fast føde og begrænse dyr fra kosmetiske behandlinger, dvs olie bade, 12 h før proceduren.
  3. Inducere generel anæstesi inden for 1 time af proceduren, ved hjælp af IM Tiletamin og zolazepam, givet som Telazol på 5 mg/kg, og IM xylazin, givet på 2 mg/kg
  4. Når induceret, administrere subkutan (SC) buprenorphin vedvarende release (SR), givet på 0,18 mg/kg
  5. Placer et øre-vene kateter og udføre hurtig rækkefølge intubation for at placere en endotrakealtube.
  6. Vedhæfte en pulsoximeter med puls overvågning funktion til tungen at overvåge iltning og puls.
  7. Placere dyret i den liggende stilling og klip huden over dorsum ved hjælp af en elektrisk clipper. Klip håret over en stor, bilaterale område strækker sig fra midterlinjen sagittale flyet til midterlinjen koronale flyet og på langs den sakrale apex til den skulderblad pigge. Bruge dobbeltklæbende tape til at fjerne hår og frit svævende hud.
  8. Krat det klippede område op til 3 gange med varmt vand og sæbe og tør hud med en fnugfri håndklæde.
  9. Mark bilaterale anatomiske landemærker ved hjælp af en kirurgisk mærkning pen. Markere det sidste ribben, iliaca kamme, torntappene, og tværgående processer.
    Bemærk: Ved at markere den sidste ribben, iliaca kamme, og tværgående processer, columna lumbalis afgrænses langs dens overlegne, ringere og laterale grænser, henholdsvis. Denne protokol er udviklet til at guide adgang og injektion af enhver lumbal DRG af interesse. For reference, de overlegne iliaca kamme justere med de L3 eller L4 vertebrale niveau.
  10. Dækker dyr med et varmt tæppe til transport til de operative suite.

3. Positionering i den Operative Suite

  1. forsigtigt lift og holdning dyret tilbøjelige til et modificeret store humane dyr slynge med polstret abdominal blænde.
    Bemærk: Den abdominale blænde giver for reduktion i abdominal pres svarende til Wilson rammen brugt under menneskelige kirurgi i rygsøjlen. Til gengæld falder dette intraoperativ blødning fra spinal blodkarrene. Slyngen er fordelagtig, fordi benene får lov at hænge frit gennem polstret åbninger, som beskytter dyret fra perifere nerve impingement. Men fordi slyngen rammen er lavet af metal, bør det være polstret med isolering til at undgå elektrisk kortslutning og utilsigtet dyr brænde. Et tæppe roll kan placeres for at placere hoved og hals i en behagelig stilling, afhængigt af dyrets størrelse.
  2. Vedligehold generel anæstesi ved hjælp af 1-3% ved indånding (IH) isofluran, titreres til effekt. Fugte øjne med oftalmologiske salve og forsigtigt tape dem lukket.
  3. Placer-linjer for vitalfunktioner overvågning til dokument temperatur, blodtryk, puls og iltning. Overvåge ventilation ved capnography.
  4. Placer et klæbende, engangs elektrokirurgisk dispersive elektrode over den venstre eller højre Bovbladet.
  5. Administrere varmede laktat Ringer ' s som vedligeholdelse væsker gennem øret-vene kateter. Give væsker med en hastighed på 5-10 mL/kg/h.
  6. Placer et tvunget luft opvarmning enhed over regionen bryst- og livmoderhalskræft og undgå at tildække de sidste ribben.

4. Sterilt forberedelse af udløsende felt for en venstre-sidet injektion

Bemærk: fra dette punkt fremad, Fortsæt i streng sterile mode.

  1. Forbered huden overliggende lændehvirvelsøjlen begyndelsen med bred anvendelse af 0,7% jod povacrylex og 74% isopropylalkohol ifølge producenten ' s instruktioner. For at sikre, at guide nålen senere kan placeres i en steril mode, lateralize anvendelse til siden af planlagte injektion ved at udvide antisepsis mod midterlinjen koronale flyet forbi de markerede tværgående processer.
  2. Sted engangs kirurgisk håndklæder i rektangulære mode at skitsere planlagte indsnit site, som er over midterlinjen langs de markerede Columna torntappene.
  3. Anvend klæbemiddel antimikrobiel incise drapere over de udløsende håndklæder og udsat hud. Klemme gardiner i sted og udvide draperier brodden af feltet udløsende.
  4. Sikre en lodret drapere polakkerne i spidsen for slyngen mellem feltet udløsende og overvågning teknikeren.
  5. Secure linjer til suge- og elektrokirurgiske inden for det operative af fastspænding til sterilt gardiner. Passere de frie ender af rør og ledninger ud af den sterile felt.

5. Hud indsnit og Subperiosteal dissektion

  1. palpere Columna torntappene langs midterlinjen og fastlægge 3 på hinanden følgende vertebrale niveau.
  2. Bruge en #15 skalpel til at åbne en 8-12 cm midterlinjen sagittal snit gennem incise drapere direkte posteriort for torntappene. Vedligeholde hæmostase ved hjælp af gaze tamponade og monopolære Elektrokirurgi.
    Bemærk: Pleje bør tages ikke at afvige fra midterlinjen som snit er avanceret i den forreste retning, fordi det begrænser blødning fra paraspinal muskler. Periodiske palpering for torntappene letter avancement. Selvstændige fastholde Weitlaner, Meyerding eller Gelpi retraktorer kan placeres og flyttes efter behov for at lette dissektion. Suge bruges til at opretholde synlighed.
  3. Dissekere den subkutane væv og fedt ved hjælp af monopolære Elektrokirurgi indtil den thoracolumbale fascia er nået. Palpere torntappene dybe til den thoracolumbale fascia og skære fascia langs midterlinjen at udsætte den supraspinous ledbånd der spænder mellem torntappene.
    Bemærk: Den thoracolumbale fascia er identificeret som en organiseret, aponeurotic kappe med en bindevæv korn, at interweaves i en skrå, lateral til mediale retning. På dette tidspunkt, snit kan blive forlænget i enten bedre eller ringere retning til at sikre, at 3 torntappene er fuldt synlige med Performing spinosus processen justeret i midten af feltet dissektion.
  4. Brug en #15 klinge til at placere en 2-mm dyb parasagittal snit gennem supraspinous ligament posteriort for hver spinosus proces. Placer hvert snit langs den venstre tredje af posterior overfladen af spinosus proces.
  5. Forsigtigt frigøre supraspinous ledbåndet på hver plan langs hver incision ved hjælp af en friere elevator i 5-mm.
  6. Identificere subperiosteal flyet og dissekere inden for at flyet langs den laterale overflade af hver spinosus proces.
  7. Udføre subperiosteal dissektion på hver spinosus proces i en parallel mode til at sikre, at en blid, selv dissektion opnås.
  8. Incise paraspinal muskel vedhæftet langs de interspinous rum ved hjælp af monopolære Elektrokirurgi i koncert med subperiosteal dissektion.
  9. Identificere lamina på hvert niveau og fortsætte subperiosteal dissektion lateralt for at nå den laterale grænse af 2 zygapophyseal leddene, som forbinde de 3 udsatte ryghvirvler og nå den laterale kant af lamina mellem leddene, kaldet pars interarticularis.
    Bemærk: Pars interarticularis er den bageste kant af intervertebrale foramen hvori DRG er bosat. Lejlighedsvis, opstår en lille vene fra et foramen ligger på den bageste overflade af lamina. Disse vener har en tendens til at briste under subperiosteal dissektion. Hæmostase opnås nemt ved hjælp af en kombination af bipolar Elektrokirurgi og knogle voks anvendes til foramen.

6. Enkeltniveau Laminotomy

  1. identificere mål for laminotomy som Performing lamina placeret mellem og mediale til 2 zygapophyseal leddene.
  2. Spore lamina til ringere kanten, at et punkt bare mediale til sammenhængende ringere artikulære processen af den caudale zygapophyseal fælles.
  3. Bruger en 5-mm friere elevator eller curette for at palpere overgangen mellem caudalmost kanten af lamina og centrale kanal.
    Bemærk: Omhu ikke tvinge de palpating instrument forreste som dette vil kontakte dural sac og rygmarven. Bemærk, at rygmarven i svin streamens lændehvirvelsøjlen 18. En diskusprolaps rongeur kan bruges til at fjerne ekstra blødt væv overliggende dette område for at lette palpering.
  4. Brug en 2 mm op-bidende, 45-graders Kerrison rongeur til at udtrække knogle i en piece-wise mode. Fjerne knogle langs bunden af spinosus processen overlegent til et niveau lige caudale pedicle caudale overflade og ud sideværts i sin fulde udstrækning.
  5. Brug vinklede ben rongeurs at hjælpe med fjernelse af knogle. Forlade den ringere artikulære processen, der blev tilsluttet lamina på plads indtil laminotomy er fuldført.
  6. Bekræfte, at den ringere artikulære processen er frit mobile og vedlagte kun af zygapophyseal ledkapslen. Incise kapsel af med #15 eller #11 klinge.
  7. Fjerner den ringere artikulære processen i en piece-wise mode, men lader de tilstødende overlegne artikulære processen intakt.
    Bemærk: Laminotomy er afsluttet, udføres hæmostase med bipolar Elektrokirurgi. Monopolære Elektrokirurgi bruges ikke på grund af nærheden af neurale strukturer. Knogle voks kan placeres langs lokaliteter af blødning fra udsatte knogle og resorberbare gelatine svampe kan anvendes til at opnå hæmostase i nærheden af blødt væv. Cottonoid er et nyttigt værktøj til vægen serøs væske og blod fra dissektionen.

7. Dissektion af DRG

  1. Evakuer epidural fedt i en piece-wise mode fra overfladisk til dyb begynder medialt og lateralt på vej. Fjerne fedt af blid dissektion ved hjælp af bipolar pincet og suge med 6-10 franske Frazier suge tips.
    Bemærk: Lup forstørrelse eller brug af et dissekere mikroskop er behjælpelig med detaljeringsgrad, der skulle sikkert evakuere epidural fedt og opnå omhyggelig hæmostase af epidural venøse plexus ved hjælp af bipolar Elektrokirurgi.
  2. Identificerer de dural sac langs midterlinjen kører i en superoinferior retning, parallel med aksen af hud indsnit. Fjerne epidural fedt langs dural sæk indtil dural sæk kan ses at give anledning til dural nerve rod ærme.
  3. Spore dural ærmet lateralt og inferiorly ved epidural fedt evakuering indtil det ses at forstørre omkring DRG.
    Bemærk: Identificere DRG oval form og gul til orange farve. På midten lænde-rygsøjlen er DRG typisk 4-6 mm i størrelse, længste i medialt til lateral retning, og beliggende direkte ringere eller 2-3 mm mediale til sin respektive pedicle. En stump, retvinklet nerve krog kan bruges til at forsigtigt palpere for pedicle.
  4. Evakuere epidural fedt sideværts, forbi DRG, indtil den tilstødende spinal nerve er set.
    Bemærk: Hvis durotomy sker, reparere det ved vandtætte lukning ved hjælp af 6-0 nylon sutur og glat mikro nål driver i en simpel kører stich.

8. Injektion af DRG

  1. Brug en 22-gauge spinal nål til at guide banen af en 32-gauge konvektion forbedret levering (CED) nål. Punktere 22-gauge guide nålen gennem huden og paraspinal musklerne.
    Bemærk: CED nålen er designet til at opnå fluid konvektion i væv, også kendt som bulk flow, på grund af presset gradienter 19 , 20.
  2. Sigte guide nålen langs en bane, der nærmer sig den langsgående akse af DRG og resulterer i nål spidsen emerging fra den laterale paraspinal væg i feltet dissektion.
  3. Fine tune nål stien indtil nål lumen flugter med midten af DRG.
    Bemærk: Guide nålen bør aldrig få lov til at kontakte DRG.
  4. Udarbejde sterile injectate i en steril sprøjte og tilslutte sprøjten til sterile infusion slangesættet.
  5. Sikre slanger til CED nålen og hånd sprøjte ud af den sterile felt. Tilsluttes en programmerbar sprøjten pumpe sprøjten.
    Bemærk: Slangen er forberedt til en længde på 5 fødder til at sikre, at steriliteten og mobilitet opretholdes. Det er også af afgørende betydning at ingen luftbobler tilføres løsning.
  6. Fremme i injectate indtil udtryk ses fra CED nål tip.
  7. Placer CED nålen i guide nål lumen og forhånd langsomt CED nålen, indtil det fremgår af vejledning nål tip. Sikre, at DRG ikke er punkteret under nålen justering.
  8. Fine tune guide nål stilling langs den lange akse af dens bane til at bestemme den endelige placering af CED tip.
  9. Sikre guiden nål og CED nål sammen ved hjælp af sikringsanlæg nål hubs, når dybden og justering af guide og CED nåle er opnået.
  10. Bekræft, at alle injektion apparater forbindelser er fuldt sikret, herunder guide nål, CED nål, og tilsluttede slanger fyldt med injectate.
  11. Forhånd guide nålen langs dens akse at tilnærme CED nål tip og DRG.
  12. Punktere DRG med CED nål spids.
  13. Neddyppes CED nål spidsen ind i tre-dimensionelle midten af DRG.
    Bemærk: fordi DRG er en tre-dimensionelle struktur af varierende størrelse og form, DRG eksponering skal fuldføres for at præcist sted CED nål tip på den sande centrum for DRG. Den sande DRG center er placeret i skæringspunktet mellem dens tre anatomiske akser, nemlig den forreste til bageste, lateral til mediale og overlegen i forhold til ringere akser.
  14. Levere 100 μL af injectate af CED ved hjælp af en gradueret hastighed og volumen på 3 trin.
  15. Levere 4 μl på 2 μl/min til de første skridt. Levere 8 μL 4 μL/min. til det andet trin. Levere 88 μL 8 μL/min. for det tredje og sidste trin.
    Bemærk: Mulighed for en 3-min. pause mellem trin og efter det endelige skridt til at gøre det muligt pres ækvilibrering.
  16. Trække apparatet injektion efter den endelige indsprøjtning skridt og 3-min pause langs sin lange akse i en glat, blid bevægelse.
    Bemærk: For injiceres løsninger, der er farveløs, farvet farvestof er inkluderet i løsningen ved en koncentration på 0,1% vægt/volumen til at bistå med visuel bedømmelse af injectate distribution 12. Også, den vitale farvestof 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) er inkluderet i løsning ved en koncentration på 0,25 μg/μL undersøgelse design kræver histologisk vurdering af injectate distribution 5.

9. Lukning

  1. anvende 3 runder af varmt saltvand kunstvanding operationsstedet inden lukning til at mobilisere og skylle site af vragrester, dvs knoglerester. Bruge suge for at inddrive saltvand og debris.
    Bemærk: Omhyggelig hæmostase er sikret, når kunstvanding forbliver klar. Hæmostatisk agenter (gelatine svamp) og cottonoid er fjernet på dette tidspunkt. Sikre, at alle materialer og instrumenter er blevet ryddet fra webstedet indsnit inden lukning.
  2. Bruger en 3-lags teknik for lukning.
  3. Sutur af thoracolumbale fascia bruger 0 sutur i en enkel, afbrudt, noninverted mode. Placer en stich hver 5-8 mm for at opnå vandtætte lukning.
  4. Sutur det subkutane væv ved hjælp af 2-0 sutur i en enkel, afbrudt, inverteret mode med et søm anbringes hver 5 til 8-mm at opnå tilstrækkelig styrke.
  5. Lukke huden ved hjælp af 0 sutur i en enkel, kører eller afbrudt mode.
  6. Bruge en nål tæller til at sikre, at ingen skarpe beholdningsopgørelsen for.
  7. Overrisle huden med saltvand, tørre huden og placere klæbende bandage strimler vinkelret snit.
  8. Sted gaze oven på Forbindingen strimler og vedhæfte en endelige selvklæbende antimikrobiel incise drapere.

10. Postoperativ Animal Care

  1. Extubate, dække med varme tæpper, og transport af dyr til recovery.
  2. Følge standard institutionelle driftsprocedurer for postoperativ overvågning og nyttiggørelse fra overlevelse kirurgi. På et minimum, observere dyret hver 15 min. indtil tilbagevenden af bevidsthed, hver time, indtil fuld narkose opsving er opnået, og to gange dagligt derefter.
  3. Give postoperativ smertebehandling ved at administrere IM eller mundtlige carprofen, givet til 4 mg/kg, én gang dagligt i 5 dage begynder postoperative dag 0. Administrere SC buprenorphin SR, angivet på 0,18 mg/kg, en gang ved postoperative dag 2.
  4. Administrere postoperativ antisepsis ved at give IM ceftiofur, angivet på 5 mg/kg, en gang ved postoperative dag 4.
  5. Fjerne forbinding på postoperativ dag 5-7. Fjerne suturer, når sårheling er afsluttet, typisk på postoperativ dag 10-14.
  6. Humant aflive dyr ifølge standard institutionelle procedurer, når undersøgelsen slutpunkt nås.

Representative Results

Histologisk vurdering af injectate spredning
Succesfuld levering af injectate til DRG bestemmes af histologisk vurdering af DAPI spredes. Teknikken indebærer positionering needle-tip i tre-dimensionelle midten af DRG. Derfor, vellykket levering bestemmes ved at evaluere omfanget af DAPI farvning fra histologiske sektioner både nær (centrale DRG sektioner) og fjern (perifere DRG sektioner) til nål-spids. Figur 1A og figur 1B repræsenterer en vellykket injektion af én DRG. DAPI farvning var jævnt spredt gennem både de centrale og perifere DRG parenkym. Således, en vellykket DRG injektion er illustreret af den diffuse spredning af DAPI farvning i hele den tre-dimensionelle DRG arkitektur. Sub-optimale injektion er illustreret af inkonsekvent farvning. For eksempel, angiver minimal farvning (figur 1 c) eller fokale farvning langs den ydre rand, men ikke indre aspekt af DRG parenkym (fig. 1 d) mislykket injektion. Også, set under ét, figur 1 c (central DRG afsnit) og figur 1 d (perifere DRG afsnit) illustrere en manglende konsistent farvning inden for tre dimensioner for denne enkelt lumbal DRG.

Figure 1
Figur 1 : Tre-dimensionelle vurdering af DAPI Distribution i injiceres DRG. (A) en central afdeling fra en injiceret lumbal DRG repræsentant for et vellykket resultat. Farvning af markør farvestof DAPI er jævnt spredt over hele hele DRG i to dimensioner. (B) en parallel, perifere del af den samme DRG i (A), illustrerer sammenhængen i DAPI spredes inden for et andet fly af afsnit, bekræfter en vellykket injektion i tre dimensioner. (C) en central afdeling fra en injiceret lumbal DRG repræsentant for et optimalt resultat. Minimal til ingen farvning af DAPI ses bortset fra lejlighedsvise foci. (D) en parallel og perifere del af den samme DRG i (C), illustrerer delvis distribution af DAPI langs DRG periferien. Blå: DAPI. Red: autofluorescence. Skalere barer = 500 μm (A og C), 100 μm (B og D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi har søgt at beskrive en metode for kirurgiske eksponering af DRG via laminotomi og intraganglionic injektion i en sund store dyrearter, specielt, svin. I gnavere, er en lignende metode detaljeret 12 og bruges til at levere konventionelle farmakologiske agenter 8,10 og virale vektorer 6,7,9,12 til DRG. Resultaterne fra ovennævnte lille dyreforsøg er lovende, og vi håber vores protokol vil bane vejen for andre til at oversætte disse forudgående resultater til svin. Raske og syge dyr blev brugt i de ovennævnte undersøgelser, støtte nytten af smådyr i prækliniske forskning. Uundgåeligt, store dyremodeller vil være forpligtet til at gøre den bedst tilgængelige sammenligning til menneskelige DRG med hensyn til størrelse og injectate fordeling. F.eks. uoverensstemmelse i DRG størrelse er tydeligt mellem rotter og mennesker. L5 DRG i voksen, mandlige rotter måler ca 2.6 mm x 1,5 mm 5 i forhold til 11,6 mm x 6,6 mm i voksen, mandlige mennesker 21. Baseret på live Radiografisk målinger i svin, fandtes L5 DRG for at være omkring 8,0 mm x 6,0 mm 22. Derfor, svin er beliggende som en særlig nyttige arter for prækliniske undersøgelse på grund af strukturelle ligheder med det menneskets nervesystem og i nærheden bevægeapparatet anatomi. Dette fremgår af den omvendte oversættelse bruges til at designe denne protokol efter, udføres i klinikken. Derudover svin er brug dyr og er af stigende betydning i biomedicinsk forskning. Denne protokol vil støtte prækliniske undersøgelser af intraganglionic levering af injicerbar løsninger på forhånd forudgående resultater fra arbejde i gnavere til store dyr. Denne protokol kan dermed fremme nye strategier til behandling af kroniske smerter, der integrerer anatomisk selektiv levering teknikker med romanen molekylemæssigt selektiv agenter, som vi forudsige, kan have potentiale til at omdanne smerte medicin 3.

Yderligere noter for vellykket DRG injektion

Prelaminar periosteum på lumbal vertebrale niveau i svin fortsætter cephalad i stedet for ligamentum flavum. Under laminotomi, periosteum let kan adskilles af placering af Kerrison rongeur og kan efterligne udseendet af dura mater. Det er et afgørende skridt til at differentiere ligamentum flavum, periosteum, epidural fedt og dura sac dissektion er foretaget. Derudover eksponering af epiduralrummet er mere effektiv og medfører mindre blødning hvis periosteum er fjernet samtidig med lamina. Hvis periosteum ikke er fjernet sammen med knoglen, kan den indsnit med #11 klinge og fjernet for at afdække de underliggende epidural fedt.

For at gøre nogen skade er en topprioritet, og dette skal afbalanceres med mål at DRG adgang og injektion. Således omhu ikke at fremme evakuering af epidural fedt længere anteriorly eller anteromedially end der er behov for at give positiv identifikation af dural sæk, dural nerve rod ærme og DRG. Dissektion i anteromedial retning hvor dural sæk giver anledning til dural nerve rod ærme er særligt farlige, som vil være stødt på en langsgående epidural vene. Derudover øger dissektion i denne retning risikoen for utilsigtet durotomy, signaleres ved udstrømning af cerebrospinalvæsken fra overfladen af dural sæk.

En afsluttende kritisk punkt er at identificere den elle sac, dorsale rødder, DRG i sin helhed, og spinal nerve. Dette hjælper med at etablere 4 stykker af konvergerende anatomiske bevis for, at sikre komplet DRG definition. Definere DRG i sin helhed er nødvendig for at placere needle-tip på sine tre-dimensionelle center, som tillader CED nål til at etablere en ensartet trykgradient mens maksimere afstanden til de omkringliggende anatomiske grænser. Begge faktorer i høj grad øge mængder leveret og vifte af intraparenchymal spredes 19,20. Levering af injectate på en placering, der ikke er den sande anatomiske center resulterer i sub-optimale indsprøjtning fordi inkonsekvent pres resultatet når injectate lækager fra den nærliggende sted af DRG punktering 20.

En vanskelighed med at bruge en CED nål til DRG injektion er overholdelse. Når injektionen er startet, nål-spids skal holdes så stadig som muligt eller andet pres forløb vil sprede på grund af pludselige ændringer i compliance 20. Respiratorisk bevægelse er en kilde til kontinuerlig bevægelse under injektionen. Men risikoen for nålen bevægelse sekundært til respiratorisk udflugt er stort set fjernet ved at forankre CED og guide nålen i paraspinal muskulatur forud for punktering af DRG som både nål og DRG flytte i synchrony med respiration. Injektion varighed for en mængde på 100 μL totaler 24 min stepped tilskuddet beskrevet her. Pleje bør træffes til at begrænse eksterne forstyrrelser af apparatet hele injektion i løbet af denne tid. Arrangement af kirurgiske felt, personale og omkringliggende hindringer bør ændres efter behov før injektionen er begyndt at sikre en uforstyrret grænseflade mellem CED nål tip og DRG.

Disclosures

Ingen; Forfatterne har ingen interessekonflikter, der er relateret til denne undersøgelse.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev udført med støtte af Schulze Family Foundation (til A.S.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Large humane animal sling Britz & Company 002539 Modified to include abdominal aperture
Adhesive patient return electrode - 9 inch Medtronic E7506 -
Ranger blood & fluid warming system 3M 24500 -
Lactated Ringer's fluid Hospira 0409-7953-09 -
Force air warming device 3M 77500 -
Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) 3M 8630 -
Sterile disposable surgical towels Medline MDT2168286 -
Ioban 2 incise drape 3M 6651EZSB -
Disposable suction canister and tubing Medline DYND44703H -
Button switch electrosurgical monopolar pencil Medtronic E2450H -
Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch Bovie A826 -
#15 blade Miltex 4-315 -
#11 blade Miltex 4-311 -
4 x 4 surgical gauze Dynarex 3262 -
Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch Miltex 11-618 -
Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch Sklar 42-2078 -
Gelpi self-retaining retractor, 7 inch Sklar 60-6570 -
Freer elevator, 5 mm Medline MDS4641518F -
Bone wax Ethicon W31G -
Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm Sklar 42-2852 -
Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm Medline MDS4052802 -
Leksell angled rongeur, 2 mm Sklar 40-4097 -
Gelfoam, size 50 Pfizer AZL32301 -
Cottonoid patty Medtronic 8004007 -
Frazier suction tip, 6 Fr Sklar 50-2006 -
Frazier suction tip, 10 Fr Sklar 50-2010 -
Dandy blunt right angle nerve hook Medline MDS4005220 -
Nylon suture, 6-0 Ethicon 697G -
Castroviejo smooth micro needle holder Medline MDG2428614 -
22 gauge Quinke point spinal needle Halyard Health 18397 -
32 gauge CED needle with locking Luer hub See comments n/a As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014).
Polyethylene tubing, 5 feet Scientific Commodities BB31695-PE/05 -
Monoject syringe, 3 mL Kendall SY15352 -
NanoJet syringe pump Chemyx 10050 -
DAPI Sigma-Aldrich D9542 -
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 -
Bulb irrigation syringe Medline DYND20125 -
Fine-toothed Adson forceps Medline MDS1000212 -
Vicryl suture, 0 Ethicon J603H -
Vicryl suture, 2-0 Ethicon J317H -
Needle counter Medline NC20FBRGS -
Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch 3M R1547 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millan, M. J. The induction of pain: An integrative review. Prog Neurobiol. 57, (1), 1-164 (1999).
  2. Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. (2016).
  3. Pleticha, J., Maus, T. P., Beutler, A. S. Future directions in pain management: integrating anatomically selective delivery techniques with novel molecularly selective agents. Mayo Clin Proc. 91, (4), 522-533 (2016).
  4. Standring, S. The anatomical basis of clinical practice. Elsevier Churchill. Edinburg. (2005).
  5. Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199, (1), 43-55 (2011).
  6. Zhao, X., et al. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 16, (8), 1024-1031 (2013).
  7. Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., Huang, L. Y. M. Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 14, (9), 897-906 (2003).
  8. Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177, (2), 397-402 (2009).
  9. Mason, M. R. J., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18, (4), 715-724 (2010).
  10. Jelicic Kadic, A., Boric, M., Kostic, S., Sapunar, D., Puljak, L. The effects of intraganglionic injection of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitors on pain-related behavior in diabetic neuropathy. Neurosci. 256, 302-308 (2014).
  11. Greenberg, M. S. Handbook of neurosurgery. Thieme. (2010).
  12. Yu, H., Fischer, G., Hogan, Q. H. AAV-mediated gene transfer to dorsal root ganglion. Methods Mol Biol. 1382, 251 (2016).
  13. Yaksh, T. L., et al. Pharmacology and toxicology of chronically infused epidural clonidine HCL in dogs. Toxicol Sci. 23, (3), 319-335 (1994).
  14. Federici, T., et al. Surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs. J Vis Exp. (70), e4371 (2012).
  15. Lee, J. H. T., et al. A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. J Neurotrauma. 30, (3), 142-159 (2013).
  16. Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, (3), e164 (2011).
  17. Riley, J., et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: A phase I safety trial, technical note, and lumbar safety outcomes. Neurosurg. 71, (2), 405-416 (2012).
  18. Olmarker, K., Holm, S., Rosenqvist, A., Rydevik, B. Experimental nerve root compression. A model of acute, graded compression of the porcine cauda equina and an analysis of neural and vascular anatomy. Spine. 16, (1), 61-69 (1991).
  19. Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, (6), 2076-2080 (1994).
  20. Lonser, R. R., Sarntinoranont, M., Morrison, P. F., Oldfield, E. H. Convection-enhanced delivery to the central nervous system. J Neurosurg. 122, (3), 697-706 (2015).
  21. Shen, J., Wang, H. Y., Chen, J. Y., Liang, B. L. Morphologic analysis of normal human lumbar dorsal root ganglion by 3D MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 27, (0195–6108 (Print)), 2098-2103 (2006).
  22. Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121, (4), 851-858 (2014).
Laminotomy for lumbal dorsalrods Ganglion adgang og injektion i svin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).More

Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter