Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Laminotomy for lumbale Dorsal Root Ganglion og injeksjon i svin

doi: 10.3791/56434 Published: October 10, 2017

Summary

Vi beskriver en metode for laminotomy i svin som gir tilgang til lumbale dorsal root Ganglion (DRG) for intraganglionic injeksjon. Injeksjon fremgang overvåkes intraoperatively og histologisk bekreftet opp til 21 dager etter operasjonen. Denne protokollen kan brukes for fremtidig prekliniske studier som involverer DRG injeksjon.

Abstract

Dorsal root Ganglion (DRG) er anatomisk veldefinert strukturer som inneholder alle primære sensoriske neurons under hodet. Dette faktum gjør DRG attraktiv mål for injeksjon av romanen therapeutics rettet mot behandling av kroniske smerter. I små dyr modeller, har laminectomy blitt brukt til rette DRG injeksjon fordi det involverer kirurgisk fjerning av ryggvirvel benet rundt hver DRG. Vi viser en teknikk for intraganglionic injeksjon av lumbale DRG i en stor dyrearter, nemlig svin. Laminotomy utføres for å gi direkte tilgang til DRG bruker standard neurosurgical teknikk, instrumenter og materialer. Sammenlignet med mer omfattende bein flytting via laminectomy, implementere vi laminotomy å spare spinal anatomi mens de oppnår tilstrekkelig DRG tilgang. Intraoperativ utviklingen av DRG injeksjon overvåkes ved hjelp av en ikke-giftig fargestoff. Etter euthanasia på postoperativ dag 21 bestemmes suksess for injeksjon av histology for intraganglionic distribusjon av 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Vi injisere en biologisk inaktive løsning å demonstrere protokollen. Denne metoden kan være brukt i fremtiden prekliniske studier til målet terapeutiske løsninger DRG. Vår metode skal lette testing translatability av intraganglionic liten dyr paradigmer i en stor dyrearter. I tillegg kan denne protokollen tjene som en viktig ressurs for de som planlegger prekliniske studier av DRG injeksjon i svin.

Introduction

Dorsal root Ganglion (DRG) er anatomisk diskret, neuronal samlinger ligger langs virvelsøylen. Hver DRG inneholder primære sensoriske neurons som kode og videresender eksterne stimuli til sentralnervesystemet (CNS) fra bestemte kroppen regioner. For eksempel, begynner smerten av slitasjegikt når smerte reseptorene ligger omtrent en felles oppfatter skadelige stimuli. Denne prosessen kalles nociception. Langsiktig bevissthet om skadelige stimuli fører til kroniske smerter 1.

Kronisk smerte er en hyppig prekliniske studie 2 der ett mål er å utvikle nyttige metoder for målrettet levering av smertestillende til DRG, som intraganglionic injeksjon 3. Men DRG er vanskelige å finne fordi de befinner seg i boney rammen av intervertebral foramina 4. Flere grupper har med hell løse dette problemet ved hjelp av ryggraden kirurgi i gnagere 5,6,7,8,9,10.

I klinikken, laminectomy er en vanlig ryggraden operasjon og refererer til kirurgisk fjerning av ryggvirvel lamina, og dermed unroofing den vertebral kanal 11. Innlemmelse av kirurgiske teknikker råd DRG direkteforbindelser til har vært vellykket i gnagere 5,12, men oversettelse kan være urealistisk vurderer forskjeller i størrelsen på relevante strukturer og hvordan det påvirker farmakokinetikken eller teknisk gjennomførbarhet 13,14. For eksempel bestemt en studie tverrgående ryggmargen diameteren på T10 3.0, 7.0 og 8.2 mm for rotte, gris og menneskelige, henholdsvis 15. Dermed modeller store dyr bedre tilnærmet menneskelige mål av nervøs strukturer.

I svin brukt Raore et al. multi-level laminectomy tilgang til cervical ryggmargen flere intraspinal injeksjoner 16. Prosedyren ble godt tolerert og førte til en fase jeg kliniske der sammenlignbare kirurgisk resultatene var dokumentert 17. Disse resultatene oppfordrer fortsatt bruk av prekliniske store dyr modeller som prediktorer av teknisk gjennomførbarhet og sikkerhet i mennesker.

Hittil finnes ingen detaljert metodikk for kirurgiske og injeksjon av DRG i en stor dyrearter. Hvis du vil begrense dette translasjonsforskning gapet, rapportere vi en protokoll for DRG eksponering og injeksjon via laminotomy i svin. Standard neurosurgical teknikk, instrumenter og materialer ble brukt og metoden ble designet for å etterligne moderne kirurgisk praksis. Vi demonstrere intraganglionic injeksjon med en vandig løsning for lumbale DRG og bekrefte vellykket levering via histology etter postoperativ dag 21.

Protocol

alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Mayo Clinic.

1. forutsetninger av Rigor og reproduserbarhet

  1. sikre rigor av design, følger nasjonale standarder for god laboratorium praksis er til enhver tid og få Intern godkjennelse av IACUC (eller lignende komiteen) før alle dyr engasjement i eksperimenter.
    Merk: Denne protokollen ble utformet for å opprettholde en klinisk trofaste tilnærming. Dermed er materialer, instrumenter og teknikker involvert beskrevet på en måte som er identisk med de høyeste kliniske standardene i mennesker. For eksempel strenge steril teknikk er fulgt, og utløpt materiale bør aldri brukes.
  2. å støtte reproduserbarhet om denne metodikken i eksperimentell omgivelser, utvikle intern standard operasjonsprosedyrer og kontrollere for variasjon i svin rase, vekt, kjønn og alder mellom separate kohorter.
    Merk: Utformingen av denne protokollen var basert på bruk av svin veier 38-53 kg utstyr

2. Pre-operative Animal Care

  1. administrere forebyggende intramuscular (IM) ceftiofur, gitt ved 5 mg/kg, 1 dag før prosedyren.
  2. Rask dyr solid mat og begrense dyr kosmetiske behandlinger, dvs. olje bad, 12 h før prosedyren.
  3. Indusere narkose innen 1 time av prosedyren, IM tiletamine og zolazepam, som Telazol på 5 mg/kg, og IM xylazine, gitt på 2 mg/kg utstyr.
  4. Når indusert, administrere subcutaneous (SC) buprenorfin vedvarende release (SR), gitt på 0,18 mg/kg utstyr.
  5. Plasserer en øre blodåre kateter og utføre rask rekkefølge intubasjon for å plassere en endotracheal tube.
  6. Feste en puls oksymeter med pulsmåling funksjonen på tungen overvåke oksygenering og hjertefrekvens.
  7. Plassere dyret i liggende stilling og klippet huden over dorsum ved hjelp av en elektrisk clipper. Klippet håret over en stor, bilaterale området strekker seg fra midtlinjen sagittal flyet på midtlinjen koronale planet og langs sakral apex til dorsalis spines. Bruke teip for å fjerne hår og frittflytende hud.
  8. Skrubbe det beskårede området opp til 3 ganger med varmt vann og såpe og tørke huden med en lofri håndkle.
  9. Merke bilaterale anatomiske landemerker bruke en kirurgisk merking. Merke siste ribbeina, iliaca toppene, spinous prosessene og transverse prosesser.
    Merk: Ved å markere den siste ribbeina, iliaca toppene og transverse prosesser, lumbalcolumna er grenser langs sin superior, inferior og laterale grenser, henholdsvis. Denne protokollen er utviklet for å veilede tilgang og injeksjon av noen lumbale DRG rundt. For referanse, overlegen iliaca toppene justere L3 eller L4 ryggvirvel nivået.
  10. Dekke dyret med et varmt teppe for transport til operativ suiten.

3. Posisjonering i Operative Suite

  1. forsiktig heis og posisjon dyret utsatt i en endret stor Human dyr slynge med polstret abdominal blenderåpning.
    Merk: Abdominal blenderåpning lar reduksjon i abdominal trykket lik Wilson rammen under menneskelige inngrep i ryggraden. Igjen, reduserer dette intraoperativ blødning fra spinal blodkar. Seilet er en fordel fordi bena kan henge fritt gjennom polstret åpninger som beskytte dyr fra eksterne nerve impingement. Men fordi slynge rammen er laget av metall, bør det bli utfylt med isolasjon å unngå elektrisk kortslutning og utilsiktet dyr brenne. Et teppe kast kan plasseres for å plassere hodet i en komfortabel stilling, avhengig av dyret.
  2. Behold narkose med 1-3% inhalert (IH) isoflurane, titreres med effekt. Fukt øyne med ophthalmica salve og forsiktig tape dem stengt.
  3. Plasseringslinjer for vitale tegn overvåking dokumentet temperatur, blodtrykk, puls og oksygenering. Overvåke ventilasjon ved capnography.
  4. Plasserer en selvklebende, engangs elektrokirurgisk dispersiv elektrode over til venstre eller høyre skulderblad.
  5. Administrere varmet Lactated Ringer ' s som vedlikehold væske gjennom øret blodåre kateter. Gi væsker med en hastighet på 5-10 mL/kg/h.
  6. Plasserer en tvungen luft oppvarming enhet over regionen bryst og livmorhalskreft og unngå dekker siste ribbeina.

4. Sterilt forberedelse av Operative feltet for en venstre-sidig injeksjon

Merk: fra dette tidspunktet, fortsetter i strenge sterilt mote.

  1. Forberede huden overliggende lumbalcolumna begynnelsen med bred anvendelse av 0,7% jod povacrylex og 74% isopropyl alkohol ifølge produsenten ' s instruksjoner. For å sikre at guide nålen senere kan plasseres i et sterilt mote, lateralize program ved siden av planlagte injeksjon ved å utvide antisepsis mot midtlinjen koronale flyet forbi merket transverse prosessene.
  2. Sted engangs kirurgisk håndklær i rektangulære mote å skissere planlagt snitt området, som er over midtlinjen langs merkede lumbale spinous prosessene.
  3. Bruk lim antimikrobielle incise drapere over operative håndklær og utsatt huden. Klemme gardiner på plass og utvide draperi kanten av feltet operativ.
  4. Sikre en loddrett drapere til polakkene på hodet av slynge mellom feltet operative og overvåking teknikeren.
  5. Sikker linjer for sugekraft og elektrokirurgi innen operativ ved fastklemming til de sterile gardiner. Passerer de ledige endene på rør og ledninger av det sterile feltet.

5. Huden snitt og Subperiosteal disseksjon

  1. Palpate lumbale spinous prosessene langs midtlinjen og identifisere 3 sammenhengende ryggvirvel nivåer.
  2. Bruk #15 skalpell for å åpen en 8-12 cm midtlinjen sagittal snitt gjennom incise drapere direkte bakenfor spinous prosesser. Opprettholde hemostasen gasbind tamponade og monopolar elektrokirurgi.
    Merk: Omsorg bør tas ikke å avvike fra midtlinjen som i snitt er avansert i fremre retning fordi dette begrenser blødning fra paraspinal musklene. Periodiske palpasjon for spinous prosesser forenkler avansement. Selv som Weitlaner, Meyerding eller Gelpi retractors kan plasseres og flyttet for å lette dissection. Sug brukes til å opprettholde synlighet.
  3. Dissekere subkutant vev og fett med monopolar elektrokirurgi til thoracolumbar fascia er nådd. Palpate spinous prosessene dyp til thoracolumbar konseptkjedene og kuttet fascia langs midtlinjen å avsløre supraspinous ligament spenner mellom spinous prosesser.
    Merk: Thoracolumbar fascia er identifisert som en organisert, aponeurotic kappe med et bindevev korn som fletter i en skrå, lateral mediale retning. På dette punktet i snitt kan bli forlenget i enten over eller under retning for å sikre at 3 spinous prosesser er fullt synlig centermost spinous prosessen justert i midten av feltet disseksjon.
  4. Bruker en #15 blad for å plassere en 2 mm dyp parasagittal snitt gjennom supraspinous ligament bakenfor hver spinous prosess. Plasser hvert snitt langs den venstre tredje av bakre overflate spinous prosessen.
  5. Forsiktig løslate supraspinous ligament på hvert nivå langs hver omgision bruker en 5 mm friere heis.
  6. Identifiserer subperiosteal flyet og dissekere innenfor det flyet langs lateral overflaten av hver spinous prosess.
  7. Utføre subperiosteal disseksjon selv disseksjon oppnås på hver spinous prosess på en parallell måte å sikre at en mild,.
  8. Incise paraspinal muskel vedlegget langs interspinous områder bruke monopolar elektrokirurgi sammen med subperiosteal disseksjon.
  9. Identifisere lamina på hvert nivå og fortsette subperiosteal disseksjon lateralt til den laterale begrensning av 2 zygapophyseal leddene som kobler 3 eksponert ryggvirvlene og å nå den laterale kanten av lamina mellom leddene, kalt Legg pars interarticularis.
    Merk: Pars interarticularis er den bakre kanten av intervertebral foramen der DRG ligger. Noen ganger oppstår en liten åre fra et foramen ligger på bakre overflate på lamina. Disse blodårene har en tendens til å sprekke under subperiosteal dissection. Hemostasen gjøres enkelt ved hjelp av en kombinasjon av bipolar elektrokirurgi og bein voks på foramen.

6. Enkeltnivå Laminotomy

  1. identifisere målet for laminotomy som centermost lamina mellom og mediale i 2 zygapophyseal leddene.
  2. Spor lamina til dårligere kanten, til et punkt bare mediale til sammenhengende dårligere articular prosessen av caudal zygapophyseal.
  3. Bruk en 5 mm friere heis eller curette for å palpate overgangen mellom caudalmost kanten av lamina og sentrale kanalen.
    Merk: Omsorg tas ikke tvinge palpating apparatet fremre som dette vil kontakte dural sac og ryggmargen. Merk at ryggmargen i svin utvides forbi lumbalcolumna 18. En intervertebral plate rongeur kan brukes til å fjerne ekstra bløtvev overliggende dette området for å lette palpasjon.
  4. Bruk en 2 mm opp-bite, 45-graders Kerrison rongeur å ekstra bein i en piece-wise måte. Fjerne bein langs bunnen av spinous prosessen overlegent til et nivå bare caudal til caudal overflaten av pedicle og ut til siden i sin grad.
  5. Bruk vinklet bein rongeurs å hjelpe til med fjerning av bein. La dårligere articular prosessen som var koblet til lamina på plass før laminotomy er hovedsakelig fullført.
  6. Bekrefte at dårligere articular prosessen er fritt mobile og tilknyttede bare ved zygapophyseal skjøten capsule. Incise kapsel med et #15 eller #11 blad.
  7. Fjerne dårligere articular prosessen på en piece-wise måte, men la tilstøtende overlegen articular prosessen intakt.
    Merk: Laminotomy er fullført, utføres hemostasen med bipolar elektrokirurgi. Monopolar elektrokirurgi brukes ikke på grunn av nærheten til nevrale strukturer. Bein voks kan plasseres langs områder av blødning fra utsatt bein og absorberbare gelatin svamper kan brukes til å få hemostasen nær bløtvev. Cottonoid er en nyttig verktøyet å veken serous fluid og blod fra dissection.

7. Disseksjon av DRG

  1. Evakuer epidural fettet i en piece-wise mote fra overfladisk dyp begynner medialt og fortsetter til siden. Fjerne fett ved mild disseksjon med bipolar tang og sug 6-10 fransk Frazier sugekraft tips.
    Merk: Loupe forstørrelse eller bruk av dissecting mikroskop er nyttig å gi detaljnivået som trengs for å trygt evakuere epidural fett og oppnå grundig hemostasen av epidural venøs plexus med bipolar elektrokirurgi.
  2. Identifisere dural sac langs midtlinjen kjører i en superoinferior retning, parallelt aksen i huden snitt. Fjerne epidural fett langs dural sac før dural sac kan sees å gi opphav til dural nerve rot ermet.
  3. Spor dural ermet lateralt og inferiorly av epidural fett evakuering før det er sett å forstørre rundt DRG.
    Merk: Identifisere DRG oval form og gult til oransje. På midten av lumbale ryggraden er DRG vanligvis 4-6 mm i størrelse, lengste i medialt til lateralt retning, og ligger direkte mindreverdige eller 2-3 mm mediale til sine respektive pedicle. En sløv, rettvinklet nerve kroken kan brukes til å forsiktig palpate for pedicle.
  4. Evakuere epidural fett lateralt, forbi DRG, til tilstøtende spinal nerve er sett.
    Merk: Hvis det oppstår durotomy, reparere den av vanntett nedleggelse bruker 6-0 nylon Sutur og glatt mikro nål sjåfør i en enkel kjører stich.

8. Injeksjon av DRG

  1. Bruk en 22-gauge spinal nål å veilede banen til en 32-gauge konveksjon forbedret levering (CED) nål. Punktering 22-gauge guide nålen gjennom huden og paraspinal musklene.
    Merk: CED nålen er designet for å oppnå væske konveksjon i vev, også kjent som bulk flyt, på grunn av press graderinger 19 , 20.
  2. Mål guide nålen langs en bane som tilnærmet langsgående aksen av DRG og resulterer i pinne-spissen fremvoksende fra lateral paraspinal veggen av feltet disseksjon.
  3. Fine tune nål banen til p-lumen justert til midten av DRG.
    Merk: Guide nålen bør aldri tillates å kontakte DRG.
  4. Utarbeide sterilt injectate sterile sprøyter til og koble sprøyten til sterilt infusjon slangen.
  5. Sikre slangen til CED nålen og hånd sprøyten ut av sterile feltet. Koble sprøyten til en programmerbar sprøytepumpe.
    Merk: Slangen er forberedt til en lengde på 5 føtter å sikre at sterilitet og mobilitet er opprettholdt. Også det er av avgjørende betydning at ingen luftbobler innføres i løsning.
  6. Forhånd injectate til uttrykk er sett fra CED pinne-spissen.
  7. Plasser CED nålen i guide nål lumen og vil avansere langsomt CED nålen før det framgår guide pinne-spissen. Sikre at DRG ikke er punktert under nål justering.
  8. Fininnstilling guide nål plasseringen langs den lange aksen av sin bane å avgjøre den endelige plasseringen av CED tuppen.
  9. Sikker guiden nål og CED strikkes sammen med sikringsanlegg pinnen huber når dybde og justering av guide og CED nåler er oppnådd.
  10. Bekreft at alle injeksjon apparater tilkoblinger er sikret, inkludert guide nål, CED nål, og tilkoblede rør lastet med injectate.
  11. Forhånd guide nålen langs den lange aksen til tilnærmet CED pinne-spissen og DRG.
  12. Punktering DRG med CED pinne-spissen.
  13. Submerse CED pinne-spissen i tredimensjonale sentrum av DRG.
    Merk: DRG er en tredimensjonal struktur med variabel størrelse og form, DRG eksponering må fullføres for å nøyaktig sted CED pinne-spissen sant midt i DRG. Sant DRG sentrum ligger i skjæringspunktet mellom sine tre anatomiske akser, nemlig det fremre til bakre, lateral til mediale og overlegen til dårligere aksene.
  14. Leverer 100 μL injectate av CED bruker en uteksaminert hastighet og volum av 3 trinn.
  15. Levere 4 μl 2 μL/min for første skritt. Levere 8 μL til 4 μL/min for det andre trinnet. Levere 88 μL på 8 μL/min for det tredje og siste trinnet.
    Merk: Tillater en 3 minutters pause mellom trinn og etter det siste trinnet å tillate press balanse.
  16. Trekke injeksjon apparatet etter siste injeksjon steg og 3 minutters pause langs den lange aksen i en jevn og skånsom bevegelse.
    Merk: Injisert løsninger som er fargeløs fargestoff er inkludert i løsningen i en konsentrasjon av 0,1% vekt/volum å bistå i visuell vurdering av injectate distribusjon 12. Også viktig fargestoff 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) er inkludert i løsningen i en konsentrasjon av 0,25 μg/μL når studien design krever histologic vurdering av injectate distribusjon 5.

9. Nedleggelse

  1. bruke 3 runder med varmt saltvann vanning til kirurgiske området før nedleggelsen å mobilisere og tømme området av rusk, dvs beinfragmenter. Bruk sugekraft for å gjenopprette saltvann og rusk.
    Merk: Grundig hemostasen er sikret når vanning står klart. Hemostatic agenter (gelatin svamp) og cottonoid fjernes på dette tidspunktet. Sikre at alle materialer og instrumenter er fjernet fra webområdet snitt før nedleggelsen.
  2. Bruker en 3 lag teknikk for nedleggelse.
  3. Sutur thoracolumbar fascia bruker 0 Sutur i en enkel, avbrutt, noninverted mote. Plasser en stich hver 5-8 mm for å oppnå vanntett nedleggelsen.
  4. Sutur subkutant vev med 2-0 Sutur i en enkel, avbrutt, invertert mote med en maske plassert hver 5 til 8-mm å oppnå tilstrekkelig styrke.
  5. Lukker huden med 0 Sutur i en enkel, kjører eller avbrutt mote.
  6. Bruker en nål teller for å sikre at ingen sharps er ukjent for
  7. Vanne huden med saltvann, tørker huden og plassere selvklebende bandasje strimler vinkelrett innsnitt.
  8. Sted gasbind på toppen av bandasjen strimler og legge et siste lim antimikrobielle incise drapere.

10. Postoperativ Animal Care

  1. Extubate, dekk med varme tepper og transportere dyr til utvinning.
  2. Følger standard institusjonelle operasjonelle prosedyrer for postoperativ overvåking og utvinning fra overleve kirurgi. Minst observere dyret hvert 15 min før retur av bevissthet, hver time til full bedøvende utvinning er oppnådd, og to ganger daglig etterpå.
  3. Gi postoperativ smerte ledelse ved å tilsette IM eller muntlig carprofen, gitt ved 4 mg/kg, én gang daglig for 5 dager fra postoperativ dag 0. Administrere SC buprenorfin SR, gitt på 0,18 mg/kg, en gang på postoperativ dag 2.
  4. Administrere postoperativ antisepsis ved å gi IM ceftiofur, gitt ved 5 mg/kg, en gang på postoperativ dag 4.
  5. Fjerne bandasjen på post-operativ dag 5-7. Fjerne bildet når sår helbredelse er fullført, vanligvis på post-operativ dag 10-14.
  6. Human euthanize dyret i henhold til standard institusjonelle operasjonsprosedyrer når studie sluttpunktet nås.

Representative Results

Histologic vurdering av injectate oppslag
Vellykket levering av injectate til DRG bestemmes av histologic vurdering av DAPI spredt. Teknikken innebærer posisjonering pinne-spissen tredimensjonale midt i DRG. Derfor bestemmes vellykket leveranse vurderer omfanget av DAPI flekker fra histologic inndelinger i (sentrale DRG deler) og fjern (eksterne DRG inndelinger) til pinne-spissen. Representerer en vellykket injeksjon av en DRG figur 1A og figur 1B . DAPI flekker var jevnt spredt gjennom både det sentrale og perifere DRG parenchyma. Dermed er en vellykket DRG injeksjon illustrert av diffus spredning av DAPI flekker i tredimensjonale DRG arkitektur. Sub-optimale injeksjon illustreres av inkonsekvent flekker. For eksempel, angir minimal flekker (figur 1 c) eller fokal flekker langs den ytre kanten men ikke indre del av DRG parenchyma (figur 1 d) mislykket injeksjon. Også illustrerer vurdert sammen, figur 1 c (sentrale DRG inndelingen) og figur 1 d (eksterne DRG inndelingen) mangel på konsekvent flekker i tre dimensjoner for dette enkelt lumbale DRG.

Figure 1
Figur 1 : Tredimensjonale vurdering av DAPI distribusjon i injisert DRG. (A) en sentral del fra en injisert lumbale DRG representant for et vellykket resultat. Farging av markør fargestoffet DAPI er jevnt spredt over hele den hele DRG i to dimensjoner. (B) en parallell, eksterne delen av den samme DRG i (A), illustrerer konsistensen av DAPI spredt i et fly avsnitt, bekrefter en vellykket injeksjon i tre dimensjoner. (C) en sentral del fra en injisert lumbale DRG representant for en sub-optimale utfallet. Minimal å ingen flekker av DAPI sett bortsett fra sporadisk foci. (D) en parallell, perifere del av den samme DRG c, illustrerer delvis distribusjon av DAPI langs DRG periferien. Blå: DAPI. Red: autofluorescence. Skalere barer = 500 μm (A og C), 100 μm (B og D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi søkte å beskriver en metode for kirurgiske eksponering av DRG via laminotomy og intraganglionic injeksjon i en sunn store dyrearter, spesielt svin. I Red, en lignende metode er detaljert 12 og brukes til å levere konvensjonelle pharmacologic agenter 8,10 og viral vektorer 6,7,9,12 til DRG. Resultatene fra over små dyrestudier er lovende, og vi håper våre protokollen vil bane vei for andre å oversette disse tidligere funn til svin. Friske og syke dyr ble brukt i de ovenfor studiene som støtter nytten av små dyr i preklinisk forskning. Uunngåelig, store dyr modeller vil bli pålagt å gjøre best tilgjengelige sammenligningen til menneskelig DRG i størrelse og injectate. For eksempel er avviket i DRG størrelse tydelig mellom rotter og mennesker. L5 DRG i voksen, hannrotter måler ca 2,6 x 1,5 mm 5 sammenlignet med 11,6 x 6,6 mm i voksen, mannlige mennesker 21. Basert på live røntgen målinger i svin, ble L5 DRG funnet for å være ca 8,0 x 6,0 mm 22. Derfor ligger svin som en spesielt nyttig Art for prekliniske studien på grunn av strukturelle likheter med menneskelige nervesystemet og nærliggende muskel anatomi. Dette er dokumentert av omvendt oversettelsen brukt til å utforme denne protokollen det utføres i klinikken. Videre svin bruker dyr og er av økende viktighet i biomedisinsk forskning. Denne protokollen støtter prekliniske studier av intraganglionic levering av injiserbare løsninger å avansere tidligere funn fra arbeid i gnagere til store dyr. Denne protokollen kan dermed fremme romanen strategier for behandling av kroniske smerter som integrerer anatomisk selektiv levering teknikker med romanen molecularly selektiv agenter, som vi forutsi, kan ha potensial til å transformere smerte medisin 3.

Flere merknader for vellykket DRG injeksjon

Den prelaminar periosteum på lumbal vertebrale nivåer i svin fortsetter cephalad i stedet for ligamentum flavum. Under laminotomy, periosteum kan være lett atskilt med plassering av Kerrison rongeur og kan etterligne utseendet til dura mater. Det er et kritisk steg til skille den ligamentum flavum, periosteum, epidural fett og dura sac som dissection utføres. Videre eksponering av epidural plass er mer effektiv og innebærer mindre blødning hvis periosteum fjernes samtidig med lamina. Hvis periosteum ikke fjernes med bein, kan det være en avbildning med #11 blad og fjernet for å utsette underliggende epidural fettet.

Dette må være balansert med mål DRG og injeksjon for å ikke skade er en topp prioritet. Dermed er forsiktig ikke for å fremme evakueringen av epidural fett lenger peke eller anteromedially enn nødvendig å tillate positiv identifikasjon av dural sac, dural nerve rot ermet og DRG. Disseksjon i anteromedial retning der dural sac gir opphav til dural nerve rot ermet er spesielt farlig som en langsgående epidural blodåre vil oppstå. Videre øker disseksjon i denne retningen risikoen for utilsiktede durotomy, gruppeanrop utstrømming av cerebrospinalvesken fra overflaten av dural sac.

Et siste kritisk punkt er identifisere dural sac, dorsal røtter, DRG i sin helhet, og spinal nerve. Dette bidrar til å etablere 4 stykker av konvergerende anatomiske bevis for at sikre fullstendig DRG definisjon. Definere DRG i sin helhet er nødvendig for å plassere pinne-spissen på tredimensjonale midten, som tillater CED nålen å etablere en konsekvent trykkgradient samtidig maksimere avstanden til rundt anatomiske grensene. Begge faktorer øke volumer levert og rekke intraparenchymal spre 19,20. Levering av injectate på et sted som ikke er sanne anatomiske sentrum resultatene i sub-optimale injeksjon fordi inkonsekvent press resultere når injectate lekkasjer fra det nærliggende området DRG punktering 20.

En vanskelighet med å bruke en CED nål for DRG injeksjon er samsvar. Når injeksjon har startet, pinne-spissen må holdes så stille som mulig eller annet trykkgradienter vil forsvinne på grunn av plutselige forandringer i samsvar 20. Åndedretts bevegelse er en kilde til kontinuerlig bevegelse under injeksjon. Risiko for p bevegelse sekundært til respiratoriske ekskursjonen fjernes imidlertid i stor grad av forankring CED og guide nålen innen den paraspinal muskulaturen før punktering av DRG som både nål og DRG flytter i synkronisering med åndedrett. Injeksjon varigheten for et volum av 100 μL totaler 24 min hastigheten trappet beskrevet her. Forsiktighet bør utvises begrense eksterne avbrudd av hele injeksjon apparater samtidig. Arrangement av kirurgiske feltet, personell, og rundt hindringer bør endres etter behov før injeksjon starter å sikre en uforstyrret grensesnittet mellom CED pinne-spissen og DRG.

Disclosures

Ingen; forfatterne har ingen konflikter av interesse knyttet til denne studien.

Acknowledgments

Studien ble utført med støtte av Schulze Family Foundation (til A.S.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Large humane animal sling Britz & Company 002539 Modified to include abdominal aperture
Adhesive patient return electrode - 9 inch Medtronic E7506 -
Ranger blood & fluid warming system 3M 24500 -
Lactated Ringer's fluid Hospira 0409-7953-09 -
Force air warming device 3M 77500 -
Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) 3M 8630 -
Sterile disposable surgical towels Medline MDT2168286 -
Ioban 2 incise drape 3M 6651EZSB -
Disposable suction canister and tubing Medline DYND44703H -
Button switch electrosurgical monopolar pencil Medtronic E2450H -
Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch Bovie A826 -
#15 blade Miltex 4-315 -
#11 blade Miltex 4-311 -
4 x 4 surgical gauze Dynarex 3262 -
Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch Miltex 11-618 -
Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch Sklar 42-2078 -
Gelpi self-retaining retractor, 7 inch Sklar 60-6570 -
Freer elevator, 5 mm Medline MDS4641518F -
Bone wax Ethicon W31G -
Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm Sklar 42-2852 -
Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm Medline MDS4052802 -
Leksell angled rongeur, 2 mm Sklar 40-4097 -
Gelfoam, size 50 Pfizer AZL32301 -
Cottonoid patty Medtronic 8004007 -
Frazier suction tip, 6 Fr Sklar 50-2006 -
Frazier suction tip, 10 Fr Sklar 50-2010 -
Dandy blunt right angle nerve hook Medline MDS4005220 -
Nylon suture, 6-0 Ethicon 697G -
Castroviejo smooth micro needle holder Medline MDG2428614 -
22 gauge Quinke point spinal needle Halyard Health 18397 -
32 gauge CED needle with locking Luer hub See comments n/a As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014).
Polyethylene tubing, 5 feet Scientific Commodities BB31695-PE/05 -
Monoject syringe, 3 mL Kendall SY15352 -
NanoJet syringe pump Chemyx 10050 -
DAPI Sigma-Aldrich D9542 -
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 -
Bulb irrigation syringe Medline DYND20125 -
Fine-toothed Adson forceps Medline MDS1000212 -
Vicryl suture, 0 Ethicon J603H -
Vicryl suture, 2-0 Ethicon J317H -
Needle counter Medline NC20FBRGS -
Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch 3M R1547 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millan, M. J. The induction of pain: An integrative review. Prog Neurobiol. 57, (1), 1-164 (1999).
  2. Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. (2016).
  3. Pleticha, J., Maus, T. P., Beutler, A. S. Future directions in pain management: integrating anatomically selective delivery techniques with novel molecularly selective agents. Mayo Clin Proc. 91, (4), 522-533 (2016).
  4. Standring, S. The anatomical basis of clinical practice. Elsevier Churchill. Edinburg. (2005).
  5. Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199, (1), 43-55 (2011).
  6. Zhao, X., et al. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 16, (8), 1024-1031 (2013).
  7. Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., Huang, L. Y. M. Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 14, (9), 897-906 (2003).
  8. Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177, (2), 397-402 (2009).
  9. Mason, M. R. J., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18, (4), 715-724 (2010).
  10. Jelicic Kadic, A., Boric, M., Kostic, S., Sapunar, D., Puljak, L. The effects of intraganglionic injection of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitors on pain-related behavior in diabetic neuropathy. Neurosci. 256, 302-308 (2014).
  11. Greenberg, M. S. Handbook of neurosurgery. Thieme. (2010).
  12. Yu, H., Fischer, G., Hogan, Q. H. AAV-mediated gene transfer to dorsal root ganglion. Methods Mol Biol. 1382, 251 (2016).
  13. Yaksh, T. L., et al. Pharmacology and toxicology of chronically infused epidural clonidine HCL in dogs. Toxicol Sci. 23, (3), 319-335 (1994).
  14. Federici, T., et al. Surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs. J Vis Exp. (70), e4371 (2012).
  15. Lee, J. H. T., et al. A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. J Neurotrauma. 30, (3), 142-159 (2013).
  16. Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, (3), e164 (2011).
  17. Riley, J., et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: A phase I safety trial, technical note, and lumbar safety outcomes. Neurosurg. 71, (2), 405-416 (2012).
  18. Olmarker, K., Holm, S., Rosenqvist, A., Rydevik, B. Experimental nerve root compression. A model of acute, graded compression of the porcine cauda equina and an analysis of neural and vascular anatomy. Spine. 16, (1), 61-69 (1991).
  19. Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, (6), 2076-2080 (1994).
  20. Lonser, R. R., Sarntinoranont, M., Morrison, P. F., Oldfield, E. H. Convection-enhanced delivery to the central nervous system. J Neurosurg. 122, (3), 697-706 (2015).
  21. Shen, J., Wang, H. Y., Chen, J. Y., Liang, B. L. Morphologic analysis of normal human lumbar dorsal root ganglion by 3D MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 27, (0195–6108 (Print)), 2098-2103 (2006).
  22. Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121, (4), 851-858 (2014).
Laminotomy for lumbale Dorsal Root Ganglion og injeksjon i svin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).More

Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter