Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção
Summary
Aqui descrevemos uma técnica que combina o mutagenesis transposon com sequenciamento de alto rendimento para identificar e quantificar os mutantes leptospiral de transposon em tecidos após um desafio de hamsters. Este protocolo pode ser usado para mutantes de tela para a sobrevivência e disseminação em animais e também pode ser aplicado aos estudos em vitro .
Abstract
Este manuscrito, descrevemos um transposon sequenciamento (Tn-Seq) técnica para identificar e quantificar os mutantes de Leptospira interrogans alterados em fitness durante a infecção de hamsters sírios dourados. TN-Seq combina o mutagenesis aleatório transposon com o poder da tecnologia de sequenciamento de alta produtividade. Animais são desafiados com uma piscina de mutantes transposon (pool de entrada), seguida de colheita de sangue e tecidos alguns dias mais tarde para identificar e quantificar o número de mutantes em cada órgão (piscinas de saída). As piscinas de saída são comparadas com o pool de entrada para avaliar a aptidão na vivo de cada mutante. Esta abordagem permite a triagem de uma grande piscina de mutantes em um número limitado de animais. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser executado com qualquer modelo animal de leptospirose, modelos de hospedeiro reservatório tais como ratos e modelos de infecção aguda, tais como os hamsters, bem como estudos em vitro . TN-Seq fornece uma ferramenta poderosa para a tela para mutantes com defeitos de aptidão in vivo e in vitro .
Introduction
Identificação de genes de virulência para algumas bactérias, tais como Leptospira spp., é difícil devido ao número limitado de ferramentas genéticas disponíveis. Uma abordagem comumente utilizada é a criação de uma colecção de mutantes por mutagênese aleatória transposon, seguido da identificação do local de inserção em cada mutante e virulência testes de mutantes transposon individuais em um modelo animal. Essa abordagem é demorado, caro e requer um grande número de animais.
Quando o mutagenesis aleatório foi desenvolvido para o patógeno Leptospira interrogans, genes envolvidos na virulência foram identificados pelo teste mutantes individuais em um modelo animal1. Os mutantes foram selecionados com base em critérios como suas potenciais funções na sinalização ou motilidade ou sua membrana externa prevista ou superfície local. Como a maioria dos leptospiral genes codificam proteínas hipotéticas de função desconhecida2, selecionando os mutantes baseiam em limites esses critérios a capacidade de detectar genes de virulência leptospiral romance.
Mais recentemente, piscinas de mutantes de transposon L. interrogans foram projectadas para infecciosidade no hamster e mouse modelos3. Cada animal foi desafiado com uma piscina de até 10 mutantes. Infecciosidade de um mutante foi marcada como positivo se foi detectado por PCR das culturas obtidos de sangue e rim. Teste de PCR foi trabalhoso porque necessitava de uma reação de PCR individual para cada mutante na piscina. Porque a frequência de cada mutante nas culturas não foi quantificada, a abordagem foi inclinada para identificação de mutantes altamente atenuadas.
Descrevemos um transposon sequenciamento (Tn-Seq) técnica, como uma estratégia para a tela de forma mais eficiente para genes de virulência. TN-seq consiste da criação de uma biblioteca de mutantes por mutagénese transposon seguido por sequenciamento paralelo maciço4,5,6. Brevemente, transposon mutantes são agrupados, inoculados em animais e posteriormente recuperados de diferentes órgãos (piscinas de saída). O DNA das piscinas saída é extraído e digerido com enzimas de restrição ou distorcido pelo sonication. São realizadas duas rodadas de PCR direcionamento das junções dos locais de inserção de transposon. Esta etapa permite a adição dos adaptadores necessários para o sequenciamento. Os produtos resultantes da PCR são analisados por sequenciamento de alto rendimento para identificar o local de inserção do transposon de cada mutante da piscina junto com a sua abundância relativa, que é comparada com a composição inicial do grupo de mutantes.
A principal vantagem desta abordagem é a capacidade de tela simultaneamente um grande número de mutantes com um pequeno número de animais. TN-Seq não exige o conhecimento prévio dos locais de inserção do transposon que aumenta as chances de descobrir novos Leptospira-genes específicos envolvidos na virulência com menos tempo e maior eficiência. Porque leptospiral fardo nos tecidos é relativamente alto em roedores modelos suscetíveis a letal infecção (tipicamente 104 108 bactérias/g de tecido)7,8,9 , bem como em hospedeiros reservatório 10,11, os tecidos podem ser analisados diretamente sem a necessidade de cultura, reduzindo preconceitos devido ao crescimento em vitro .
Em estudos de Tn-Seq com a maioria dos patógenos bacterianos descritos até à data, a alta frequência de mutagênese insercional permitido infecção com grandes piscinas contendo mutantes coletivamente tendo múltiplas inserções espaçadas transposon dentro de cada gene4 ,12,13,14. TN-Seq também foi desenvolvido para uma bactéria, para o qual a frequência de mutagênese é muito inferior6. Com Leptospira, uma biblioteca de mutantes transposon pode ser gerada introduzindo o transposon em um plasmídeo sequência por conjugação, como descrito por Slamti et al.15. No entanto, a frequência de mutagénese transposon de L. interrogans é baixa. Quando o transposon Himar1 foi introduzido em um plasmídeo conjugativo, a frequência de transconjugant foi relatada para ser apenas 8,5 x 10-8 por beneficiário da pilha com a cepa de Lai de L. interrogans16 e é provável que seja da mesma forma pobre com a maioria das outras cepas de L. interrogans. O protocolo descrito aqui é em parte com base no que desenvolvi para Borrelia burgdorferi, em que a frequência de mutagênese insercional transposon é também baixa6.
Para a nossa experiência piloto com o protocolo17, realizamos mutagênese transposon com L. interrogans sorovar Manilae estirpe L495 por causa do sucesso de outros grupos em isolamento de mutantes de inserção de transposon na estirpe juntamente com a sua baixa DL50 (dose letal) para virulência1. Nós selecionados 42 mutantes por Tn-Seq e identificou vários candidatos mutantes defeituosos em virulência, incluindo dois com inserções em um gene de adenilato ciclase de candidato. O teste individual dos dois mutantes em hamsters confirmou que eles estavam deficientes em virulência17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora os resultados de nossa experiência piloto para hamster desafiada intraperitonealmente com 42 L. interrogans mutantes são apresentados17, esperamos que os maiores piscinas de mutantes podem ser rastreadas por Tn-Seq Porque a frequência de transconjugants é baixa (100-200 transconjugants/acasalamento), vários acasalamentos são necessários para gerar um número suficiente de mutantes para grandes experiências de Tn-Seq. Manter um grande número de mutantes em culturas líquida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um prêmio de mérito de assuntos de veteranos (a D.A.H.) e um Instituto Nacional de saúde conceder R01 AI 034431 (a D.A.H.).
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
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