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Immunology and Infection

Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

Nous décrivons ici une technique qui associe une mutagenèse par transposon séquençage haut-débit pour identifier et quantifier des mutants de leptospires transposon dans les tissus après une contestation des hamsters. Ce protocole peut être utilisé à des mutants de l’écran de survie et de la diffusion chez les animaux et peut également être appliqué à des études in vitro .

Abstract

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un transposon séquençage (Tn-Seq) technique pour identifier et quantifier des mutants de Leptospira interrogans altérés de remise en forme au cours de l’infection de hamsters syriens dorés. TN-Seq combine la mutagénèse aléatoire transposon avec la puissance de la technologie de séquençage haut-débit. Animaux est mis au défi avec une piscine de mutants transposon (entrée piscine), suivie de la récolte du sang et des tissus quelques jours plus tard afin d’identifier et de quantifier le nombre de mutants dans chaque organe (sortie piscines). Les piscines de sortie sont comparés à la piscine d’entrée afin d’évaluer l’aptitude en vivo de chaque mutant. Cette approche permet le dépistage d’une grande piscine de mutants dans un nombre limité d’animaux. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être effectué avec n’importe quel modèle animal de la leptospirose, modèles hôte réservoir comme les rats et les infections aiguës comme les hamsters, ainsi que des études in vitro . TN-Seq fournit un outil puissant à l’écran pour des mutants présentant des défauts de remise en forme in vivo et in vitro .

Introduction

Identification des gènes de virulence pour certaines bactéries, comme Leptospira spp., est difficile en raison du nombre limité d’outils génétiques disponibles. Une approche couramment utilisée est la création d’une collection de mutants par mutagenèse aléatoire transposon, suivie de l’identification du site d’insertion dans chaque mutant et test de virulence des mutants de transposon individuels dans un modèle animal. Cette approche est longue et coûteuse et nécessite un grand nombre d’animaux.

Lorsque la mutagénèse aléatoire a été d’abord développé pour le pathogène Leptospira interrogans, gènes impliqués dans la virulence ont été identifiés en testant différents mutants dans un modèle animal1. Mutants ont été sélectionnés selon des critères comme leurs rôles potentiels dans la signalisation ou la motilité ou leur prédit la membrane externe ou surface emplacement. Comme la majorité des leptospires gènes codent pour des protéines hypothétiques de fonction inconnue2, sélection des mutants basé sur ces limites de critères la capacité à découvrir des gènes de virulence de leptospires roman.

Plus récemment, piscines de mutants de transposon L. interrogans ont été examinés pour l’agent infectieux dans les modèles3hamster et souris. Chaque animal a été contestée avec une piscine de 10 mutants. Infectiosité d’un mutant a été marquée comme étant positif s’il a été détecté par PCR des cultures obtenues à partir de sang et les reins. Test de PCR a été laborieux car il exigeait une réaction de PCR individuelle pour chaque mutant dans la piscine. Parce que la fréquence de chaque mutant dans les cultures n’avait pas été évaluée, l’approche était biaisée vers l’identification des mutants très atténués.

Nous décrivons un transposon séquençage (Tn-Seq) technique, comme une stratégie pour dépister plus efficacement les gènes de virulence. TN-seq consistant en la création d’une bibliothèque de mutants par mutagénèse du transposon suivie par séquençage parallèle massive4,5,6. Brièvement, transposon mutants sont mis en commun, inoculés dans animaux et par la suite récupérés de différents organes (sortie piscines). L’ADN de la piscine de sortie est extraite et digéré par les enzymes de restriction ou cisaillée par sonication. Deux cycles de PCR ciblant les jonctions des sites d’insertion de transposon sont effectuées. Cette étape permet l’ajout de l’adaptateur nécessaire pour le séquençage. Les produits PCR obtenus sont analysés par séquençage haut-débit pour identifier le site d’insertion de transposon de chaque mutant de la piscine ainsi que de leur abondance relative, qui est comparé à la composition initiale du bassin de mutant.

Le principal avantage de cette approche est la capacité à l’écran simultanément un grand nombre de mutants avec un petit nombre d’animaux. TN-Seq n’exige pas la connaissance préalable des sites d’insertion de transposon qui augmente les chances de découvrir des nouveaux Leptospira-certains gènes impliqués dans la virulence avec moins de temps et une plus grande efficacité. Parce que le fardeau de leptospires dans les tissus est relativement élevée en rongeur modèles susceptibles d’être mortelles infections (typiquement 104 à 108 bactéries/g de tissu)7,8,9 , ainsi que dans des hôtes réservoirs 10,11, les tissus peuvent être analysés directement sans avoir à la culture, réduire les biais en raison de la croissance in vitro .

Dans les études de Tn-Seq avec la plupart des bactéries pathogènes décrites à ce jour, la haute fréquence de mutagenèse insertionnelle permis infection avec grandes piscines contenant des mutants ayant collectivement plusieurs insertions transposon rapprochés au sein de chaque gène4 ,12,13,14. TN-Seq a également été développé pour une bactérie dont la fréquence de la mutagénèse est beaucoup inférieur6. Avec Leptospira, une bibliothèque de mutants de transposons peut être générée en introduisant le transposon sur un plasmide mobilisable par conjugaison tel que décrit par Slamti et al.15. Toutefois, la fréquence de la mutagénèse transposon de L. interrogans est faible. Lorsque le transposon Himar1 a été introduit dans un plasmide conjugatif, la fréquence de transconjuguant a été signalée comme seuls 8,5 x 10-8 par destinataire de cellules souche de L. interrogans16 Lai et est susceptible d’être de même pauvre avec la plupart des autres souches de L. interrogans. Le protocole décrit ici est en partie basé sur conçu pour Borrelia burgdorferi, dont la fréquence de la mutagénèse insertionnelle transposon est également faible6.

Pour notre expérience pilote avec le protocole17, nous avons mené mutagénèse du transposon avec L. interrogans serovar Manilae souche L495 en raison du succès des autres groupes à isoler des mutants d’insertion de transposon dans la souche ainsi que sa faible DL50 (dose létale) pour virulence1. Nous avons projeté 42 mutants par Tn-Seq et identifié plusieurs candidats mutants défectueux dans la virulence, dont deux avec insertions dans un gène de l’adénylate cyclase du candidat. Une évaluation individuelle des deux mutants chez les hamsters ont confirmé qu’ils étaient déficients en virulence17.

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Protocol

ATTENTION : Des souches pathogènes de Leptospira spp doivent être manipulés sous procédures de confinement de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté. Une armoire de biosécurité classe II doit être utilisée pour toutes les manipulations des pathogènes Leptospira spp.

1. création du Transposon bibliothèque mutante15

  1. Transfert du transposon dans Leptospira spp. par conjugaison (Figure 1)
    1. Ensemencer un volume de la culture de la phase exponentielle de pathogènes Leptospira spp., correspondant à 10 cellules de7 à 10 mL de Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris moyen (EMJH)18,19. Incuber à 30 ° C à 150 tr/min, secouant jusqu'à ce que la densité atteigne 2-8 x 108 cellules/mL.
      NOTE : Le temps de doublement des leptospires pathogènes est de 12 à 24 h, selon les souches.
    2. Ensemencer à 50 µL du donneur Escherichia coli souche β216320 portant le plasmide (pCjTKS2) de transposon mobilisable16 dans 5 mL de Luria bouillon (LB) additionné de 0,3 mM de 2, 6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µg/mL de kanamycine (Km) et 50 µg/mL de spectinomycine (Spc) et le lieu du jour au lendemain dans un incubateur à 37 ° C à 255 tr/min.
    3. Ensemencer 60 µL de cellules d’Escherichia coli dans 3 mL de EMJH additionné de 0,3 mM de DAP (EMJH + DAP). Incuber à 37 ° C à agitation 255 tr/min pendant 3-4 h jusqu'à une OD600nm≈ 0,3.
    4. Pour monter l’unité de filtration (Figure 1), placer la base sur une tige latérale 125 mL fiole d’Erlenmeyer, placez un filtre avec la cellulose acétate (taille des pores 0,1 mm ; diamètre 25 mm) sur la base et pince l’entonnoir sur le socle. Connectez l’appareil de filtration à un système de vide.
    5. Ajouter 5 mL de Leptospira spp. culture et 0,5 mL de culture d’e. coli dans l’entonnoir. Aspirer le liquide à travers le filtre.
    6. Transférer le filtre avec la surface des bactéries vers le haut sur un EMJH + DAPplate. Incuber à 30 ° C pendant la nuit avec le filtre vers le haut.
    7. Placer le filtre dans un tube de 15 mL contenant 1 mL de EMJH et vortexer pendant 10 s pour libérer les bactéries dans les médias. Répandre 200 µL de la suspension sur 5 EMJH platescontaining 50 µg/mL de Km à l’aide de perles de verre stériles de 1 mm 10-15 ou un épandeur jetable stérile. Enveloppez les plaques avec du parafilm et les incuber à l’envers à 30 ° C pendant 3 à 4 semaines jusqu'à ce que les colonies sont visibles.
    8. Transférer des colonies individuellement dans 3 mL de EMJH contenant 50 µg/mL de Km (EMJH + Km) à 30° C sous agitation à 150 tr/min pour 7 à 10 jours jusqu'à ce que la culture atteint une densité de ≈10/8ml.
      Remarque : Les Cultures peuvent être stockées à-80 ° C ou dans l’azote liquide (avec 4 % de glycérol).
  2. Identification du site d’insertion transposon par PCR nichée (Figure 2)
    1. Lyse 50 µL de chaque mutant transposon dans des tubes PCR par incubation à 95 ° C pendant 15 min.
      Remarque : L’ADN peut être purifié au lieu de cela, à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN.
    2. Préparer le mélange PCR avec des amorces Deg1 et Tnk1 (tableau 3) selon le tableau 1. Transférer 23,7 µL du mélange dans chaque tube PCR et ajouter 1,3 µL de cellules lysées. Exécutez le programme : 95° C pendant 5 min ; 40 cycles : 95 ° C pendant 15 s, 40 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 2 min ; 72 ° C pendant 10 min.
    3. Faire le mélange PCR avec des amorces Tag et TnkN1 (tableau 3) selon le tableau 2. Transférer 24,2 µL du mélange dans chaque tube PCR et ajouter 0,8 µL de réaction PCR #1. Exécutez le programme : 95 ° C pendant 5 min ; 35 cycles : 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 2 min ; 72 ° C pendant 10 min.
    4. Exécuter 3 µL des produits PCR sur un gel d’agarose à 1 % avec un 1 tampon X Tris-acétate-EDTA (TAE) à 10-15 V/cm (Figure 2 b).
    5. Purifier les produits PCR des échantillons positifs à l’aide d’un kit de purification de PCR. Éluer ADN avec le volume le plus bas permis par le kit afin d’optimiser la concentration de l’ADN récupéré.
    6. Envoyer des produits PCR purifiés pour Sanger sequencing utilisant l’amorce de TnkN1 (tableau 3).
    7. Identifier les sites d’insertion en comparant la séquence obtenue avec la séquence du génome de la souche parentale par analyse BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) ou en utilisant la base de données (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) de SpiroScope21.
    8. Confirmer le site d’insertion du transposon de PCR avec des amorces recuit aux séquences flanquantes hôte.
      Remarque : Le transposon augmente la taille de la séquence de type sauvage par ≈ 2 Ko.

2. animal Experiment (Figure 3)

  1. Culture des mutants Leptospira
    1. Se développer individuellement chaque mutant transposon sélectionnés dans 10 mL de EMJH + Km à 30 ° C à l’agitation de 150 tr/min pour une densité de7-10 108 leptospires/mL.
    2. Compter les leptospires par microscopie à fond noir avec un compteur Petroff-Hausser ou décrites par Miller,23.
    3. Diluer chaque culture en EMJH à la même densité, par exemple 106 cellules/mL.
    4. Pour assembler l’entrée piscine, mélanger les cultures dilués en volumes égaux.
      NOTE : Inclure des contrôles dans la piscine d’entrée en ajoutant des mutants présentant des défauts de conditionnement physique connue comme loa2217,24 et mutants avec fitness inaltéré comme ligB17,25, respectivement. Piscines de mutants peuvent être stockés avec 4 % de glycérol à-80 ° C ou dans l’azote liquide.
  2. Défi
    Remarque : Les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité de l’utilisation (protocole #09018-14) et de vétérans affaires grand Los Angeles institutionnels animalier.
    1. Injecter par voie intrapéritonéale de 1 mL de la piscine d’entrée pour chaque animal avec une seringue à insuline U-100 avec aiguille 26 x ½".
      Remarque : Dans l’expérience pilote, 8 animaux ont été contestées avec 1 mL de la piscine d’entrée, c.-à-d. 106 bactéries totales17. L’infection a été autorisée à aller de l’avant pendant 4 jours avant l’euthanasie.
    2. Collecter 10 mL de la piscine d’entrée et actionner pour 20 min à 3 220 x g. Retirer délicatement le surnageant sans déranger le culot. Stocker le culot cellulaire à - 80 ˚c jusqu'à utilisation (étape 3.1.3).
    3. Surveiller les animaux tous les jours jusqu'à ce qu’ils sont terminent au point de terminaison pré-déterminé. Peser les hamsters quotidiennement et recherchez les critères du point de terminaison : perte d’appétit, démarche ou respiration difficile, prostration, fourrure hérissée, ou > 10 % du poids maximal atteint.
  3. In vitro de l’expérience
    1. Le jour du défi, ensemencer 3 Fioles jaugées de 25 mL d’EMJH + Km avec 5 mL de la piscine d’entrée. Cultiver des cultures à 30 ° C sous agitation 150 tr/min.
    2. Compter les leptospires quotidiennement en utilisant une des méthodes de la section 2.1.2. Lorsque la densité atteint ≈ 1 x 108/ml, tourner vers le bas de chaque suspension pendant 20 min à 3 220 x g.
    3. Stocker les pellets de cellule à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
  4. Récolte et stockage des tissus
    1. Euthanasier les animaux par inhalation isoflurane suivie par thoracotomie bilatérale26.
    2. Immédiatement percevoir 1 à 2 mL de sang par ponction cardiaque avec une seringue de 3 mL et une aiguille de 25 x 5/8". Transférer le sang dans le tube contenant de l’EDTA. Mélanger par retournement, 5 à 6 fois.
    3. Recueillir un rein et ⅓ à la moitié du lobe médian ventral du foie dans des cryotubes.
    4. Conserver les tissus à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. construction de banques génomiques pour le séquençage haut-débit (Figure 4)

  1. Extraction d’ADN
    1. Extraction de l’ADN du sang.
      1. Transférer 100 µL de sang du tube EDTA dans un tube de microcentrifuge.
      2. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN. Suivez les instructions du fabricant.
    2. Extraction de l’ADN provenant de tissus.
      1. Avec des ciseaux et scalpels, dés entre 50 à 80 mg de chaque organe en petits morceaux (1 x 1 mm) et de les transférer dans un tube sec stérile un bouchon qui visse. Mesurer le poids du tissu avec une balance de précision.
      2. Ajouter 500 µL de PBS stérile dans le tube.
      3. Homogénéiser les échantillons en utilisant le disruptor PDT 1 min à 5 mouvements par seconde.
      4. Calculer le volume correspondant à 25 mg de tissu à l’aide de l’équation suivante :
        Equation 1
      5. Transvaser le volume calculé dans le kit d’extraction d’ADN. Procéder à la purification d’ADN suivant les instructions du fabricant.
    3. Extraction de l’ADN des cultures d’entrée piscine et in vitro .
      1. Décongelez les granulés bactériennes à température ambiante pendant 5-10 min.
      2. Procéder à l’extraction d’ADN suivant les instructions qui accompagnent le kit.
    4. ADN de magasin à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
  2. Tonte l’ADN (Figure 5)
    1. Transférer 50 µL d’extrait d’ADN sur un tube de microtubes de 1,5 mL.
    2. Placer les tubes dans le panier de la corne de coupe sonicateur rempli d’eau froide (4 ° C).
    3. Exécutez le sonicateur pendant 3 min à 80 % d’intensité avec 10 s sur pulse et 5 s au large de l’impulsion.
      ATTENTION : Porter des coquilles antibruit ou bouchons d’oreilles pour protéger l’audition.
    4. Courir 2,5 µL de la cisaillé ADN sur un gel d’agarose à 2 % pour confirmer que la majeure partie de l’ADN est < 600 bp en taille.
  3. Ajout de la C-queue
    1. Mesurer la concentration d’ADN avec un spectrophotomètre de petit volume.
    2. Calculer le volume correspondant à 500 ng d’ADN en utilisant l’équation suivante :
      Equation 2
    3. Préparer les résidus de réaction (tableau 4). Incuber 1 h à 37 ° C ; inactiver à 75 ° C pendant 20 min.
      Remarque : Pour les échantillons nécessitant un réglage pour un volume supérieur à 14,5 µL, augmenter le volume final de la réaction de 40 µL et intensifier les composants restants en conséquence.
    4. Nettoyer les échantillons avec un kit de purification de PCR. Éluer l’ADN avec 12 µL de tampon d’élution.
  4. PCR nichée
    1. PCR #1
      1. Préparer des mélanges PCR selon les tableaux 3 et 5. Transférer 22 µL du mélange bibliothèque dans chaque tube PCR et ajouter 3 µL d’ADN purifié. Procéder de même avec le mélange de contrôle.
        NOTE : Primer TnkN317 est spécifique au transposon et apprêt olj3766 est spécifique à la queue-de-C. Le mélange de contrôle fait défaut à l’amorce de TnkN3, qui vise spécifiquement le transposon.
      2. Exécutez le programme suivant : 95 ° C pendant 2 min ; 24 cycles : 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 2 min ; 72 ° C pendant 2 min.
    2. PCR #2.
      1. Préparer les mélanges PCR deuxième selon les tableaux 3 et 6. Transférer 49 µL du mélange bibliothèque dans chaque tube PCR et ajouter 1 µL de la réaction de PCR #1 bibliothèque. Transférer 24,5 µL du mélange contrôle dans chaque tube PCR et ajouter 0,5 µL de réaction PCR #1 du contrôle.
        Remarque : PMargent2 Primer est spécifique au transposon, et l’IP amorces6 contiennent six-paires code à barres et des séquences spécifiques reconnus par la plate-forme de séquençage de prochaine génération.
      2. Exécutez le programme suivant : 95 ° C pendant 2 min ; 18 cycles : 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 2 min ; 72 ° C pendant 2 min.
    3. Exécuter 3 µL sur un gel d’agarose de 2 %. La bibliothèque devrait montrer un frottis avec la majorité du signal entre 200 et 600 bp (Figure 6) et pas d’amplification de la réaction de contrôle.
  5. Purification des produits de PCR.
    NOTE : Nettoyer les banques génomiques avec un kit de purification de PCR suivant les instructions du fabricant. Éluer l’ADN avec 30 µL de tampon d’élution.
  6. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre. Moyenne des 2 ou 3 lectures.
  7. Calculer le volume de chaque bibliothèque équivalente à 15 ou 20 ng à l’aide de l’équation suivante :
    Equation 3
  8. Mélanger toutes les bibliothèques ensemble après les précédents calculs. Déterminer la concentration molaire de l’ADN avec l’équation du site suivant :
    http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
    ATTENTION : Conditions de concentration et volume ADN dépendent de la plate-forme de séquençage.

4. high-throughput séquençage et l’analyse des données

  1. Séquençage
    1. Bibliothèques de séquence que les lectures de single-end bp 64 utilisant le séquençage personnalisé apprêt pMargent3 et l’amorce de séquençage commercial standard. La plate-forme de séquençage vous fournira les fichiers FastQ avec toutes les lectures de séquençage.
  2. Analyse avec le logiciel Galaxy
    1. Télécharger le fichier de séquence du génome
      1. Dans la page d’accueil de la base de données SpiroScope (Voir l’étape 1.2.7 pour lien), sélectionnez l’organisme utilisé pour l’expérience et de cliquez sur « LOAD dans GENOME BROWSER ».
      2. Dans la barre d’outils (vers le haut de la page d’accueil), sélectionnez « Rechercher/Export > Télécharger data », dans la ligne « Séquence (fasta) », cliquez sur « Génome » pour télécharger la séquence.
      3. Ouvrez le fichier avec le bloc-notes (PC) ou TextEdit (Mac) et renommez le chromosome (par exemple « ChrI »). Conserver le format fasta.
      4. Suivez les mêmes étapes pour télécharger la séquence du chromosome II. Combiner les deux séquences du chromosome dans un fichier .txt unique en copiant et en collant.
        Remarque : Des séquences du Chromosome aussi peuvent être téléchargés depuis le site NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) et regroupées dans un fichier .txt unique.
    2. Télécharger des fichiers sur le serveur de la galaxie
      NOTE : La galaxie est un open source, plateforme web pour la gestion des données bioinformatique intensive des workflows27,28,29,30 et peut être consulté à https://usegalaxy.org/.
      1. Dans le menu Outils, sélectionnez « obtenir des données > Télécharger le fichier de votre ordinateur ». Glissez l’ou les fichiers .fastq généré par la plate-forme de séquençage dans la fenêtre et cliquez sur « Démarrer ».
      2. Suivez les mêmes étapes pour télécharger le fichier Leptospira genome sequence .txt.
    3. Lit Groom
      1. Sélectionnez « NGS : QC et manipulation > toiletteur FASTQ » dans le menu outils.
      2. En regard de fichier de toiletter, sélectionnez les bibliothèques téléchargés à l’étape 4.2.2. Dans type de scores de qualité FASTQ d’entrée, sélectionnez le système de séquençage approprié. Pour les Options avancées, laissez Hide Advanced Office sélectionné.
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    4. Supprimer les artefacts de séquençage
      1. Sélectionnez « NGS : QC et manipulation > supprimer les artefacts de séquençage ». À côté de la bibliothèque pour filtrer, sélectionnez les fichiers damées générés à l’étape 4.2.3. Cliquez sur « Exécuter ».
    5. Supprimer les séquences C-queue
      Remarque : Répétez les étapes suivantes une ou deux fois pour s’assurer que tous les C-queues sont supprimés.
      1. Sélectionnez « NGS : QC et manipulation > Clip des séquences de l’adaptateur ».
      2. Sélectionnez ou entrez la commande suivante :
        Bibliothèque de clip : sélectionnez les fichiers générés à l’étape 4.2.4.
        Longueur de la séquence minimale : 15
        Source : entrez une séquence personnalisée
        Entrez la séquence de découpage personnalisé : CCCCCCC
        Entrez la valeur non nulle pour garder les séquences de l’adaptateur et les bases de x qui le suivent : 0
        Jeter des séquences avec des bases inconnues (N) : Oui
        Options de sortie : sortie des séquences coupées et non découpé
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    6. Supprimer les séquences de l’adaptateur
      1. Sélectionnez « NGS : QC et manipulation > Clip des séquences de l’adaptateur ».
      2. Sélectionnez ou entrez la commande suivante :
      3. Bibliothèque de clip : sélectionnez les fichiers générés à l’étape 4.2.5.
      4. Longueur de la séquence minimale : 15
      5. Source : entrez une séquence personnalisée
      6. Entrez la séquence de découpage personnalisé : CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Entrez la valeur non nulle pour garder les séquences de l’adaptateur et les bases de x qui le suivent : 0
      8. Jeter des séquences avec des bases inconnues (N) : Oui
      9. Options de sortie : sortie des séquences coupées et non découpé
      10. Cliquez sur « Exécuter ».
    7. Lectures de filtre basées sur leur qualité
      1. Sélectionnez « NGS : QC et manipulation > filtre de qualité ».
        Remarque : Cet outil sélectionne lectures basés sur les scores de qualité.
      2. Sélectionnez le texte suivant :
        Bibliothèque pour filtrer : sélectionner les fichiers générés à l’étape 4.2.6.
        Valeur de seuil de qualité : 20
        Pour cent de bases dans l’ordre que doit avoir la qualité égale à/supérieur à la valeur seuil : 95
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
        Remarque : Avec ces paramètres, lectures plus courts que 20 nucléotides ou avec un score de qualité de 20 ou moins pour 95 % des cycles sont ignorées. Adapter les valeurs de la rigueur à votre expérience.
    8. Carte lit32
      1. Sélectionnez « NGS : cartographie > Bowtie2 »32.
      2. Les champs dans la fenêtre principale, sélectionnez ce qui suit :
        Est cette bibliothèque simple ou jumelée : single-fin
        Fichier FASTQ : sélectionnez la bibliothèque filtrée pour la qualité de l’étape 4.2.7.
        Écrire des lectures non alignés (au format fastq) pour séparer les fichier (s) : aucun
        Écrire lectures alignés (au format fastq) pour séparer les fichier (s) : aucun
        Allez-vous choisir un génome de référence de votre histoire ou utiliser un index intégré ? : utiliser un génome de l’histoire et construire l’index
        Sélectionnez le génome de référence : sélectionnez le fichier de genome.txt Leptospira téléchargé à l’étape 4.2.2.
        Jeu de lire les informations de groupes ? : ne définissez pas
        Mode d’analyse de sélection : 1 : réglage par défaut uniquement
        Voulez-vous utiliser les préréglages ? : non, il suffit d’utiliser par défaut
        Enregistrer les statistiques de mappage bowtie2 dans l’histoire : No
        Paramètres de ressources d’emploi : utiliser les paramètres de ressource de travail par défaut
      3. Cliquez sur « Exécuter » pour aligner les lectures au génome.
    9. Convertir des fichiers
      1. Sélectionnez « NGS : SAMtools > BAM-à-SAM convertir BAM à SAM ».
      2. Sélectionnez le texte suivant :
        Fichier de BAM pour convertir : Select mappé bibliothèque étape 4.2.8.
        Des options d’en-tête : inclure l’en-tête dans la sortie de SAM (-h)
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    10. Convertir des fichiers
      1. Sélectionnez « NGS : SAMtools > convertir SAM à intervalle ».
      2. Sélectionnez le texte suivant :
        Sélectionnez Groupe de données à convertir : sélectionnez le fichier de bibliothèque mappé SAM généré à l’étape 4.2.9.
        Imprimer tous ? : Oui
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    11. Lectures de tri
      1. Sélectionnez « filtrer et trier > Trier les données en ordre croissant ou décroissant ».
      2. Sélectionnez le texte suivant :
        Sorte dataset : sélectionnez l’intervalle fichier généré à l’étape 4.2.10.
        colonne : 2
        saveur : l’ordre numérique
        tout dans : par ordre croissant
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    12. Sélectionnez lectures appariement chromosomique j’ai
      1. Sélectionnez « filtrer et trier > sélectionner les lignes qui correspondent à une expression ».
      2. Sélectionnez le texte suivant :
        Sélectionnez les lignes de : sélectionnez le fichier avec des lectures triés généré à l’étape 4.2.11.
        qui : correspondance
        le modèle : entrez le nom du chromosome I comme déterminé à l’étape 4.2.1.3 (p. ex., « ChrI »).
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    13. Sélectionnez lectures correspondant du chromosome II
      Aller de l’avant après l’étape 4.2.12.
    14. Groupe lit selon les sites d’insertions dans le chromosome j’ai
      1. Sélectionnez « Join, soustraire et Group > grouper des données par une colonne et d’effectuer une opération globale sur les autres colonnes ».
      2. Sélectionnez le texte suivant :
        Sélectionner des données : sélectionnez le fichier résultant de l’étape 4.2.12.
        Groupe de colonne : 2
        Ignorer la casse tout groupement ? : non
        Ignorer les lignes commençant par ces caractères : Ø
        Fonctionnement > + opération d’insertion
        Type : comte
        Colonne : 2
        Arrondir le résultat au nombre entier le plus proche : NO
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    15. Groupe lit selon les sites d’insertion dans le chromosome II
      Aller de l’avant après l’étape 4.2.14.
    16. Sites d’insertion de la sorte sur le chromosome j’ai
      1. Sélectionnez « filtrer et trier > Trier les données en ordre croissant ou décroissant ».
      2. Sélectionnez le texte suivant :
        Sorte de Dataset : Sélectionnez le fichier de l’étape 4.2.14.
        sur colonne : 1
        saveur : l’ordre numérique
        tout dans : par ordre croissant
      3. Cliquez sur « Exécuter ».
    17. Trier les sites d’insertion sur le chromosome II
      Aller de l’avant après l’étape 4.2.16.
  3. Analyse statistique
    1. Transférer les données de la galaxie dans des fichiers de feuille de calcul en copiant et collant des deux colonnes des étapes 4.2.16. et 4.2.17. dans un fichier Excel.
      Remarque : La première colonne est la coordonnée de nucléotide de l’emplacement d’insertion de transposon, et la deuxième colonne indique le nombre de lectures à chaque site d’insertion.
    2. Identifier le gène hébergeant le transposon à l’aide de la coordonnée de nucléotides figurant dans le tableau.
      NOTE : par exemple, un transposon inséré au nucléotide #30718 du chromosome I est situé dans le gène LIC10024 , qui s’étend sur les nucléotides 29263-31539 chromosome en I.
    3. Calculer les fréquences relatives (F) pour chaque mutant dans chaque tissu et dans la piscine d’entrée suivant l’équation ci-dessous :
      Equation 4
    4. Calculer les rapports d’entrée/sortie (R) pour chaque mutant et les tissus à l’aide de l’équation suivante :
      Equation 5
    5. Test de Wilcoxon signé-rangs
      1. Normaliser tous les rapports d’entrée/sortie en définissant le ratio médian pour chaque tissu dans chaque animal à 1.0. Un ratio de 1.0 est neutre, > 1.0 est désavantageux, et < 1,0 est avantageuse33.
      2. Comparer les ratios d’entrée/sortie à 1.0 (remise en forme neutre) en utilisant le test de Wilcoxon avec les valeurs de P < 0,05 considérés comme statistiquement significatifs.

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Representative Results

Création d’une bibliothèque de mutants de transposon dans L. interrogans par conjugaison nécessite une unité de filtration, comme illustré à la Figure 1. Nous avons récupéré des transconjugants 100-200 de chaque croisement.

Le site d’insertion de transposon est identifié dans chaque mutant par séquençage du produit PCR généré par PCR semi aléatoire qui cible à la fin du transposon et hôte adjacent séquences15 (Figure 2 a). Un exemple des résultats de la PCR semi aléatoire est illustré dans la Figure 2 b. Dans la plupart des cas un amplicon dominant sera observé lorsque les amorces Deg1 et Tnk1 sont utilisées pour le premier tour de la PCR et la balise et TnkN1 pour le second tour. Cependant, en raison de la faible spécificité de la séquence pentamérique (... N10GATAT-3') à l’extrémité 3' de l’amorce de Deg1, cet apprêt va recuire à plusieurs endroits dans le génome de leptospires. Si ces sites sont présents près de l’extrémité du transposon, plusieurs produits PCR peuvent être obtenues. Lorsque plusieurs amplicons sont générées, ils peuvent être purifiés de l’ensemble du mélange PCR et séquencés directement ; gel de purification de chaque amplicon n’est pas nécessaire, parce qu’ils contiendront tous la même séquence en aval d’où TnkN1 apprêt recuits. En revanche, la PCR peut échouer si la copie la plus proche de la séquence ciblée de l’apprêt Deg1 est située à une grande distance de l’extrémité du transposon. Si aucun produit PCR n’est détectées, le premier cycle de PCR semi aléatoire peut être répété avec l’apprêt Deg1 et amorce de Tnk2, qui s’adresse à l’extrémité opposée du transposon. Dans ce cas TnkN2 et Tag serviraient pour le second tour ; l’amplicon serait être séquencé avec l’amorce de la TnkN2 (Figure 2 b). Sinon, le premier tour de la PCR peut être fait avec l’amorce de la Deg2, dont 3' fin (... N10TCTT-3') vise une quatre - plutôt qu’une séquence de nucléotides cinq. Quatre ensembles différents d’amorces peuvent être utilisés pour le premier tour de la PCR (PCR #1) : Tnk1 + Deg1, Tnk2 + Deg2 Tnk1 + Deg2, Tnk2 + Deg1. Lorsqu’une série d’amorces ne fonctionne pas, utiliser un autre ensemble. Si cette seconde valeur également échoue, utilisez un autre et ainsi de suite. Des mutants résistants à la kanamycine spontanées sont très rares et surviennent à une fréquence de < 10-10 34.

Lors de la préparation des banques génomiques (Figure 4), quelques marches peuvent être vérifiées. L’ADN de cisaillement par sonication devrait être confirmée par l’électrophorèse de l’aliquote dans un gel d’agarose (Figure 5). Quand l’ADN est cisaillé correctement, les fragments d’ADN allant de 200 à 600 bp volonté forment un frottis dans un gel d’agarose à 2 %. Avant d’envoyer des librairies pour le séquençage haut débit, la génération des produits PCR par des réactions de PCR imbriquées doit à confirmer par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 6).

Après avoir traité les lectures de séquençage suivant le protocole décrit ici (section 4.2), la fréquence de chaque mutant dans la piscine d’entrée et dans tous les tissus est déterminée à l’aide de l’équation à l’article 4.3.3. Le ratio d’entrée/sortie pour chaque mutant dans chaque tissu est calculé avec l’équation dans la section 4.3.4. La figure 7 montre un exemple des résultats obtenus avec l’approche de Tn-Seq. Alternativement, l’outil MAGenTA peut être utilisé pour traiter et analyser les données de séquençage 31. Mutants ayant statistiquement significativement réduite et une augmentation de remise en forme ont été identifiés. Des mutations dans les gènes de virulence connus de leptospires causés réduit fitness, valider l’approche Tn-Seq.

Figure 1
Figure 1 : unité de Filtration utilisée comme conjugaison. Le groupe de filtration est assemblé en insérant la butée de l’appui de filtre dans un fiole d’Erlenmeyer, côté-bras le filtre avec la cellulose acétate, sur la base de positionnement avec une pince stérile, puis placer l’entonnoir sur le socle et sécurisation du système avec une pince . Le groupe de filtration est alors connecté au système de vide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Identification des sites d’insertion transposon. (A) schéma montrant les sites recuits des amorces PCR semi aléatoires. Tnk1 et Tnk2 des amorces recuisent près les extrémités opposées du transposon (Tn). Deg1 est un apprêt à 35 nucléotides qui contient un tronçon de 10 nucléotides dégénérés, suivie de la séquence GATAT à l’extrémité 3'. Le premier tour de la PCR (PCR #1) est dispensée avec Deg1 et Tnk1 ou avec Deg1 et amorces Tnk2. TnkN1 et TnkN2, utilisés pour PCR #2, recuisent le transposon extrémités, Tnk1 et Tnk2, respectivement. La séquence de l’amorce de la balise est identique à celle de l’extrémité 5' de l’apprêt Deg1. (B) exemple de gel d’agarose obtenu après le deuxième tour de la RCP avec 14 mutants transposon (voies 1 à 14). Le premier tour de la PCR a été réalisé avec Deg1 et Tnk1 ; le second tour a été fait avec la balise et TnkN1. PCR Positive est représentée par « + » et une PCR négative par «- ». « KmR» représente la cassette de résistance kanamycine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : diagramme permettant d’obtenir la piscine sortie. Le jour du challenge (jour 0), chaque mutant leptospire est compté par microscopie à fond noir, dilué à la même densité et combiné pour former le bassin d’entrée (détails fournis dans la section 2.1). Hamsters sont contestées par voie intrapéritonéale, avec l’entrée piscine. En outre, trois cultures ont débuté avec l’entrée piscine. Le jour de l’inoculation (jour 0) et quand les cultures atteignent une densité de ≈ 108/ml, la piscine d’entrée et les cultures sont recueillies par centrifugation et conservées comme boulettes à-80 ° C jusqu'à l’utilisation (voir section 2.3). Sur la point de terminaison (journée présélectionnées pour terminer les animaux, par exemple, jour 4 après le défi), les animaux est euthanasiés ; sang, les reins et foie sont recueillies et conservées à-80 ° C jusqu'à l’utilisation (voir la section 2.4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : diagramme de la préparation de la banque génomique. (A) l’ADN est extrait du sang, de tissus ou de cultures suivant le protocole décrit dans la section 3.1. La zone rouge représente le transposon (Tn). (B) l’ADN est cisaillé par sonication en fragments entre 200 et 600 ans bp. Plus de détails sont fournis dans la section 3.2. (C) C-queues (boîtes jaunes) sont ajoutés à tous les fragments d’ADN avec transférase terminale de deoxynucleotidyl (TdT) tel que décrit à la section 3.3 et le tableau 4. La banque génomique est préparée pour le séquençage par PCR nichée (D-E). Le premier tour de la PCR est réalisé avec des amorces spécifiques du transposon et la C-queue, TnkN3 et olj376 respectivement. Voir le tableau 3 et 5. Seuls des fragments contenant les extrémités du transposon (zone rouge) sont amplifiés. Remarque : Utiliser l’apprêt olj376 3 fois plus que TnkN3 car tous les fragments d’ADN ont C-queues. Le second tour de la PCR est effectué avec pMargent2, spécifique pour la fin du transposon et une amorce de l’indexation, contenant une séquence de code à barres six paires (en rose) permettant à tous les échantillons soient multiplexées dans une ruelle de séquençage simple. Voir le tableau 3 et 6. Les deux amorces renfermant des séquences nécessaires pour la liaison de la cellule d’écoulement pendant Illumina séquençage (encadré vert et violet). Produits (F), la PCR qui en résultent sont nettoyés, et puis leur concentration est mesurée comme indiqué au paragraphe 3.6. (G) toutes les banques génomiques sont regroupées ensemble ; chaque bibliothèque possède un code-barres différent et (H) la piscine est envoyé à la plate-forme de séquençage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Sonication de l’ADN. ADN a été purifiée à partir de foies de huit hamsters infectés (voies 1 à 8), sonication et examiné par électrophorèse sur un gel d’agarose à 2 %. Cisaillée ADN se caractérise par un frottis dans lequel la taille de la plupart des fragments est entre 200 et 600 BP. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : les banques génomiques pour le séquençage haut-débit. Banques génomiques ont été préparés par ested PCR avec l’ADN du sang de huit hamsters infectés (voies 1 à 8) et examinés par électrophorèse sur un gel d’agarose de 2 %. La taille de la plupart des produits PCR se situe entre 200 et 600bp. témoin négatif (sans apprêt TnkN3 PCR #1 Mix, voir le tableau 5) ne montre aucune amplification (non illustrée). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : remise en forme de mutants d’expérience de Tn-Seq. Remise en forme d’un pool de mutants dans le rein de hamster 4 jours après le défi (adapté de Lourdault étude17). Le rapport entrée/sortie de tous les 42 mutants a été déterminé pour chaque animal. Chaque mutant est nommé par le gène (lic) ou de la région intergénique (inter) le transposon est inséré ou le nom couramment utilisé dans la littérature. Chaque rapport est représenté par un diamant noir. La médiane des ratios (ligne rouge) a été déterminée pour chaque mutant et par rapport à 1.0 en utilisant le test de Wilcoxon. La ligne pointillée représente la remise en forme de 1,0, ce qui correspond à la forme neutre. Des mutants dont remise en forme est affectée de façon significative sont marqués d’un astérisque : * P < 0,05 ; ** P < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Réactifs Volume pour une réaction
Mix Master 2 X 12,5 ΜL
Apprêt 1, 10 mM (TnK1 ou TnK2) * 1.2 ΜL
Apprêt 2, 10 mM (Deg1 ou Deg2) * 1.2 ΜL
Eau 8.8 ΜL
Modèle (lysat de cellules ou de l’ADN) 1,3 ΜL
Volume final 25 µL
* Séquences d’amorces dans le tableau 3.

Tableau 1 : Identification du site d’insertion transposon, semi-aléatoire PCR #1 mix.

Réactifs Volume pour une réaction
Mix Master 2 X 12,5 ΜL
Apprêt 1, 100 mM (TnKN1 ou TnKN2) * 0.2 ΜL
Apprêt 2, 100 mM (Tag) * 0.2 ΜL
Eau 10.1 ΜL
Produits PCR PCR # 1 0,8 ΜL
Volume final 25 µL
* Séquences d’amorces dans le tableau 3.

Tableau 2 : Identification du site d’insertion transposon, semi-aléatoire PCR #2 mix.

Nom Séquence (5' - 3') Référence
Amorces utilisées pour PCR semi aléatoire
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
Deg2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Balise GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Amorces utilisées pour le séquençage d’Illumina
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
ADRESSE IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Illumina de séquençage (codes à barres en caractères gras)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Seq IP GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Tableau 3 : Séquences de primer.

Réactifs Volume pour une réaction
ADN cisaillé 500 ng (voir équation au point 3.3.2.)
Eau Jusqu'à 14,5 µL
5 x tampon TdT 4 ΜL
(dCTP 9,5 mM + 0,5 mM ddCTP) mix * 1 ΜL
TdT (30 U/µL) 0,5 ΜL
Volume final 20 µL
* Mix 3 μl 10 mM ddCTP, 5,7 µL de 100 mM dCTP et 51,3 µL d’eau

Tableau 4 : C-tailing réaction avec transférase terminale de deoxynucleotidyl (TdT).

Réactifs Volume pour une réaction
Réaction de bibliothèque Réaction de contrôle
Master mix x 2 12,5 ΜL 12,5 ΜL
Apprêt 1, 30 µM (TnkN3) * 0,5 ΜL -
Apprêt 2, 30 µM (olj376) * 1,5 ΜL 1.5
Eau 7,5 ΜL 8 ΜL
C à queue ADN 3 ΜL 3 ΜL
Volume final 25 µL 25 µL
* Séquences d’amorces dans le tableau 3.

Tableau 5 : Construction de banque génomique, PCR #1 mix.

Réactifs Volume pour une réaction
Réaction de bibliothèque Réaction de contrôle
Master mix x 2 25 ΜL 12,5 ΜL
Apprêt 1, 30 µM (pMargent2) * 0,5 ΜL 0.25 ΜL
Apprêt 2, 30 µM (amorce d’indexation) * 0,5 ΜL 0.25 ΜL
Eau 23 ΜL 11.5 ΜL
Produits PCR PCR # 1 1 ΜL 0,5 ΜL
Volume final 50 µL 25 µL
* Séquences d’amorces dans le tableau 3.

Tableau 6 : Construction de banque génomique, PCR #2 mix.

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Discussion

Bien que les résultats de notre expérience pilote pour hamster contestée par voie intrapéritonéale avec 42 L. interrogans mutants sont présentés17, gageons que plus grandes piscines de mutants peuvent être projetés par Tn-suiv. Parce que la fréquence des transconjugants est faible (100-200 transconjugants/accouplement), plusieurs accouplements sont nécessaires pour générer un nombre suffisant de mutants pour les grandes expériences de Tn-Seq. Maintenir un grand nombre de mutants dans des cultures liquides présente des défis logistiques qui doivent être abordées. Les cultures peuvent être incubées en plaques 96 puits profond. Densités de culture peuvent être surveillées par les lectures de densité optique dans un spectrophotomètre mis à 420 nm. La détermination du nombre d’animaux à utiliser dépend en partie de la taille de la piscine d’entrée et doit être déterminée par l’analyse de la puissance. Pour des expériences à grande échelle, nous recommandons que l’analyse de pouvoir être réalisée en consultation avec un biostatisticien.

Goulots d’étranglement peuvent influer sur la récupération de mutants aléatoires dans la piscine de sortie. Bien que les goulets d’étranglement graves n’ont pas été observés dans notre étude pilote17 (Figure 7), des expériences à grande échelle peuvent être affectées par la perte aléatoire de mutants. Augmenter la dose de défi en augmentant le nombre de cellules par mutant dans la piscine d’entrée sera de minimiser les risques de goulets d’étranglement,35. L’outil récemment publiée de la galaxie MAGenTA fournit l’outil nécessaire pour déterminer les goulots d’étranglement et de remise en forme,31.

TN-Seq expériences prévues pour un itinéraire alternatif de l’infection, autres Leptospira , souches ou autres modèles de rongeurs ont besoin d’autres considérations. Si la cinétique de l’infection chez l’espèce hôte n’est pas connue ou n’est pas exponentielle en continu au cours de l’infection au sein de chaque tissu à examiner, ADN devrait être tirée de la mise en culture des tissus, plutôt que directement dans les tissus. Cette étape supplémentaire réduira au minimum une surestimation d’aptitude mutant en raison de la détection de l’ADN de spirochètes morts. Si la piscine de sortie est obtenue de la mise en culture des tissus, la piscine d’entrée devrait être mis en culture à contrer les effets de la croissance in vitro . Nous recommandons également une expérience pilote avec un petit nombre de mutants pour déterminer si les goulets d’étranglement sera un sujet de préoccupation et pour faciliter l’analyse de puissance pour des expériences à grande échelle.

Confirmation d’aptitude modifié tel que déterminé par Tn-Seq exigera des essais de mutants individuels dans le modèle animal. Actuellement, chaque mutant doit être séquencé individuellement avant Tn-Seq pour identifier le mutant portant l’insertion dans le gène d’intérêt. Toutefois, si le remplacement de l’allèle dans pathogènes Leptospira devient facile, séquençage des mutants individuels ne sera plus nécessaire. Alternativement, effecteurs comme activateur de transcription ont été utilisées avec succès pour diminuer l’expression de gènes lig dans L. interrogans36. Cette technique pourrait être utilisée pour bas-réguler les gènes perturbés chez les mutants avec remise en forme altérée identifié par Tn-suiv.

Lorsqu’on interprète les données de Tn-Seq, interactions entre les bactéries doivent pour être pris en considération. Il est théoriquement possible qu’une diminution de remise en forme pourrait être due à la concurrence entre mutants plutôt qu’un effet direct de l’insertion du transposon. En outre, l’absence de changement dans in vivo de remise en forme d’un mutant dans une piscine peut résulter de la coopération entre mutants. Par exemple, un mutant qui ne parvient pas à produire un facteur essentiel pourrait être complété entre les cellules de production du facteur d’autres mutants dans la piscine. Nous avons observé une augmentation du fitness pour plusieurs mutants, qui peut être une conséquence de la réduction du fardeau métabolique de synthèse n’est plus de protéines qui ne sont pas essentiels à la croissance, telle qu’indiquée pour Salmonella enterica37.

Ce protocole peut être utilisé pour identifier les gènes impliqués dans le métabolisme ou la survie dans des conditions stressantes dans vitro 38,,39. Par exemple, croissant Leptospira dans différentes conditions comme la concentration élevée de chlorure de sodium, le fer limitée et un pH acide pourrait identifier les gènes responsables de la résistance de survie ou de stress acide. Ces expériences in vitro peuvent également être effectuées avec des souches saprophytes comme L. biflexa souche Patoc j’ai car cette méthode Tn-Seq peut être appliquée à toutes les séquencées Leptospira souches.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par un prix de mérite d’affaires des anciens combattants (à D.A.H.) et un Institut National de la santé accorde le R01 AI 034431 (à D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

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Immunologie numéro 130 haut-débit séquençage la conjugaison mutagénèse aléatoire PCR nichée Leptospira remise en forme mutants bibliothèque
Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de <em>Leptospira interrogans</em> Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection
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Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

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