Высок объём параллельного секвенирования для измерения фитнес Лептоспире interrogans Transposon вставки мутантов во время Золотой сирийского хомяка инфекции
Summary
Здесь мы опишем технику, которая сочетает в себе transposon мутагенеза с высокой пропускной способностью последовательности для идентификации и количественной оценки transposon leptospiral мутантов в тканях после вызова хомяков. Этот протокол может использоваться для экрана мутантов для выживания и распространения в животных и могут также применяться к в vitro исследования.
Abstract
В этой рукописи мы описываем transposon виртуализации (Tn-Seq) техника для идентификации и количественной оценки Лептоспире interrogans мутантов, изменены в фитнес во время инфекции Золотой сирийских хомяков. TN-Seq сочетает в себе случайных transposon мутагенеза с силой высокопроизводительного секвенирования технологии. Животных сталкиваются с бассейном transposon мутантов (ввода бассейн), следуют заготовки крови и тканей через несколько дней позже определить и подсчитать количество мутантов в каждом органе (вывода бассейны). Бассейны вывода по сравнению с ввода бассейна оценить фитнес в естественных условиях каждого мутант. Этот подход позволяет скрининг большого пула мутантов в ограниченное количество животных. С незначительными изменениями этот протокол может выполняться с любого животного модель лептоспироза, водохранилище принимающей таких крыс и острой инфекции модели таких хомячков, а также в vitro исследования. TN-Seq обеспечивает мощный инструмент для экрана для мутантов с дефектами фитнес в vivo и in vitro .
Introduction
Идентификация генов вирулентности для некоторых бактерий, таких как Leptospira spp., затруднено из-за ограниченного числа генетических инструментов, доступных. Один из часто используемых подходов является создание коллекции мутантов, случайных transposon мутагенеза, следуют идентификации включение сайта в каждом мутант и вирулентности тестирование отдельных transposon мутантов в животной модели. Этот подход является длительным, дорогостоящим и требует большое количество животных.
При случайных мутагенеза была впервые разработана для патогена Лептоспире interrogans, генов, участвующих в вирулентности были определены путем тестирования отдельных мутантов в животной модели1. Мутанты были отобраны на основе таких критериев, как их потенциальной роли в сигнализации подвижности или их предсказал внешней мембраны или поверхности местоположение. Как и большинство leptospiral гены кодируют гипотетических белки неизвестной функции2, выбрав мутантов основанный на эти критерии ограничения возможность обнаружения генов вирулентности Роман leptospiral.
Совсем недавно бассейны л interrogans transposon мутантов были экранированы для инфективности в хомяк и мыши модели3. Каждое животное было оспорено с бассейном до 10 мутантов. Инфективности мутант был забит как положительным, если он был обнаружен методом ПЦР культур, полученных из крови и почек. PCR тестирования был трудоемким, потому что он требует индивидуальной реакции PCR для каждого мутант в бассейне. Потому что частота каждого мутант в культурах количественно не оценивалась, подход был предвзято к идентификации весьма ослабленный мутантов.
Мы описываем transposon виртуализации (Tn-Seq) технику, как стратегия более эффективно экран для генов вирулентности. TN-seq состоит из создания библиотеки мутантов transposon мутагенеза, следуют массивной параллельной последовательности4,5,6. Кратко transposon мутантов пуле, привитых животных и впоследствии оправился от различных органов (вывода бассейны). ДНК из пулов вывода извлечены и переваривается с энзимами ограничения или стриженый sonication. Два раунда ПЦР ориентации развязок transposon вставки сайтов выполняются. Этот шаг позволяет адаптеров, необходимые для последовательности. Результате продукты PCR анализируются высокопроизводительного секвенирования для выявления transposon вставки сайт каждого мутант бассейна наряду с их относительного изобилия, который сравнивается с первоначальный состав пула мутант.
Основным преимуществом этого подхода является возможность одновременно экран большое количество мутантов с небольшое количество животных. TN-Seq не требует предварительных знаний о transposon вставки сайты, что увеличивает шансы выявления новых Leptospira-специфических генов, участвующих в вирулентности с меньше времени и повышения эффективности. Поскольку бремя leptospiral в тканях является относительно высоким в грызун модели восприимчивы к смертельной инфекции (обычно 104 108 бактерий/g ткани)7,8,9 , также как и хозяева водохранилище 10,11, тканей могут быть проанализированы непосредственно, без необходимости культуры, снижения отклонений вследствие роста в пробирке .
В большинство бактериальных патогенов, описанные на сегодняшний день исследований, Tn-Seq высокая частота инсерционному мутагенезу допускается инфекции с большими бассейнами, содержащие мутантов вместе с нескольких близко расположенных transposon вставок в каждый ген4 ,12,,1314. TN-Seq была также разработана для бактерий, для которого мутагенеза частота является намного ниже6. С Leptospiraбиблиотека transposon мутантов могут создаваться путем введения transposon на мобилизационный плазмиды путем конъюгации, как описано в Slamti et al15. Однако частота transposon мутагенеза л interrogans является низким. Когда Himar1 transposon была введена на сопряженных плазмида, частота transconjugant сообщается только 8,5 x 10-8 для каждого получателя ячейки с Лай штамм L. interrogans16 и, вероятно, будет Аналогичным образом бедных с большинства других штаммов L. interrogans. В части, на основе, которая разработана для Borrelia burgdorferi, в котором частота transposon инсерционному мутагенезу является также низкая6протокол, описанных здесь.
Для нашего эксперимента с протоколом17мы провели transposon мутагенеза с л interrogans серовар штамм Manilae L495 из-за успеха других групп в Изолирующие вставки мутантов transposon в штамм наряду с его низкой LD50 (летальная доза) для вирулентности1. Мы экранированный 42 мутантов, Tn-Seq и определили несколько мутантов кандидатов дефектных в вирулентности, включая два с вставками в гене Аденилатциклаза кандидата. Индивидуальные испытания двух мутантов в хомяков подтвердил, что они являются несовершенными в вирулентности17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя результаты от нашего эксперимента для хомяка, внутрибрюшинно оспорены с 42 л interrogans мутантов представлены17, мы ожидаем, что большие бассейны мутантов может проверяться Tn-далее Потому что низкая частота трансконъюгантов (100-200 трансконъюгантов/спаривания), нескольк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана заслуги дел ветеранов (в D.A.H.) и национального института здравоохранения предоставлять R01 Ай 034431 (D.A.H.).
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
References
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
- Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
- Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
- Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
- Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
- Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
- Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
- Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
- Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
- Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
- Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
- Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
- Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
- Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
- Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
- Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
- McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
- Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
- Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
- Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
- Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).
