Summary

Высок объём параллельного секвенирования для измерения фитнес Лептоспире interrogans Transposon вставки мутантов во время Золотой сирийского хомяка инфекции

Published: December 18, 2017
doi:

Summary

Здесь мы опишем технику, которая сочетает в себе transposon мутагенеза с высокой пропускной способностью последовательности для идентификации и количественной оценки transposon leptospiral мутантов в тканях после вызова хомяков. Этот протокол может использоваться для экрана мутантов для выживания и распространения в животных и могут также применяться к в vitro исследования.

Abstract

В этой рукописи мы описываем transposon виртуализации (Tn-Seq) техника для идентификации и количественной оценки Лептоспире interrogans мутантов, изменены в фитнес во время инфекции Золотой сирийских хомяков. TN-Seq сочетает в себе случайных transposon мутагенеза с силой высокопроизводительного секвенирования технологии. Животных сталкиваются с бассейном transposon мутантов (ввода бассейн), следуют заготовки крови и тканей через несколько дней позже определить и подсчитать количество мутантов в каждом органе (вывода бассейны). Бассейны вывода по сравнению с ввода бассейна оценить фитнес в естественных условиях каждого мутант. Этот подход позволяет скрининг большого пула мутантов в ограниченное количество животных. С незначительными изменениями этот протокол может выполняться с любого животного модель лептоспироза, водохранилище принимающей таких крыс и острой инфекции модели таких хомячков, а также в vitro исследования. TN-Seq обеспечивает мощный инструмент для экрана для мутантов с дефектами фитнес в vivo и in vitro .

Introduction

Идентификация генов вирулентности для некоторых бактерий, таких как Leptospira spp., затруднено из-за ограниченного числа генетических инструментов, доступных. Один из часто используемых подходов является создание коллекции мутантов, случайных transposon мутагенеза, следуют идентификации включение сайта в каждом мутант и вирулентности тестирование отдельных transposon мутантов в животной модели. Этот подход является длительным, дорогостоящим и требует большое количество животных.

При случайных мутагенеза была впервые разработана для патогена Лептоспире interrogans, генов, участвующих в вирулентности были определены путем тестирования отдельных мутантов в животной модели1. Мутанты были отобраны на основе таких критериев, как их потенциальной роли в сигнализации подвижности или их предсказал внешней мембраны или поверхности местоположение. Как и большинство leptospiral гены кодируют гипотетических белки неизвестной функции2, выбрав мутантов основанный на эти критерии ограничения возможность обнаружения генов вирулентности Роман leptospiral.

Совсем недавно бассейны л interrogans transposon мутантов были экранированы для инфективности в хомяк и мыши модели3. Каждое животное было оспорено с бассейном до 10 мутантов. Инфективности мутант был забит как положительным, если он был обнаружен методом ПЦР культур, полученных из крови и почек. PCR тестирования был трудоемким, потому что он требует индивидуальной реакции PCR для каждого мутант в бассейне. Потому что частота каждого мутант в культурах количественно не оценивалась, подход был предвзято к идентификации весьма ослабленный мутантов.

Мы описываем transposon виртуализации (Tn-Seq) технику, как стратегия более эффективно экран для генов вирулентности. TN-seq состоит из создания библиотеки мутантов transposon мутагенеза, следуют массивной параллельной последовательности4,5,6. Кратко transposon мутантов пуле, привитых животных и впоследствии оправился от различных органов (вывода бассейны). ДНК из пулов вывода извлечены и переваривается с энзимами ограничения или стриженый sonication. Два раунда ПЦР ориентации развязок transposon вставки сайтов выполняются. Этот шаг позволяет адаптеров, необходимые для последовательности. Результате продукты PCR анализируются высокопроизводительного секвенирования для выявления transposon вставки сайт каждого мутант бассейна наряду с их относительного изобилия, который сравнивается с первоначальный состав пула мутант.

Основным преимуществом этого подхода является возможность одновременно экран большое количество мутантов с небольшое количество животных. TN-Seq не требует предварительных знаний о transposon вставки сайты, что увеличивает шансы выявления новых Leptospira-специфических генов, участвующих в вирулентности с меньше времени и повышения эффективности. Поскольку бремя leptospiral в тканях является относительно высоким в грызун модели восприимчивы к смертельной инфекции (обычно 104 108 бактерий/g ткани)7,8,9 , также как и хозяева водохранилище 10,11, тканей могут быть проанализированы непосредственно, без необходимости культуры, снижения отклонений вследствие роста в пробирке .

В большинство бактериальных патогенов, описанные на сегодняшний день исследований, Tn-Seq высокая частота инсерционному мутагенезу допускается инфекции с большими бассейнами, содержащие мутантов вместе с нескольких близко расположенных transposon вставок в каждый ген4 ,12,,1314. TN-Seq была также разработана для бактерий, для которого мутагенеза частота является намного ниже6. С Leptospiraбиблиотека transposon мутантов могут создаваться путем введения transposon на мобилизационный плазмиды путем конъюгации, как описано в Slamti et al15. Однако частота transposon мутагенеза л interrogans является низким. Когда Himar1 transposon была введена на сопряженных плазмида, частота transconjugant сообщается только 8,5 x 10-8 для каждого получателя ячейки с Лай штамм L. interrogans16 и, вероятно, будет Аналогичным образом бедных с большинства других штаммов L. interrogans. В части, на основе, которая разработана для Borrelia burgdorferi, в котором частота transposon инсерционному мутагенезу является также низкая6протокол, описанных здесь.

Для нашего эксперимента с протоколом17мы провели transposon мутагенеза с л interrogans серовар штамм Manilae L495 из-за успеха других групп в Изолирующие вставки мутантов transposon в штамм наряду с его низкой LD50 (летальная доза) для вирулентности1. Мы экранированный 42 мутантов, Tn-Seq и определили несколько мутантов кандидатов дефектных в вирулентности, включая два с вставками в гене Аденилатциклаза кандидата. Индивидуальные испытания двух мутантов в хомяков подтвердил, что они являются несовершенными в вирулентности17.

Protocol

Предупреждение: Патогенные штаммы Leptospira spp. должны быть обработаны согласно процедурам включения 2-го уровня биобезопасности (BSL-2). Необходимо носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). Класс II биобезопасности кабинета должны использоваться для всех манипуляций …

Representative Results

Создание библиотеки transposon мутантов в л interrogans путем конъюгации требует фильтрующего блока, как показано на рисунке 1. 100-200 трансконъюгантов мы оправились от каждого спаривания. Transposon вставки сайт обозначаются в каж…

Discussion

Хотя результаты от нашего эксперимента для хомяка, внутрибрюшинно оспорены с 42 л interrogans мутантов представлены17, мы ожидаем, что большие бассейны мутантов может проверяться Tn-далее Потому что низкая частота трансконъюгантов (100-200 трансконъюгантов/спаривания), нескольк…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана заслуги дел ветеранов (в D.A.H.) и национального института здравоохранения предоставлять R01 Ай 034431 (D.A.H.).

Materials

Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Play Video

Cite This Article
Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

View Video