गोल्डन सीरियाई हंसटर संक्रमण के दौरान Leptospira interrogans Transposon प्रविष्टि म्यूटेंट की फिटनेस को मापने के लिए उच्च प्रवाह समानांतर अनुक्रमण
Summary
हम यहां एक तकनीक का वर्णन है कि उच्च प्रवाह अनुक्रमण के साथ transposon mutagenesis को जोड़ती है की पहचान और हंसटर की एक चुनौती के बाद ऊतकों में transposon leptospiral म्यूटेंट यों यों । इस प्रोटोकॉल के लिए जानवरों में अस्तित्व और प्रसार के लिए म्यूटेंट स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है और भी इन विट्रो अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Abstract
इस पांडुलिपि में, हम एक transposon अनुक्रमण (तमिलनाडु-Seq) तकनीक का वर्णन करने की पहचान करने और Leptospira interrogans म्यूटेंट के लिए है स्वर्ण सीरियाई हंसटर के संक्रमण के दौरान फिटनेस में बदल । तमिलनाडु-Seq उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकी की शक्ति के साथ यादृच्छिक transposon mutagenesis को जोड़ती है । पशु transposon म्यूटेंट (इनपुट पूल) के एक पूल के साथ चुनौती दी है, रक्त और ऊतकों की कटाई के बाद कुछ दिनों के बाद की पहचान करने के लिए और प्रत्येक अंग (आउटपुट पूल) में म्यूटेंट की संख्या मात्रा । आउटपुट पूल इनपुट पूल की तुलना में प्रत्येक उत्परिवर्ती के vivo में फिटनेस का मूल्यांकन कर रहे हैं । यह दृष्टिकोण पशुओं की एक सीमित संख्या में म्यूटेंट के एक बड़े पूल की स्क्रीनिंग में सक्षम बनाता है । मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल ऐसे हंसटर के रूप में चूहों और तीव्र संक्रमण मॉडल के रूप में लेप्टोस्पायरोसिस, जलाशय मेजबान मॉडल के किसी भी जानवर मॉडल के साथ किया जा सकता है, साथ ही साथ इन विट्रो अध्ययन में । तमिलनाडु-Seq vivo में और इन विट्रो फिटनेस दोषों के साथ म्यूटेंट के लिए स्क्रीन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
कुछ बैक्टीरिया, जैसे कि Leptospira एसपीपी., के लिए डाह जीन की पहचान के लिए उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की सीमित संख्या की वजह से मुश्किल है । एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण यादृच्छिक transposon mutagenesis द्वारा प्रत्येक उत्परिवर्ती और एक पशु मॉडल में व्यक्तिगत transposon म्यूटेंट के डाह परीक्षण में सम्मिलन साइट की पहचान के बाद द्वारा म्यूटेंट का एक संग्रह का निर्माण होता है । इस दृष्टिकोण समय लेने वाली है, महंगा है, और पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है ।
जब यादृच्छिक mutagenesis पहले रोगज़नक़ Leptospira interrogansके लिए विकसित किया गया था, डाह में शामिल जीन एक जानवर मॉडल में व्यक्तिगत म्यूटेंट परीक्षण द्वारा पहचाने गए थे1. म्यूटेंट मानदंडों के आधार पर इस तरह के संकेत या गतिशीलता में उनके संभावित भूमिकाओं या उनकी भविष्यवाणी की बाहरी झिल्ली या सतह स्थान के रूप में चयन किया गया । leptospiral जीन के बहुमत के रूप में 2अज्ञात समारोह के काल्पनिक प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना, इन मानदंडों के आधार पर म्यूटेंट का चयन उपंयास leptospiral डाह जीन की खोज करने की क्षमता सीमा ।
हाल ही में, एल interrogans transposon म्यूटेंट के पूल हंसटर और माउस मॉडल3में infectivity के लिए जांच की गई । प्रत्येक जानवर को 10 म्यूटेंट के एक पूल के साथ चुनौती दी थी । एक उत्परिवर्ती के Infectivity के रूप में सकारात्मक अगर यह रक्त और गुर्दे से प्राप्त संस्कृतियों की पीसीआर द्वारा पता चला था बनाए गए थे । पीसीआर परीक्षण श्रमसाध्य क्योंकि यह पूल में प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए एक व्यक्ति पीसीआर प्रतिक्रिया की आवश्यकता थी । क्योंकि संस्कृतियों में प्रत्येक उत्परिवर्ती की आवृत्ति मात्रा नहीं था, दृष्टिकोण अत्यधिक तनु म्यूटेंट की पहचान की दिशा में पक्षपातपूर्ण था ।
हम डाह जीन के लिए और अधिक कुशलता से स्क्रीन करने के लिए एक रणनीति के रूप में एक transposon अनुक्रमण (तमिलनाडु-Seq) तकनीक का वर्णन । तमिलनाडु-seq transposon mutagenesis द्वारा म्यूटेंट के एक पुस्तकालय के निर्माण के बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण4,5,6के बाद के होते हैं । संक्षेप में, transposon म्यूटेंट, पशुओं में inoculated, और बाद में विभिन्न अंगों (आउटपुट पूल) से बरामद कर रहे हैं । आउटपुट पूल से डीएनए निकाला और प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा या sonication द्वारा कतरनी है । transposon बिंद स्थलों के जंक्शनों को टारगेट कर रहे पीसीआर के दो राउंड प्रदर्शन किए हैं । यह चरण sequencing के लिए आवश्यक एडेप्टर के अतिरिक्त सक्षम करता है । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों उच्च प्रवाह अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण कर रहे है उनके रिश्तेदार बहुतायत है, जो उत्परिवर्ती के पूल की प्रारंभिक संरचना की तुलना में है के साथ साथ पूल के प्रत्येक उत्परिवर्ती के transposon प्रविष्टि साइट की पहचान ।
इस दृष्टिकोण का प्राथमिक लाभ के लिए एक साथ जानवरों की एक छोटी संख्या के साथ म्यूटेंट की एक बड़ी संख्या स्क्रीन करने की क्षमता है । तमिलनाडु-Seq transposon सम्मिलन साइटों जो नए Leptospira-विशिष्ट जीन कम समय और अधिक से अधिक दक्षता के साथ डाह में शामिल की खोज की संभावना बढ़ जाती है की पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं है । क्योंकि ऊतकों में leptospiral बोझ मूषक के घातक संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील मॉडलों में अपेक्षाकृत अधिक है (आमतौर पर 104 से 108 बैक्टीरिया/8,9 के साथ ही जलाशय मेजबानों में 10,11, ऊतकों सीधे संस्कृति की आवश्यकता के बिना विश्लेषण किया जा सकता है, इन विट्रो विकास के कारण पूर्वाग्रहों को कम करने ।
तमिलनाडु में सबसे बैक्टीरियल रोगज़नक़ों तिथि करने के लिए वर्णित के साथ Seq अध्ययन, सम्मिलनी mutagenesis की उच्च आवृत्ति म्यूटेंट युक्त बड़े पूल के साथ संक्रमण की अनुमति दी सामूहिक रूप से कई बारीकी से होने वाली अंतरिक्ष transposon हर जीन 4 के भीतर सम्मिलन ,12,13,14. तमिलनाडु-Seq भी एक जीवाणु है जिसके लिए mutagenesis आवृत्ति बहुत कम है के लिए विकसित किया गया है6। Leptospiraके साथ, transposon म्यूटेंट के एक पुस्तकालय प्लाज्मिड द्वारा विकार एट अल15द्वारा वर्णित के रूप में एक समाजीय Slamti पर transposon शुरू करने से उत्पंन किया जा सकता है । हालांकि, एल interrogans के transposon mutagenesis की फ्रीक्वेंसी कम है । जब Himar1 transposon एक conjugative प्लाज्मिड पर पेश किया गया था, transconjugant आवृत्ति एल interrogans16 के लाइ तनाव के साथ केवल ८.५ x 10-8 प्रति प्राप्तकर्ता सेल होने की सूचना दी थी और होने की संभावना है इसी प्रकार एल interrogansके अधिकांश अंय उपभेदों के साथ गरीब । यहां वर्णित प्रोटोकॉल अरै burgdorferiके लिए विकसित किया गया है, जिसमें transposon बिंद mutagenesis की आवृत्ति भी कम6है के आधार पर भाग में है ।
हमारे प्रोटोकॉल के साथ पायलट प्रयोग के लिए17, हम एल interrogans serovar के साथ transposon mutagenesis का आयोजन किया है, क्योंकि अंय समूहों की सफलता के साथ तनाव में L495 सम्मिलन transposon अलग करने में अपने कम LD५० (घातक खुराक) डाह1के लिए । हम तमिलनाडु-Seq द्वारा ४२ म्यूटेंट की जांच की और कई उत्परिवर्ती डाह में दोषपूर्ण उंमीदवारों की पहचान की, एक उंमीदवार adenylate cyclase जीन में सम्मिलन के साथ दो सहित । हंसटर में दो म्यूटेंट के व्यक्तिगत परीक्षण की पुष्टि की है कि वे डाह17में कमी थी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि हंसटर के लिए हमारे पायलट प्रयोग से ४२ एल interrogans म्यूटेंट के साथ intraperitoneally चुनौती दी17प्रस्तुत कर रहे हैं, हम उंमीद है कि म्यूटेंट के बड़े पूल तमिलनाडु द्वारा जांच की जा सकती है-Seq । क्योंकि t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक दिग्गजों मामलों मेरिट पुरस्कार (D.A.H. के लिए) और स्वास्थ्य अनुदान R01 ऐ ०३४४३१ (D.A.H.) के एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
References
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
- Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
- Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
- Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
- Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
- Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
- Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
- Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
- Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
- Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
- Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
- Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
- Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
- Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
- Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
- Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
- McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
- Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
- Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
- Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
- Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).
