Hög genomströmning parallella sekvensering att mäta konditionen av Leptospira interrogans Transposon införande mutanter under gyllene syriska Hamster infektion
Summary
Här beskriver vi en teknik som kombinerar transposon mutagenes med hög genomströmning sekvensering att identifiera och kvantifiera transposon leptospiral mutanter i vävnader efter en utmaning av hamstrar. Detta protokoll kan användas till skärmen mutanter för överlevnad och spridning i djur och kan också tillämpas på in vitro- studier.
Abstract
I detta manuskript beskriver vi en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknik för att identifiera och kvantifiera Leptospira interrogans mutanter ändras i fitness under infektion i gyllene syriska hamstrar. TN-Seq kombinerar slumpmässiga transposon mutagenes med kraften av hög genomströmning sekvenseringsteknologi. Djur utmanas med en pool av transposon mutanter (ingång pool), följt av upptagning av blod och vävnader några dagar senare för att identifiera och kvantifiera antalet mutanter i varje organ (utdata pooler). Utdata poolerna jämförs ingående poolen att utvärdera i vivo lämplighet varje mutant. Denna metod gör det möjligt för screening av en stor pool av mutanter i ett begränsat antal djur. Med smärre ändringar, kan detta protokoll utföras med någon djurmodell av leptospiros, reservoar värd modeller såsom råttor och akut infektion såsom hamstrar som in vitro- studier. TN-Seq erbjuder ett kraftfullt verktyg till skärmen för mutanter med i vivo och in vitro- fitness defekter.
Introduction
Identifiering av virulensgener för vissa bakterier, såsom Leptospira spp., är svårt på grund av det begränsade antalet genetiska verktyg tillgängliga. En vanligt förekommande metod är skapandet av en samling av mutanter av slumpmässiga transposon mutagenes följt av identifiering av insticksstället i varje mutant och virulens provning av enskilda transposon mutanter i en djurmodell. Denna metod är tidskrävande, dyra och kräver ett stort antal djur.
När slumpmässig mutagenes utvecklades först för patogen Leptospira interrogans, identifierades genernas virulens genom att testa enskilda mutanter i en djurmodell1. Mutanter valdes utifrån kriterier som deras potentiella roller i signalering eller motilitet eller deras förväntade yttre membran eller markrättigheter. Eftersom flesta leptospiral gener koda hypotetiska proteiner av okänd funktion2, välja mutanter baserat på dessa kriterier begränsar förmågan att upptäcka roman leptospiral virulensgener.
Mer nyligen, pooler av L. interrogans transposon mutanter som screenades för smittsamhet i hamster och mus modeller3. Varje djur ifrågasattes med en pool av upp till 10 mutanter. Smittsamhet av en mutant gjorde var så positiv om det upptäcktes av PCR av kulturer som erhållits från blod och njure. PCR-test var arbetskrävande eftersom det krävs en individuell PCR-reaktion för varje mutant i poolen. Eftersom frekvensen av varje mutant i kulturer inte kvantifierades, var metoden partisk mot identifiering av mycket försvagat mutanter.
Vi beskriver en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknik, som en strategi för att mer effektivt skärmen för virulensgener. TN-seq består av skapandet av ett bibliotek av mutanter av transposon mutagenes följt av massiva parallella sekvensering4,5,6. Transposon mutanter är kort, poolade, inokuleras i djur och senare återhämtat sig från olika organ (utdata pooler). DNA från utdata poolerna är extraherade och smält med restriktionsenzym eller klippt av ultraljudsbehandling. Två omgångar av PCR inriktning korsningar av transposon införande platserna utförs. Detta steg kan tillägg av adaptrarna som behövs för sekvenseringen. De resulterande PCR-produkterna analyseras av hög genomströmning sekvensering att identifiera insättningsstället transposon på varje mutant av poolen tillsammans med deras relativa överflöd, som jämfört med den ursprungliga sammansättningen av av mutant.
Den främsta fördelen med denna metod är möjligheten att samtidigt visa ett stort antal mutanter med ett litet antal djur. TN-Seq kräver inte den tidigare kunskap av transposon införande platser vilket ökar chanserna att upptäcka nya Leptospira-specifika gener inblandade i virulens med mindre tid och större effektivitet. Eftersom leptospiral börda i vävnader är relativt hög i gnagare modeller mottagliga för dödliga infektion (vanligtvis 104 till 108 bakterier/g vävnad)7,8,9 samt för liksom i reservoaren värdar 10,11, vävnader kan analyseras direkt utan att behöva kultur, minska fördomar på grund av in vitro- tillväxt.
I Tn-Seq studier med de flesta bakteriella patogener beskrivs hittills, den höga frekvensen av insertionsmutationer tillåtna infektion med stora pooler som innehåller mutanter kollektivt med flera tätt radavstånd transposon infogningar inom varje gen4 ,12,13,14. TN-Seq har också utvecklats för en bakterie som mutagenes frekvensen är mycket lägre6. Med Leptospira, kan ett bibliotek av transposon mutanter genereras genom att införa transposon på en mobilizable plasmid av konjugering som beskrivs av Slamti et al15. Frekvensen av transposon mutagenes av L. interrogans är dock låg. När den Himar1 transposon introducerades på en konjugering plasmid, rapporterades transconjugant frekvensen vara bara 8,5 x 10-8 per mottagare cell med Lai stam L. interrogans16 och sannolikt är Likaså fattiga med de flesta andra stammar av L. interrogans. Protokollet beskrivs här är delvis baserat på som utvecklats för Borrelia burgdorferi, där frekvensen av transposon insertionsmutationer är också låg6.
För vår pilot experiment med de protokoll17genomförde vi transposon mutagenes med L. interrogans serovar Manilae stam L495 på grund av framgången för andra grupper i isolera transposon införande mutanter i stam tillsammans med dess låga LD50 (dödlig dos) för virulens1. Vi visades 42 mutanter av Tn-Seq och identifierat flera mutant kandidater defekt i virulens, varav två med infogningar i en kandidat adenylatcyklas gen. Individuell testning av två mutanter i hamstrar bekräftade att de var bristfällig i virulens17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om resultaten från vår pilot experiment för hamster utmanas intraperitonealt med 42 L. interrogans mutanter presenteras17, förväntar vi oss att större pooler av mutanter kan kontrolleras av Tn-följande punkter Eftersom frekvensen av transconjugants är låg (100-200 transconjugants/parning), flera parningar är nödvändiga för att generera ett tillräckligt antal mutanter för stora Tn-Seq experiment. Att upprätthålla ett stort antal mutanter i flytande kulturer presenter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en veteraner frågor Merit Award (till D.A.H.) och en National Institute of Health bevilja R01 AI 034431 (D.A.H.).
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
References
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
- Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
- Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
- Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
- Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
- Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
- Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
- Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
- Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
- Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
- Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
- Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
- Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
- Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
- Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
- Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
- McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
- Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
- Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
- Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
- Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).
