Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høj overførselshastighed parallelle sekvensering til foranstaltning Fitness af Leptospira interrogans Transposon indsættelse mutanter under Golden syriske Hamster infektion

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

Vi beskriver her en teknik, der kombinerer transposon mutagenese med høj overførselshastighed sekvensering til at identificere og kvantificere transposon leptospiral mutanter i væv efter en udfordring af hamstere. Denne protokol kan bruges til skærm mutanter for overlevelse og udbredelse i dyr og kan også anvendes til in vitro- undersøgelser.

Abstract

I dette manuskript beskriver vi en transposon sekventering (Tn-Seq) teknik for at identificere og kvantificere Leptospira interrogans mutanter ændret i fitness under infektion af Golden syriske hamstere. TN-Seq kombinerer tilfældige transposon mutagenese med magt af høj overførselshastighed sekventering teknologi. Dyr bliver udfordret med en pulje af transposon mutanter (input pool), efterfulgt af høst af blod og væv et par dage senere for at identificere og kvantificere antallet af mutanter i hvert organ (output pools). Output pools er i forhold til de input pool at vurdere hver enkelt mutant i vivo egnethed. Denne tilgang gør det muligt for screening af en stor pulje af mutanter i et begrænset antal dyr. Med mindre ændringer, kan denne protokol udføres med en dyremodel for leptospirose, reservoir vært modeller som rotter og akut infektion modeller såsom hamsters, såvel som in vitro- undersøgelser. TN-Seq giver en kraftfuld værktøj til skærmen for mutanter i vivo og in vitro- fitness defekter.

Introduction

Identifikation af virulens gener for nogle bakterier, som Leptospira spp., er vanskelig på grund af det begrænsede antal genetiske værktøjer til rådighed. En almindeligt anvendt metode er oprettelsen af en samling af mutanter af tilfældige transposon mutagenese efterfulgt af identifikation af indsættelsesstedet i hver mutant og virulens afprøvning af individuelle transposon mutanter i en dyremodel. Denne tilgang er tidskrævende, dyrt og kræver et stort antal dyr.

Når tilfældig mutagenese blev først udviklet for patogenet Leptospira interrogans, blev gener involveret i virulens identificeret ved at teste individuelle mutanter i en dyremodel1. Mutanter blev udvalgt på grundlag af kriterier såsom deres potentielle roller i signalering eller motilitet forudsagte ydre membran eller overflade placering. Som fleste af leptospiral gener koder for hypotetiske proteiner af ukendt funktion2, vælge mutanter baseret på disse kriterier grænser evne til at opdage roman leptospiral virulens gener.

Mere nylig, puljer af L. interrogans transposon mutanter blev screenet for infektivitetsniveauet i hamster og mus modeller3. Hvert dyr blev udfordret med en pulje af op til 10 mutanter. Smitteevne af en mutant blev scoret som positiv, hvis det blev opdaget af PCR kulturer fremstillet af blod og nyrerne. PCR test var besværlige, fordi det krævede en individuel PCR reaktion til hver mutant i poolen. Da hyppigheden af hver mutant i kulturerne ikke var kvantificeres, var tilgangen forudindtaget mod identifikation af stærkt svækkede mutanter.

Vi beskriver en transposon sekventering (Tn-Seq) teknik, som en strategi til mere effektivt skærmen for virulens gener. TN-seq består af oprettelsen af et bibliotek af mutanter af transposon mutagenese efterfulgt af massive parallelle sekventering4,5,6. Kort, transposon mutanter er samlet, podes i dyr, og senere inddrives fra forskellige organer (output pools). DNA fra output puljer er udvundet og fordøjes med restriktionsenzymer eller forskydes ved hjælp af sonikering. To runder af PCR målretning knudepunkter af transposon indsættelse websteder er udført. Dette trin giver mulighed for tilsætning af de adaptere nødvendige for Sekventeringen. De resulterende PCR produkter analyseres af høj overførselshastighed sekvensering til at identificere webstedet transposon indsættelse af hver mutant pool sammen med deres relative forekomst, som er i forhold til den oprindelige sammensætning af puljen af mutant.

Den primære fordel ved denne tilgang er evnen til at samtidig skærm et stort antal mutanter med et lille antal dyr. TN-Seq kræver ikke forudgående kendskab til transposon indsættelse websteder som øger chancerne for at opdage nye Leptospira-specifikke gener involveret i virulens med mindre tid og større effektivitet. Fordi leptospiral byrde i væv er forholdsvis høj i gnavere modeller modtagelige for dødelig infektion (typisk 104 til 108 bakterier pr. g væv)7,8,9 så godt som i reservoiret værter 10,11, væv kan analyseres direkte uden at skulle kultur, reducere bias som følge af in vitro- vækst.

I Tn-FF. undersøgelser med de fleste bakterielle patogener beskrevet til dato, den høje frekvens af pattedyrsceller mutagenese tilladt infektion med store swimmingpools der indeholder mutanter kollektivt har flere nært afstand transposon indrykninger inden for hvert gen4 ,12,13,14. TN-Seq er også blevet udviklet til en bakterie som mutagenese frekvens er meget lavere6. Med Leptospira, kan et bibliotek af transposon mutanter genereres ved at indføre transposon på en kan mobiliseres plasmid af konjugation som beskrevet af Slamti al.15. Hyppigheden af transposon mutagenese af L. interrogans er dog lav. Når Himar1 transposon blev indført på et konjugering plasmid, blev transconjugant hyppighed rapporteret at være kun 8,5 x 10-8 pr. modtager celle med Lai stamme af L. interrogans16 og forventes at være tilsvarende fattige med de fleste andre stammer af L. interrogans. Protokollen beskrevet her er i en del baseret på udviklet til Borrelia burgdorferi, hvor hyppigheden af transposon pattedyrsceller mutagenese er også lav6.

For vores pilot eksperiment med protokol17gennemførte vi transposon mutagenese med L. interrogans serovar Manilae stamme L495 på grund af succesen med andre grupper i isolere transposon indsættelse mutanter i stammen, der sammen med sin lave LD50 (dødelig dosis) for virulens1. Vi screenet 42 mutanter af Tn-FF. og identificeret flere mutant kandidater defekt i virulens, herunder to med indsættelser i en kandidat adenylate cyclase genet. Individuelle test af de to mutanter i hamstere bekræftet at de var mangelfuld i virulens17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: Patogene stammer af Leptospira spp. skal behandles efter biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) indeslutning procedurer. Passende personlige værnemidler (PPE) skal bæres. En klasse II biosikkerhed kabinet skal bruges til alle manipulationer af patogene Leptospira spp.

1. oprettelsen af Transposon Mutant bibliotek15

  1. Overførsel af transposon til Leptospira spp. af konjugation (figur 1)
    1. Podes en volumen af eksponentielle-fase kultur af patogene Leptospira spp. svarende til 107 celler til 10 mL af Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris medium (EMJH)18,19. Der inkuberes ved 30 ° C med 150 rpm ryster indtil tætheden når 2-8 x 108 celler/mL.
      Bemærk: Den fordobling tid af patogene leptospirer er 12 til 24 timer, afhængigt af stammen.
    2. Podes 50 µL af donor Escherichia coli stamme β216320 transporterer kan mobiliseres transposon plasmid (pCjTKS2)16 til 5 mL af Luria bouillon (LB) suppleret med 0,3 mM af 2,6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µg/mL kanamycin (Km), og 50 µg/mL spectinomycin (Spc) og sted natten over i et 37 ° C inkubator ved 255 rpm.
    3. Podes 60 µL af E. coli celler i 3 mL af EMJH suppleret med 0,3 mM af DAP (EMJH + DAP). Der inkuberes ved 37 ° C på 255 rpm agitation i 3-4 timer op til en OD600nm≈ 0,3.
    4. For at samle filtrering enhed (figur 1), Anbring basen på en 125 mL side-arm Erlenmeyerkolbe, placere en acetat-cellulose filter (pore størrelse 0,1 mm, diameter 25 mm) på base, og klemme tragt på soklen. Filtrering enhed tilsluttes et vakuum system.
    5. Der tilsættes 5 mL af Leptospira spp. kultur og 0,5 mL af E. coli kultur ind i tragten. Vakuum væske gennem filteret.
    6. Overføre filter med overfladen af bakterier vender mod en EMJH + DAPplate. Inkuberes ved 30 ° C natten over med filteret opad.
    7. Placer filteret i en 15 mL rør indeholdende 1 mL af EMJH og vortex for 10 s til at frigive bakterierne i medierne. Sprede 200 µL af suspension på 5 EMJH platescontaining 50 µg/mL Km med 10-15 1 mm sterilt glasperler eller et sterilt engangs sprederen. Wrap plader med parafilm og Inkuber dem op og ned på 30 ° C i 3-4 uger indtil kolonier er synlige.
    8. Overføre kolonier individuelt i 3 mL af EMJH indeholdende 50 µg/mL Km (EMJH + Km) ved 30° C under 150 rpm agitation for 7 til 10 dage indtil kulturen når en tæthed af ≈ 108/mL.
      Bemærk: Kulturer kan opbevares ved-80 ° C eller i flydende nitrogen (med 4% glycerol).
  2. Identifikation af transposon indsættelsesstedet af indlejrede PCR (figur 2)
    1. Lyse 50 µL af hver transposon mutant i PCR rør ved inkubering ved 95 ° C i 15 min.
      Bemærk: DNA kan renses i stedet, ved hjælp af en DNA-ekstraktion kit.
    2. Forberede PCR-blandingen med Deg1 og Tnk1 primere (tabel 3) i henhold til tabel 1. Overføre 23,7 µL af blandingen til hver PCR rør og tilføje 1,3 µL af mængden celler. Kør programmet: 95° C i 5 min; 40 cyklusser: 95 ° C i 15 s, 40 ° C i 1 min., 72 ° C i 2 min. 72 ° C i 10 min.
    3. Gøre PCR mix med Tag og TnkN1 primere (tabel 3) Tabel2. Overføre 24,2 µL af blandingen til hver PCR rør og tilføje 0,8 µL PCR #1 reaktion. Kør programmet: 95 ° C i 5 min; 35 cykler: 95 ° C i 15 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 2 min. 72 ° C i 10 min.
    4. Køre 3 µL PCR produkter på en 1%-agarosegel med 1 X Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer på 10-15 V/cm (figur 2B).
    5. Rense PCR produkter af positive prøver ved hjælp af en PCR rensning kit. Elueres DNA med den laveste mængde lov af sættet til at maksimere koncentrationen af DNA inddrevet.
    6. Send renset PCR produkter for Sanger sekventering ved hjælp af TnkN1 primer (tabel 3).
    7. Identificere indsættelse websteder ved at sammenligne den deraf følgende sekvens med forældrenes stammen genomet sekvens af BLASTN analyse (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) eller ved hjælp af SpiroScope database (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage)21.
    8. Bekræfte indsættelsesstedet af transposon ved PCR ved hjælp af primere udglødning til de flankerende vært sekvenser.
      Bemærk: Transposon øger størrelsen af vildtype sekvens af ≈ 2 kb.

2. animalske eksperiment (figur 3)

  1. Kultur af Leptospira mutanter
    1. Vokse individuelt hver valgte transposon mutant i 10 mL af EMJH + Km ved 30 ° C på 150 rpm agitation til en tæthed af 107-108 leptospirer/mL.
    2. Tælle leptospirer ved mørke-felt mikroskopi med en Petroff-Hausser counter eller som beskrevet af Miller23.
    3. Fortynd hver kultur i EMJH til den samme tæthed, for eksempel 106 celler/mL.
    4. For at samle de input pool, Bland de fortyndede kulturer i lige store mængder.
      Bemærk: Omfatte kontrol i input puljen ved at tilføje mutanter med kendte fitness defekter såsom loa2217,24 og mutanter med uforandret fitness som ligB17,25, henholdsvis. Puljer af mutanter kan gemmes med 4% glycerol ved-80 ° C eller i flydende nitrogen.
  2. Udfordring
    Bemærk: De metoder, der beskrives her blev godkendt af veteraner anliggender større Los Angeles institutionelle Animal Care og brug Udvalget (protokol #09018-14).
    1. Injicere intraperitoneal 1 mL af input pool til hvert dyr med en insulin sprøjte U-100 med 26G x ½" nål.
      Bemærk: I pilotprojekt, 8 dyr blev udfordret med 1 mL af input puljen, dvs., 106 bakterier samlede17. Infektionen fik lov til at fortsætte i 4 dage forud for aktiv dødshjælp.
    2. Indsamle 10 mL af den input pool, og spin for 20 min på 3,220 x g. forsigtigt fjerne supernatanten uden at forstyrre pelleten. Gemme celle pellet på - 80˚C indtil brug (trin 3.1.3).
    3. Overvåge dyrene dagligt, indtil de er afsluttet på den forudbestemt slutpunkt. Vejer hamstere dagligt og kigge efter slutpunkt kriterier: tab af appetit, gangart eller vejrtrækning problemer, udmattelse, pjusket pels, eller tab af > 10% af den maksimale vægt er nået.
  3. In vitro- eksperiment
    1. På dagen for udfordring, podes 3 flasker af 25 mL af EMJH + Km med 5 mL af input pool. Vokse kulturer ved 30 ° C under 150 rpm agitation.
    2. Tælle leptospirer dagligt ved hjælp af en af metoderne til afsnit 2.1.2. Når tætheden når ≈ 1 x 108/mL, spin ned hver suspension i 20 min. på 3,220 x g.
    3. Gemme celle pellets ved-80 ° C indtil brug.
  4. Høst og opbevaring af væv
    1. Euthanize dyrene ved isofluran inhalation efterfulgt af bilaterale torakotomi26.
    2. Straks indsamle 1 til 2 mL blod af cardiac punktering med en 3 mL sprøjte og en 25G x 5/8" nål. Overføre blodet ind i rør indeholdende EDTA. Mix af inversion, 5-6 gange.
    3. Indsamle en nyre og ⅓ til halvdelen af den ventrale median lap af leveren i cryotubes.
    4. Gemme væv ved-80 ° C indtil brug.

3. opførelse af genomisk biblioteker for høj overførselshastighed sekventering (figur 4)

  1. DNA-ekstraktion
    1. DNA-ekstraktion fra blod.
      1. Overfør 100 µL af blod fra EDTA-rør til et microcentrifuge rør.
      2. Rense DNA ved hjælp af en DNA-ekstraktion kit. Følg producentens anvisninger.
    2. DNA-ekstraktion fra væv.
      1. Med skalpeller og saks, terninger mellem 50 til 80 mg af hvert organ i små stykker (1 mm x 1 mm), og overføre dem til en steril skruelåg tør tube. Måle vægten af væv med en præcision-balance.
      2. Tilsættes 500 µL sterilt PBS i røret.
      3. Homogeniseres prøver ved hjælp af disruptor for 1 min på 5 bevægelser i sekundet.
      4. Beregne den mængde, der svarer til 25 mg af væv ved hjælp af følgende ligning:
        Equation 1
      5. Overføre den beregnede mængde til DNA-ekstraktion kit. Fortsætte med DNA oprensning efter fabrikantens anvisninger.
    3. DNA-ekstraktion fra input pool og i vitro kulturer.
      1. Tø bakteriel pellets ved stuetemperatur i 5-10 min.
      2. Fortsætte med DNA-ekstraktion følge vejledningen ledsager kit.
    4. Store DNA ved-80 ° C indtil brug.
  2. Klipning DNA (figur 5)
    1. Overføre 50 µL af ekstraherede DNA på en 1,5 mL microcentrifuge tube.
    2. Sted rør ind i rack af sonikator cup horn fyldt med koldt vand (4 ° C).
    3. Køre sonikator i 3 min. ved 80% intensitet med 10 s på puls og 5 s off puls.
      Forsigtig: Bære høreværn eller ørepropper til at beskytte hørelse.
    4. Køre 2,5 µL af den afrevne DNA på en 2%-agarosegel at bekræfte, at de fleste af DNA er < 600 bp i størrelse.
  3. Tilsætning af C-hale
    1. Måle DNA koncentration med en lille mængde Spektrofotometer.
    2. Beregning af volumen svarende til 500 ng af DNA ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 2
    3. Forberede hale reaktion (tabel 4). Inkubér 1 h ved 37 ° C; inaktivere ved 75 ° C i 20 min.
      Bemærk: For prøver, der kræver tilpasning til et volumen på mere end 14,5 µL, øge den endelige mængden af reaktion på 40 µL og skalere op de resterende komponenter i overensstemmelse hermed.
    4. Ren prøver med en PCR rensning kit. Elueres DNA med 12 µL af eluering buffer.
  4. Indlejrede PCR
    1. PCR #1
      1. Forberede PCR blander ifølge tabel 3 og 5. Overføre 22 µL af bibliotek blandingen til hver PCR rør og tilføje 3 µL af oprenset DNA. Fortsæt på samme måde med kontrol mix.
        Bemærk: Primer TnkN317 er specifikke for transposon og primer olj3766 er specifikke for C-hale. Kontrol mix mangler TnkN3 primer, som specifikt er rettet mod transposon.
      2. Køre følgende program: 95 ° C i 2 min.; 24 cyklusser: 95 ° C til 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 min. 72 ° C i 2 min.
    2. PCR #2.
      1. Forberede den anden PCR blander ifølge tabel 3 og 6. Overføre 49 µL af bibliotek blandingen til hver PCR rør og tilføje 1 µL PCR #1 bibliotek reaktion. Overføre 24,5 µL af kontrol mix til hver PCR rør og tilsæt 0,5 µL PCR #1 kontrol reaktion.
        Bemærk: Primer pMargent2 er specifikke for transposon, og IP primere6 indeholder seks-basepar stregkode og specifikke sekvenser anerkendt af den næste generation sequencing platform.
      2. Køre følgende program: 95 ° C i 2 min.; 18 cykler: 95 ° C til 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 min. 72 ° C i 2 min.
    3. Køre 3 µL på en 2%-agarosegel. Biblioteket bør vise en smear med størstedelen af signalet mellem 200 og 600 bp (figur 6) og ingen forstærkning for kontrol reaktion.
  5. Oprensning af PCR produkter.
    Bemærk: Ren de genomisk biblioteker med en PCR rensning kit efter fabrikantens anvisninger. Elueres DNA med 30 µL af eluering buffer.
  6. Måle DNA koncentrationen ved hjælp af en fluorometer. Gennemsnitligt 2 til 3 læser.
  7. Volumen af hver bibliotek svarende til 15 eller 20 ng ved hjælp af nedenstående ligning beregnes:
    Equation 3
  8. Bland alle biblioteker sammen efter de tidligere beregninger. Bestemme den molære koncentration af DNA med følgende websted ligning:
    http://www.molbiol.edu.RU/ENG/scripts/01_07.html
    Forsigtig: DNA koncentration og volumen krav afhænger sekventering platform.

4. høj overførselshastighed sekvensering og dataanalyse

  1. Sekventering
    1. Sekvens biblioteker som 64 bp single-ende læser ved hjælp af brugerdefinerede sekventering primer pMargent3 og standard kommercielle sekventering primer. Sekventering platform vil give dig FastQ filer med alle sekventering læser.
  2. Analyse med Galaxy-software
    1. Hent filen genomet sekvens
      1. I SpiroScope database hjemmeside (Se trin 1.2.7 for link), Vælg den organisme, der anvendes for eksperimentet og klikke på "Belastning i GENOM BROWSER".
      2. I værktøjslinjen (nær toppen af hjemmesiden), Vælg "Søg/eksport > Hent data", klik på "Genom" for at downloade sekvensen i linjen "Sekvens (fasta)".
      3. Åbn filen med notesblok (PC) eller TextEdit (Mac) og omdøbe kromosom (for eksempel "ChrI"). Vedligeholde fasta format.
      4. Følg de samme trin for at hente sekvensen af kromosom II. Kombinere begge kromosom sekvenser i en enkelt .txt-fil ved at kopiere og indsætte.
        Bemærk: Kromosom sekvenser kan også downloades fra NCBI hjemmeside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) og kombineret i en enkelt .txt-fil.
    2. Uploade filer på Galaxy server
      Bemærk: Galaxy er en open source, web-baseret platform til styring af data intensive Bioinformatik arbejdsprocesser27,28,29,30 og kan tilgås på https://usegalaxy.org/.
      1. I menuen Funktioner, Vælg "få data > Upload fil fra din computer". Træk og slip .fastq fil(er) genereret af sekventering platform i vinduet og klik på "Start".
      2. Følg de samme trin for at uploade Leptospira genomet sekvens .txt-filen.
    3. Gommen læser
      1. Vælg "NGS: QC og manipulation > FASTQ Groomer" fra menuen Funktioner.
      2. Ved siden af fil til gommen, Vælg bibliotekerne har uploadet i trin 4.2.2. Input FASTQ kvalitet score type, Vælg den relevante sekventering system. Til avancerede indstillinger, efterlade skjule Advanced Office valgt.
      3. Klik på "Udfør".
    4. Fjerne sekventering artefakter
      1. Vælg "NGS: QC og manipulation > fjerne sekventering artefakter". Ved siden af biblioteket filter, skal du vælge de præparerede filer genereret i trin 4.2.3. Klik på "Udfør".
    5. Fjerne C-hale sekvenser
      Bemærk: Gentag disse skridt en gang eller to gange til at sikre alle C-haler er fjernet.
      1. Vælg "NGS: QC og manipulation > klip adapter sekvenser".
      2. Vælg eller angiv følgende:
        Bibliotek til klip: Vælg de filer, der genereres i trin 4.2.4.
        Minimum sekvens længde: 15
        Kilde: Angiv brugerdefineret rækkefølge
        Angiv brugerdefinerede klipning sekvens: CCCCCCC
        Angiv nul værdi for at holde adapteren sekvenser og x baser, der følger det: 0
        Kassér sekvenser med ukendt (N) baser: Ja
        Outputindstillinger: Output både klippede og ikke klippet sekvenser
      3. Klik på "Udfør".
    6. Fjerne adapteren sekvenser
      1. Vælg "NGS: QC og manipulation > klip adapter sekvenser".
      2. Vælg eller angiv følgende:
      3. Bibliotek til klip: Vælg filer genereret i trin 4.2.5.
      4. Minimum sekvens længde: 15
      5. Kilde: Angiv brugerdefineret rækkefølge
      6. Angiv brugerdefinerede klipning sekvens: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Angiv nul værdi for at holde adapteren sekvenser og x baser, der følger det: 0
      8. Kassér sekvenser med ukendt (N) baser: Ja
      9. Outputindstillinger: Output både klippede og ikke klippet sekvenser
      10. Klik på "Udfør".
    7. Filter læser baseret på deres kvalitet
      1. Vælg "NGS: QC og manipulation > Filtrer efter kvalitet".
        Bemærk: Dette værktøj vælger læser baseret på kvalitetsresultat.
      2. Vælg følgende:
        Bibliotek til at filtrere: Vælg de filer, der genereres i trin 4.2.6.
        Kvalitet cut-off værdi: 20
        Procent af baser i sekvens, der skal have kvalitet svarende til/højere end cut-off værdi: 95
      3. Klik på "Udfør".
        Bemærk: Med disse indstillinger, læser kortere end 20 nukleotider eller med en kvalitet score på 20 eller derunder for 95% af cyklusserne er kasseret. Tilpasse strenghed indstillinger til dit eksperiment.
    8. Kort læser32
      1. Vælg "NGS: kortlægning > Bowtie2"32.
      2. Vælg følgende i felterne i hovedvinduet:
        Er denne enkelte eller parret bibliotek: single-udgangen
        FASTQ fil: Vælg biblioteket filtreret for kvalitet fra trin 4.2.7.
        Skrive unaligned (i fastq format) læser for at adskille fil(er): ingen
        Skriv afstemt (i fastq format) læser for at adskille fil(er): ingen
        Vil du vælge en reference genom fra din historie eller bruge en indbygget indeks?: Brug et genom fra historie og opbygge indekset
        Vælg reference genom: Vælg Leptospira genome.txt fil uploadet i trin 4.2.2.
        Sæt læse grupper oplysninger?: ikke angivet
        Vælg analyse tilstand: 1: standardindstillingen kun
        Vil du bruge presets?: Nej, bare bruge standardindstillinger
        Gem bowtie2 kortlægning statistik historie: Nej
        Job-parametre: bruge standard job ressource parametre
      3. Klik på "Udfør" for at justere læser til genomet.
    9. Konvertere filer
      1. Vælg "NGS: SAMtools > BAM til SAM konvertere BAM til SAM".
      2. Vælg følgende:
        BAM fil til at konvertere: Vælg kortlagt bibliotek fra trin 4.2.8.
        Datakontrolpost: Medtag sidehoved i SAM output (-h)
      3. Klik på "Udfør".
    10. Konvertere filer
      1. Vælg "NGS: SAMtools > konvertere SAM til interval".
      2. Vælg følgende:
        Vælg datasæt til at konvertere: Vælg den tilknyttede biblioteksfil, SAM genereret i trin 4.2.9.
        Udskrive alle?: Ja
      3. Klik på "Udfør".
    11. Sorter læser
      1. Vælg "filtrere og sortere > sortere i stigende eller faldende rækkefølge".
      2. Vælg følgende:
        Sorter datasæt: Vælg filen interval genereret i trin 4.2.10.
        på kolonne: 2
        med smag: nummerorden
        alt i: stigende rækkefølge
      3. Klik på "Udfør".
    12. Vælg læser matchende kromosom jeg
      1. Vælg "filtrere og sortere > Vælg linjer, der svarer til et udtryk".
      2. Vælg følgende:
        Vælg linjer fra: Vælg fil med sorterede læser genereret i trin 4.2.11.
        der: matchende
        mønster: Angiv navnet på kromosom jeg som bestemt i trin 4.2.1.3 (fx "ChrI").
      3. Klik på "Udfør".
    13. Vælg læser matchende kromosom II
      Videre efter trin 4.2.12.
    14. Gruppen læser ifølge indsætninger websteder i kromosom
      1. Vælg "Join, subtrahere og gruppe > gruppere data i en kolonne, og Udfør samlede drift på andre kolonner".
      2. Vælg følgende:
        Vælg data: Vælg resulterende fil fra trin 4.2.12.
        Gruppe af kolonne: 2
        Ignorere sagen mens gruppering?: Nej
        Ignorere linjer begynder med disse tegn: Ø
        Operation > + Indsæt handling
        Type: Greve
        På kolonne: 2
        Runde resultatet til nærmeste heltal: Nej
      3. Klik på "Udfør".
    15. Gruppen læser efter indsættelse websteder i kromosom II
      Videre efter trin 4.2.14.
    16. Sorter indsættelse websteder på kromosom
      1. Vælg "filtrere og sortere > sortere i stigende eller faldende rækkefølge".
      2. Vælg følgende:
        Sorter datasæt: Vælg fil fra trin 4.2.14.
        på kolonne: 1
        med smag: nummerorden
        alt i: stigende rækkefølge
      3. Klik på "Udfør".
    17. Sortere indsættelse websteder på kromosom II
      Videre efter trin 4.2.16.
  3. Statistisk analyse
    1. Overføre Galaxy data i regneark ved at kopiere og indsætte de to kolonner fra trin 4.2.16. og 4.2.17. ind i en Excel-fil.
      Bemærk: Den første kolonne er nukleotid koordinat transposon indsættelsesstedet, og den anden kolonne er antallet læsninger på hver indsættelsesstedet.
    2. Identificere genet husly transposon bruger nukleotid koordinat angivet i tabellen.
      Bemærk: For eksempel en transposon indsat på nukleotid #30718 af kromosom jeg er beliggende i LIC10024 -gen, som spænder over nukleotider 29263-31539 i kromosom.
    3. Beregne relative frekvenser (F) for hver mutant i hver væv og input poolen efter nedenstående ligning:
      Equation 4
    4. Beregne output/input nøgletal (R) for hver mutant og væv ved hjælp af nedenstående ligning:
      Equation 5
    5. Wilcoxon underskrevet-rank test
      1. Normalisér alle udgang/indgang nøgletal ved at indstille median ratio for hvert væv i hvert dyr til 1.0. Forholdet mellem 1,0 er neutral, > 1,0 er en ulempe, og < 1,0 er fordelagtige33.
      2. Sammenlign udgang/indgang nøgletal til 1,0 (neutral fitness) ved hjælp af Wilcoxon rank test med P værdier < 0,05 anset for statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oprettelse af et bibliotek af transposon mutanter i L. interrogans af konjugation kræver en filtrering enhed, som vist i figur 1. Vi genvundet 100-200 transconjugants fra hver parring.

Transposon indsættelsesstedet er identificeret i hver mutant ved sekventering af PCR produkt genereret af semi-tilfældigt PCR, som er rettet mod slutningen af transposon og tilstødende vært sekvenser15 (figur 2A). Et eksempel på resultaterne af de semi-tilfældigt PCR er vist i figur 2B. I de fleste tilfælde vil en dominerende amplikon overholdes når Deg1 og Tnk1 primere bruges til den første runde af PCR og Tag og TnkN1 for anden runde. Men på grund af lav specificitet af pentameric sekvensen (... N10GATAT-3') i 3' slutningen af Deg1 primer, vil denne primer anneal på flere steder i hele leptospiral genom. Hvis disse steder er til stede i nærheden af transposon ende, kan flere PCR produkter fås. Når flere amplikoner genereres, kan de være renset sammen fra PCR mix og sekventeret direkte; gel rensning af hver amplikon er ikke nødvendig, fordi de alle indeholder de samme sekvens nedstrøms af hvor TnkN1 primer anneals. På den anden side kan PCR mislykkes, hvis den nærmeste kopi af sekvensen målrettet ved Deg1 primer er beliggende på en stor afstand fra transposon ende. Hvis ingen PCR produkter opdages, kan den første runde af semi-tilfældigt PCR gentages med Deg1 primer og Tnk2 primer, som er rettet mod den modsatte ende af transposon. I dette tilfælde vil TnkN2 og Tag blive brugt for anden runde; amplikonen ville blive sekventeret med TnkN2 primer (figur 2B). Alternativt, den første runde af PCR kan gøres med deg 2 primer, hvis 3' ende (... N10TCTT-3') henvender sig til en fire - snarere end en fem nucleotidsekvensen. Fire forskellige sæt af primere kan bruges til den første runde af PCR (PCR #1): Tnk1 + Deg1, Tnk1 + grader 2, Tnk2 + Deg1, Tnk2 + grader 2. Når ét sæt primere ikke virker, skal du bruge et andet sæt. Hvis dette andet sæt også mislykkes, skal du bruge en anden og så videre. Spontan kanamycin resistente mutanter er meget sjældne, og opstår ved en frekvens på < 10-10 34.

Under udarbejdelsen af genomisk biblioteker (figur 4), kan et par skridt verificeres. Klipning DNA ved hjælp af sonikering bør bekræftes ved elektroforese af en alikvot i en agarosegel (figur 5). Når DNA forskydes korrekt, danne DNA fragmenter spænder fra 200 til 600 bp vil en smøre i en 2%-agarosegel. Før du sender biblioteker til høj overførselshastighed sekvensering, skal generationen af PCR produkter af indlejrede PCR reaktioner for at blive bekræftet ved agarosegelelektroforese gelelektroforese (figur 6).

Efter forarbejdning sekventering læser efter protokollen beskrevet her (afsnit 4.2.), bestemmes hyppigheden af hver mutant i de input pool og i alle væv ved hjælp af ligningen i punkt 4.3.3. Output/input-forholdet for hver mutant i hver væv beregnes med ligningen i afsnit 4.3.4. Figur 7 viser et eksempel på resultaterne med Tn-Seq tilgang. Alternativt, den MAGenTA værktøj kan bruges til at behandle og analysere sequencing data 31. Mutanter med statistisk signifikant reduceret og øget fitness blev identificeret. Mutationer i kendte leptospiral virulens gener forårsaget reduceret fitness, validering af Tn-Seq tilgang.

Figure 1
Figur 1: filtrering enhed bruges til konjugering. Filtrering enhed er samlet ved at indsætte prop filter støtte i en side-arm Erlenmeyerkolbe, positionering acetat-cellulose filter på soklen med steril pincet, derefter placere tragt på soklen og sikre systemet med en klemme . Filtrering enhed forbindes derefter til den vakuum system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: identifikation af transposon indsættelse websteder. (A) ordningen viser udgloedning lokaliteter af semi-tilfældigt PCR primere. Tnk1 og Tnk2 primere anneal tæt på de modsatte ender af transposon (Tn). Deg1 er en 35-nukleotid primer, der indeholder en strækning af 10 degenererede nukleotider efterfulgt af sekvens GATAT på 3'-enden. Den første runde af PCR (PCR #1) er udført med Deg1 og Tnk1 eller Deg1 og Tnk2. TnkN1 og TnkN2 primere, anvendes til PCR #2, at anneal mellem transposon ender og Tnk1 og Tnk2, henholdsvis. Rækkefølgen af Tag primer er identisk med 5' slutningen af Deg1 primer. (B) eksempel på agarosegel fremstillet efter den anden runde af PCR med 14 transposon mutanter (baner 1-14). Den første runde af PCR blev udført med Deg1 og Tnk1; anden runde foregik med Tag og TnkN1. positiv PCR er repræsenteret af "+" og et negativt PCR ved "-". "KmR"repræsenterer kanamycin modstand kassette. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Flow-diagram for at opnå output pool. På dagen for udfordring (dag 0), er hvert leptospiral mutant optalt af darkfield mikroskopi, fortyndet til den samme tæthed og kombineret til at danne de input pool (detaljer i afsnit 2.1). Hamstere er udfordret intraperitoneal med input pool. Derudover blev tre kulturer startet med input pool. På dagen for podning (dag 0) og når kulturer når en tæthed af ≈ er 108/mL, input pool og kulturer indsamlet ved centrifugering og gemt som piller ved-80 ° C indtil brug (Se afsnit 2.3). Den slutpunkt dag (dag forudvalgt for at opsige dyr, fx, dag 4 efter udfordring), aflivet dyr; blod, nyre og lever er indsamlet og opbevares ved-80 ° C indtil brug (Se afsnit 2.4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: diagram af den genomiske biblioteket forberedelse. (A) DNA er ekstraheret fra blod, væv eller kulturer efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 3.1. Den røde boks repræsenterer transposon (Tn). (B) The DNA er forskydes ved hjælp af sonikering i fragmenter mellem 200 og 600 bp. Yderligere oplysninger findes i afsnit 3.2. (C) C-haler (gule bokse) er føjet til alle DNA fragmenter med terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) som beskrevet i afsnit 3.3 og tabel 4. Det genomiske biblioteket er forberedt til sekvensering af indlejrede PCR (D-E). Den første runde af PCR er udført med TnkN3 og olj376 primere specifikke til transposon og C-hale, henholdsvis. Se tabel 3 og 5. Kun fragmenter der indeholder transposon ender (rød boks) forstærkes. Bemærk: Brug 3 gange mere olj376 primer end TnkN3, fordi alle DNA fragmenter har C-haler. Anden runde af PCR er foretaget med pMargent2, specifikke for transposon ende, og en indeksering primer, der indeholder en seks-basepar stregkode sekvens (i pink) giver alle prøver at være multipleksede i en enkelt sekventering lane. Se tabel 3 og 6. Begge primere indeholder sekvenser nødvendige for bindende flow-celle under Illumina sekventering (grønne og lilla boks). (F) den resulterende PCR produkter er renset, og derefter deres koncentration måles som beskrevet i afsnit 3.6. (G) alle genomisk biblioteker er samlet sammen; hvert bibliotek har en forskellige stregkode og (H) poolen er tilsendt sekvensering platform. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: sonikering DNA. DNA blev renset fra lever af otte inficerede hamster (baner 1-8), sonicated, og undersøgt ved elektroforese i en 2%-agarosegel. Afrevne DNA er karakteriseret ved en smøre, hvor størrelsen af de fleste af fragmenterne er mellem 200 og 600 bp. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: genomisk biblioteker til høj overførselshastighed sekvensering. Genomisk biblioteker var udarbejdet af ested PCR med DNA fra blod af otte inficerede hamstere (baner 1-8) og undersøgt af elektroforese i en 2%-agarosegel. Størrelsen af de fleste af PCR-produkter er mellem 200 og 600bp. negativ kontrol (ingen TnkN3 primer i PCR #1 mix, se tabel 5) viser ingen forstærkning (ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Fitness af mutanter fra Tn-Seq eksperiment. Fitness af en pulje af mutanter i hamster's nyre 4 dage efter udfordring (tilpasset fra Lourdaults undersøgelse17). Udgang/indgang forholdet mellem alle 42 mutanter blev fastsat for hvert dyr. Hver mutant er navngivet af genet (lic) eller intergenic-regionen (inter) transposon indsættes eller navnet almindeligt anvendt i litteraturen. Hver ratio er repræsenteret af en sort diamant. Medianværdien af nøgletal (rød linje) var bestemmes for hver mutant og i forhold til 1.0 ved hjælp af Wilcoxon rank test. Den prikkede linje repræsenterer fitness på 1,0, hvilket svarer til neutral fitness. Mutanter hvis fitness påvirkes væsentligt er markeret med en Asterisk: * P < 0,05; ** P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Reagenser Volumen for én reaktion
Master mix 2 X 12,5 ΜL
Primer 1, 10 mM (TnK1 eller TnK2) * 1.2 ΜL
Primer 2, 10 mM (Deg1 eller deg 2) * 1.2 ΜL
Vand 8.8 ΜL
Skabelon (celler lysate eller DNA) 1.3 ΜL
Endelige volumen 25 µL
* Primer sekvenser i tabel 3.

Tabel 1: Identifikation af transposon indsættelsesstedet, semi-tilfældigt PCR #1 mix.

Reagenser Volumen for én reaktion
Master mix 2 X 12,5 ΜL
Primer 1, 100 mM (TnKN1 eller TnKN2) * 0.2 ΜL
Primer 2, 100 mM (Tag) * 0.2 ΜL
Vand 10.1 ΜL
PCR produkter fra PCR #1 0,8 ΜL
Endelige volumen 25 µL
* Primer sekvenser i tabel 3.

Tabel 2: Identifikation af transposon indsættelsesstedet, semi-tilfældigt PCR #2 mix.

Navn Rækkefølge (5' - 3') Reference
Primere anvendes til semi-tilfældigt PCR
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
DEG 2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Tag GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Primere bruges til Illumina sekventering
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Illumina sekventering (stregkoder med fed skrift)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Tabel 3: Primer sekvenser.

Reagenser Volumen for én reaktion
Afrevne DNA 500 ng (Se ligningen i punkt 3.3.2).
Vand Op til 14,5 µL
5 x TdT buffer 4 ΜL
(9,5 mM dCTP + 0,5 mM ddCTP) mix * 1 ΜL
TdT (30 U/µL) 0,5 ΜL
Endelige volumen 20 µL
* Mix 3 µLof 10 mM ddCTP, 5,7 µL af 100 mM dCTP og 51,3 µL vand

Tabel 4: C-hale reaktion med terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT).

Reagenser Volumen for én reaktion
Biblioteket reaktion Kontrol reaktion
Master mix 2 x 12,5 ΜL 12,5 ΜL
Primer 1, 30 µM (TnkN3) * 0,5 ΜL -
Primer 2, 30 µM (olj376) * 1,5 ΜL 1.5
Vand 7.5 ΜL 8 ΜL
C-tailed DNA 3 ΜL 3 ΜL
Endelige volumen 25 µL 25 µL
* Primer sekvenser i tabel 3.

Tabel 5: Opførelse af genomiske biblioteket, PCR #1 mix.

Reagenser Volumen for én reaktion
Biblioteket reaktion Kontrol reaktion
Master mix 2 x 25 ΜL 12,5 ΜL
Primer 1, 30 µM (pMargent2) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Primer 2, 30 µM (indeksering primer) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Vand 23 ΜL 11,5 ΜL
PCR produkter fra PCR #1 1 ΜL 0,5 ΜL
Endelige volumen 50 µL 25 µL
* Primer sekvenser i tabel 3.

Tabel 6: Opførelse af genomiske biblioteket, PCR #2 mix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om resultaterne fra vores pilotprojekt for hamster udfordret intraperitoneal med 42 L. interrogans mutanter præsenteres17, forventer vi, at større puljer af mutanter kan blive screenet af Tn-FF. Da hyppigheden af transconjugants er lav (100-200 transconjugants/parring), flere parringer er nødvendige for at generere et tilstrækkeligt antal mutanter for store Tn-Seq eksperimenter. Opretholde et stort antal mutanter i flydende kulturer præsenterer logistiske udfordringer, der skal løses. Kulturer kan blive udruget i dyb 96-brønd plader. Kultur tætheder kan overvåges af absorbansaflæsningerne i et spektrofotometer, indstillet til 420 nm. Bestemmelse af antallet af dyr at bruge afhænger til dels af størrelsen af det input pulje og skal bestemmes af power analyse. For storskalaforsøg anbefaler vi, at power analyse udføres i samråd med en biostatistician.

Flaskehalse kan påvirke inddrivelse af tilfældige mutanter fra output pool. Selv om alvorlige flaskehalse ikke blev observeret i vores pilotundersøgelse17 (figur 7), kan storskalaforsøg blive påvirket af tilfældige tab af mutanter. Stigende udfordring dosis ved at øge antallet af celler pr. mutant i de input pool vil minimere risikoen for flaskehalse35. Den nyligt offentliggjorte Galaxy værktøj MAGenTA giver den nødvendige værktøj til at vurdere flaskehalse og fitness31.

TN-Seq forsøg planlagt til en alternativ rute af infektion, andre Leptospira stammer, eller andre gnavere modeller kræver yderligere overvejelser. Hvis kinetik af infektion i vært arter kendes ikke eller er ikke konstant eksponentiel i løbet af infektion i hver væv skal undersøges, bør DNA opnås fra dyrkning af væv ikke direkte fra væv. Dette yderligere skridt vil minimere overdimensionerede af mutant fitness på grund af påvisning af DNA fra døde spirokæter. Hvis output pool er fremstillet af dyrkning væv, bør de input pool kulturperler adresse virkninger af in vitro- vækst. Vi anbefaler også et pilotprojekt med et lille antal mutanter at afgøre, om flaskehalse vil være en bekymring og støtte magt analyse for storskalaforsøg.

Bekræftelse af ændrede fitness som fastlagt af Tn-Seq vil kræve testning af individuelle mutanter i en dyremodel. I øjeblikket, skal hver mutant blive sekventeret med individuelt før Tn-Seq til at identificere det muterede transporterer indsættelse i gen af interesse. Dog hvis allel udskiftning i patogene Leptospira bliver let, vil sekventering af individuelle mutanter ikke længere være nødvendige. Alternativt, transkription aktivere-lignende effektorer har held været anvendt til at mindske lig gener udtryk i L. interrogans36. Denne teknik kan bruges til at ned-regulere gener forstyrret i mutanter med ændrede fitness identificeret af Tn-FF.

Ved fortolkningen af Tn-Seq data, skal interaktioner mellem bakterier tages i betragtning. Det er teoretisk muligt, at et fald i fitness kan skyldes konkurrence mellem mutanter snarere end en direkte virkning af transposon indsættelse. Derudover kunne et fravær af ændring i vivo fitness af en mutant i en pulje på grund af samarbejde mellem mutanter. For eksempel, kunne en mutant, der undlader at producere en væsentlig faktor blive suppleret med intercellularly med produktion af faktor af andre mutanter i poolen. Vi observeret en stigning i fitness for flere mutanter, som kan være en konsekvens af den nedsatte metaboliske byrde, ikke længere synteseskabende proteiner, der ikke er afgørende for vækst, som vist for Salmonella enterica37.

Denne protokol kan bruges til at identificere gener involveret i stofskiftet eller overlevelse under stressende forhold i vitro 38,39. For eksempel, kunne voksende Leptospira i forskellige forhold som høj natriumchlorid koncentrationen, begrænset jern og sure pH identificere gener ansvarlige for sure overlevelse eller stress modstand. Disse in vitro- eksperimenter kan også udføres med saprofytiske stammer såsom L. biflexa stamme Patoc jeg fordi dette Tn-Seq metode kan anvendes på alle sekventeret Leptospira stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en veteraner anliggender Merit Award (til D.A.H.) og en National Institute of Health give R01 AI 034431 (D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Tags

Immunologi spørgsmålet 130 høj overførselshastighed sekventering tilfældig mutagenese indlejrede PCR konjugering Leptospira fitness mutanter bibliotek
Høj overførselshastighed parallelle sekvensering til foranstaltning Fitness af <em>Leptospira interrogans</em> Transposon indsættelse mutanter under Golden syriske Hamster infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lourdault, K., Matsunaga, J.,… More

Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter