Summary

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

Published: December 18, 2017
doi:

Summary

Biz burada transposon mutagenesis tanımlamak ve transposon leptospiral mutantlar dokularda hamster bir meydan okuma sonra ölçmek için yüksek üretilen iş sıralama ile birleştirir bir tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı için hayatta kalma ve hayvanlar yayılmasında ekran mutantlar için kullanılabilir ve vitro çalışmalar için de uygulanabilir.

Abstract

Bu makale, bir transposon (Tn-Seq) tekniği tanımlamak ve fitness konusunda altın Suriye hamster enfeksiyon sırasında değiştirilmiş Leptospira interrogans mutantlar ölçmek için sıralama açıklar. TN-Seq rasgele transposon mutagenesis yüksek üretilen iş sıralama teknoloji gücü ile birleştirir. Hayvanlar transposon mutant (giriş havuzu), havuzlu kan ve dokularda birkaç gün sonra tanımlamak ve mutantlar her organ (çıkış havuzları) sayısını ölçmek için hasat tarafından takip zorlanmaktadır. Çıkış havuzları her mutant vivo içinde fitness değerlendirmek için giriş havuza karşılaştırılır. Bu yaklaşım mutant hayvanlar sınırlı sayıda büyük bir havuzu tarama sağlar. Küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı leptospirosis hayvan herhangi bir model, sıçan gibi rezervuar ana bilgisayar modelleri ve vitro çalışmalar yanı sıra, hamster gibi akut enfeksiyon modelleri ile gerçekleştirilebilir. TN-Seq in vivo ve in vitro fitness kusurları mutantlarla için ekran için güçlü bir araç sağlar.

Introduction

Leptospira spp. gibi bazı bakteriler için virülans gen tanımlaması genetik araçlar mevcut sınırlı sayıda nedeniyle zordur. Bir sık kullanılan yaklaşım ardından her mutant ekleme sitedeki tanımlaması ve bireysel transposon mutant bir hayvan modeli virülans test rastgele transposon mutagenesis gitmesini… mutantlardan topluluğu oluşturulmasıdır. Bu yaklaşım zaman alan, pahalı ve çok sayıda hayvan gerektirir.

Rastgele mutagenesis patojen Leptospira interrogansiçin ilk geliştirildiğinde, genler virülans içinde yer alan bir hayvan modeli1‘ bireysel mutant test ederek tespit edilmiştir. Mutantlar sinyal onların potansiyel rolleri veya hareketliliği veya tahmin edilen dış membran veya yüzey konum gibi ölçütlere göre seçildi. Leptospiral çoğunluğu olarak genler kodlamak bilinmeyen fonksiyon2varsayımsal proteinler, seçme mutantlar dayalı bu kriterleri sınırlamalar roman leptospiral virülans genler keşfetmek yeteneği.

Daha yakın zamanlarda, L. interrogans transposon mutantlar takımlık infektivite hamster ve fare modelleri3için gösterildi. Her hayvan en çok 10 mutantlar bir havuz ile karşılaşıyordu. Bir mutant infektivite PCR kan ve böbrek elde kültürler tarafından algılandıysa olumlu olarak atan oldu. Çünkü her mutant havuzu için bireysel bir PCR reaksiyon gerekli PCR testi zahmetli. Her mutant kültürlerde sıklığını sayısal değil çünkü yaklaşım son derece zayıflatılmış mutantlar tanımlaması doğru önyargılı.

Biz bir transposon (Tn-Seq) tekniği, daha verimli bir şekilde ekrana virülans genler için bir strateji olarak sıralama tanımlamak. TN-seq mutantlar Kütüphanesi oluşturulması büyük paralel sıralama4,5,6tarafından takip transposon mutagenesis tarafından oluşur. Kısaca, transposon mutantlar havuza alınmış, hayvana aşı ve daha sonra farklı organ (çıkış havuzları) kurtarıldı. DNA çıktı havuzlarından çıkarılan ve enzimleri ile sindirilmiş veya sonication tarafından sheared. Transposon ekleme siteleri kavşak hedefleyen PCR iki tur gerçekleştirilir. Bu adım nasıl yapılacağını için gerekli adaptörleri ilavesi etkinleştirir. Elde edilen PCR ürünleri her mutant havuzun mutant havuzu ilk kompozisyon karşılaştırıldığında onların göreceli bereket ile birlikte transposon ekleme site tanımlamak için yüksek üretilen iş sıralama tarafından incelenir.

Bu yaklaşımın birincil avantajı aynı anda çok sayıda hayvan az sayıda mutantlarla ekran için yeteneğidir. TN-Seq transposon ekleme siteleri ile yeni Leptospirakeşfetme şansı artar ön bilgi gerektirmez-belirli genler virülans içinde daha az zaman ve daha fazla verimlilik ile ilgili. Leptospiral yük dokularda nispeten yüksek olduğundan kemirgen öldürücü duyarlı enfeksiyon modelleri (genellikle 104 ‘ e 108 bakteri/g doku)7,8,9 de rezervuar ana olduğu gibi 10,11, dokuları doğrudan kültür, önyargıları vitro büyüme nedeniyle azaltmak için gerek kalmadan analiz.

TN-Seq çalışmalar çoğu bakteriyel patojenler açıklandığı tarihe, insertional mutagenesis yüksek frekans enfeksiyon topluca her gen4 içinde birden çok yakından aralıklı transposon eklemeler olan mutantlar içeren büyük havuzlu izin ,12,13,14. TN-Seq da mutagenesis sıklığı çok düşük6olduğu bir bakteri için geliştirilmiştir. Leptospiraile Slamti ve ark15tarafından açıklandığı gibi konjugasyon tarafından transposon mobilizable plazmid olarak tanıtarak bir kütüphane transposon mutant oluşturulabilir. Ancak, transposon mutagenesis, L. interrogans sıklığı düşüktür. Himar1 transposon üzerinde Konjügatif bir plazmid tanıttığında, transconjugant frekans sadece 8,5 x 10-8 alıcı başına L. interrogans16 Lai gerilme ile hücre ve olması muhtemeldir olduğu bildirildi L. interrogansçoğu suşları ile benzer şekilde zavallı. Burada açıklanan transposon insertional mutagenesis sıklığı da düşük6olduğu Borrelia burgdorferiiçin geliştirilen temel bölümünde iletişim kuralıdır.

Bizim pilot için protokol17ile biz transposon mutagenesis L. interrogans serotip Manilae gerilme L495 ile transposon ekleme mutant suşu ile birlikte onun düşük içinde izole başarısı, diğer grupların nedeniyle deney LD50 (öldürücü doz) virülans1. Tn-Seq 42 mutantlar ekranlı ve birkaç mutant aday virülans iki eklemeler ile bir aday adenilat cyclase gene de dahil olmak üzere, kusurlu teşhis etti. Hamster iki mutantların bireysel test onların virülans17‘ eksik olduğunu doğruladı.

Protocol

Dikkat: Patojen Leptospira spp. suşlarının seviye 2 (BSL-2) koruma prosedürleri altında ele alınması gerekir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takılmalıdır. Sınıf II Biyogüvenlik kabini patojenik Leptospira spp. tüm manipülasyonlar için kullanılmalıdır 1. Transposon Yaratılış Mutant Kütüphane15 Transposon transfer Leptospira spp. konjugasyon tarafından içine (<strong class="xf…

Representative Results

L. interrogans içinde transposon mutantlardan konjugasyon Kütüphanesi oluşturulması filtrasyon ünitesi, şekil 1′ de gösterildiği gibi gerektirir. Biz 100-200 transconjugants her çiftleşme kurtarıldı. Transposon ekleme site her mutant transposon sonu hedefleyen yarı rastgele PCR tarafından oluşturulan PCR ürünü sıralama tarafından tanımlanır ve bitişik ev sahibi<sup c…

Discussion

Her ne kadar intraperitoneally 42 L. interrogans mutantlarla meydan hamster için bizim pilot deney sonuçlarından17sunulmaktadır, beklediğimiz mutantların büyük havuzları Tn-Seq. tarafından taranması Çünkü transconjugants sıklığı düşüktür (100-200 transconjugants/çiftleşme), birkaç matings mutantlar büyük Tn-Seq deneyler için yeterli sayıda oluşturmak gereklidir. Mutantlar sıvı kültürlerde çok sayıda Bakımı ele alınması gereken lojistik sorunlar suna…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser bir gazileri işleri Başarı Ödülü (için D.A.H.) tarafından desteklenen ve bir Ulusal Sağlık Enstitüsü (D.A.H.) R01 AI 034431 verin.

Materials

Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Play Video

Cite This Article
Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

View Video