Summary

Høj overførselshastighed parallelle sekvensering til foranstaltning Fitness af Leptospira interrogans Transposon indsættelse mutanter under Golden syriske Hamster infektion

Published: December 18, 2017
doi:

Summary

Vi beskriver her en teknik, der kombinerer transposon mutagenese med høj overførselshastighed sekvensering til at identificere og kvantificere transposon leptospiral mutanter i væv efter en udfordring af hamstere. Denne protokol kan bruges til skærm mutanter for overlevelse og udbredelse i dyr og kan også anvendes til in vitro- undersøgelser.

Abstract

I dette manuskript beskriver vi en transposon sekventering (Tn-Seq) teknik for at identificere og kvantificere Leptospira interrogans mutanter ændret i fitness under infektion af Golden syriske hamstere. TN-Seq kombinerer tilfældige transposon mutagenese med magt af høj overførselshastighed sekventering teknologi. Dyr bliver udfordret med en pulje af transposon mutanter (input pool), efterfulgt af høst af blod og væv et par dage senere for at identificere og kvantificere antallet af mutanter i hvert organ (output pools). Output pools er i forhold til de input pool at vurdere hver enkelt mutant i vivo egnethed. Denne tilgang gør det muligt for screening af en stor pulje af mutanter i et begrænset antal dyr. Med mindre ændringer, kan denne protokol udføres med en dyremodel for leptospirose, reservoir vært modeller som rotter og akut infektion modeller såsom hamsters, såvel som in vitro- undersøgelser. TN-Seq giver en kraftfuld værktøj til skærmen for mutanter i vivo og in vitro- fitness defekter.

Introduction

Identifikation af virulens gener for nogle bakterier, som Leptospira spp., er vanskelig på grund af det begrænsede antal genetiske værktøjer til rådighed. En almindeligt anvendt metode er oprettelsen af en samling af mutanter af tilfældige transposon mutagenese efterfulgt af identifikation af indsættelsesstedet i hver mutant og virulens afprøvning af individuelle transposon mutanter i en dyremodel. Denne tilgang er tidskrævende, dyrt og kræver et stort antal dyr.

Når tilfældig mutagenese blev først udviklet for patogenet Leptospira interrogans, blev gener involveret i virulens identificeret ved at teste individuelle mutanter i en dyremodel1. Mutanter blev udvalgt på grundlag af kriterier såsom deres potentielle roller i signalering eller motilitet forudsagte ydre membran eller overflade placering. Som fleste af leptospiral gener koder for hypotetiske proteiner af ukendt funktion2, vælge mutanter baseret på disse kriterier grænser evne til at opdage roman leptospiral virulens gener.

Mere nylig, puljer af L. interrogans transposon mutanter blev screenet for infektivitetsniveauet i hamster og mus modeller3. Hvert dyr blev udfordret med en pulje af op til 10 mutanter. Smitteevne af en mutant blev scoret som positiv, hvis det blev opdaget af PCR kulturer fremstillet af blod og nyrerne. PCR test var besværlige, fordi det krævede en individuel PCR reaktion til hver mutant i poolen. Da hyppigheden af hver mutant i kulturerne ikke var kvantificeres, var tilgangen forudindtaget mod identifikation af stærkt svækkede mutanter.

Vi beskriver en transposon sekventering (Tn-Seq) teknik, som en strategi til mere effektivt skærmen for virulens gener. TN-seq består af oprettelsen af et bibliotek af mutanter af transposon mutagenese efterfulgt af massive parallelle sekventering4,5,6. Kort, transposon mutanter er samlet, podes i dyr, og senere inddrives fra forskellige organer (output pools). DNA fra output puljer er udvundet og fordøjes med restriktionsenzymer eller forskydes ved hjælp af sonikering. To runder af PCR målretning knudepunkter af transposon indsættelse websteder er udført. Dette trin giver mulighed for tilsætning af de adaptere nødvendige for Sekventeringen. De resulterende PCR produkter analyseres af høj overførselshastighed sekvensering til at identificere webstedet transposon indsættelse af hver mutant pool sammen med deres relative forekomst, som er i forhold til den oprindelige sammensætning af puljen af mutant.

Den primære fordel ved denne tilgang er evnen til at samtidig skærm et stort antal mutanter med et lille antal dyr. TN-Seq kræver ikke forudgående kendskab til transposon indsættelse websteder som øger chancerne for at opdage nye Leptospira-specifikke gener involveret i virulens med mindre tid og større effektivitet. Fordi leptospiral byrde i væv er forholdsvis høj i gnavere modeller modtagelige for dødelig infektion (typisk 104 til 108 bakterier pr. g væv)7,8,9 så godt som i reservoiret værter 10,11, væv kan analyseres direkte uden at skulle kultur, reducere bias som følge af in vitro- vækst.

I Tn-FF. undersøgelser med de fleste bakterielle patogener beskrevet til dato, den høje frekvens af pattedyrsceller mutagenese tilladt infektion med store swimmingpools der indeholder mutanter kollektivt har flere nært afstand transposon indrykninger inden for hvert gen4 ,12,13,14. TN-Seq er også blevet udviklet til en bakterie som mutagenese frekvens er meget lavere6. Med Leptospira, kan et bibliotek af transposon mutanter genereres ved at indføre transposon på en kan mobiliseres plasmid af konjugation som beskrevet af Slamti al.15. Hyppigheden af transposon mutagenese af L. interrogans er dog lav. Når Himar1 transposon blev indført på et konjugering plasmid, blev transconjugant hyppighed rapporteret at være kun 8,5 x 10-8 pr. modtager celle med Lai stamme af L. interrogans16 og forventes at være tilsvarende fattige med de fleste andre stammer af L. interrogans. Protokollen beskrevet her er i en del baseret på udviklet til Borrelia burgdorferi, hvor hyppigheden af transposon pattedyrsceller mutagenese er også lav6.

For vores pilot eksperiment med protokol17gennemførte vi transposon mutagenese med L. interrogans serovar Manilae stamme L495 på grund af succesen med andre grupper i isolere transposon indsættelse mutanter i stammen, der sammen med sin lave LD50 (dødelig dosis) for virulens1. Vi screenet 42 mutanter af Tn-FF. og identificeret flere mutant kandidater defekt i virulens, herunder to med indsættelser i en kandidat adenylate cyclase genet. Individuelle test af de to mutanter i hamstere bekræftet at de var mangelfuld i virulens17.

Protocol

Forsigtig: Patogene stammer af Leptospira spp. skal behandles efter biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) indeslutning procedurer. Passende personlige værnemidler (PPE) skal bæres. En klasse II biosikkerhed kabinet skal bruges til alle manipulationer af patogene Leptospira spp. 1. oprettelsen af Transposon Mutant bibliotek15 Overførsel af transposon til Leptospira spp. af konjugation (figur …

Representative Results

Oprettelse af et bibliotek af transposon mutanter i L. interrogans af konjugation kræver en filtrering enhed, som vist i figur 1. Vi genvundet 100-200 transconjugants fra hver parring. Transposon indsættelsesstedet er identificeret i hver mutant ved sekventering af PCR produkt genereret af semi-tilfældigt PCR, som er rettet mod slutningen af transposon og tilstødende vært sekvenser<sup…

Discussion

Selv om resultaterne fra vores pilotprojekt for hamster udfordret intraperitoneal med 42 L. interrogans mutanter præsenteres17, forventer vi, at større puljer af mutanter kan blive screenet af Tn-FF. Da hyppigheden af transconjugants er lav (100-200 transconjugants/parring), flere parringer er nødvendige for at generere et tilstrækkeligt antal mutanter for store Tn-Seq eksperimenter. Opretholde et stort antal mutanter i flydende kulturer præsenterer logistiske udfordringer, der skal …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en veteraner anliggender Merit Award (til D.A.H.) og en National Institute of Health give R01 AI 034431 (D.A.H.).

Materials

Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Play Video

Cite This Article
Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

View Video