רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר
Summary
נתאר כאן טכניקה המשלבת מוטגנזה מכוונת transposon עם תפוקה גבוהה רצף כדי לזהות ולכמת transposon מוטציות leptospiral ברקמות לאחר אתגר של אוגרים. פרוטוקול זה יכול לשמש המוטנטים מסך עבור הישרדות והפצה בבעלי חיים, ניתן להחיל גם על מחקרים במבחנה .
Abstract
כתב יד זה, אנו מתארים transposon של רצף (Tn-Seq) טכניקה כדי לזהות ולכמת מוטציות Leptospira interrogans משתנה בכושר במהלך זיהום של אוגרים סוריים הזהב. Tn-Seq משלב מוטגנזה מכוונת transposon אקראיים עם הכוח של טכנולוגיה רצף תפוקה גבוהה. חיות מאותגרים עם בריכה של מוטציות transposon (בריכה קלט), ואחריו לקצירת של דם ורקמות כמה ימים מאוחר יותר כדי לזהות ולכמת את מספר מוטציות כל איבר (פלט בריכות). הבריכות פלט מושווים למאגר הקלט כדי להעריך את כושר ויוו של כל מוטציה. גישה זו מאפשרת הקרנת בריכה גדולה של מוטציות במספר מוגבל של בעלי חיים. עם שינויים מזעריים, פרוטוקול זה יכול להתבצע עם כל במודל חיה של לפטוספירוזיס, מאגר מודלים מארח כגון חולדות ומודלים זיהום אקוטי כמו אוגרים, כמו גם מחקרים במבחנה . Tn-Seq מספק כלי רב עוצמה למסך מוטנטים בעלי מומים כושר ב- vivo ו- in vitro לקשרי .
Introduction
זיהוי של גנים התקפה אלימה של חיידקים מסוימים, כגון Leptospira spp., קשה בגלל מספר מוגבל של גנטי הכלים הזמינים. גישה אחת נפוץ הוא יצירת אוסף של מוטציות על-ידי transposon אקראיים מוטגנזה מכוונת ואחריו הזיהוי של האתר הכניסה כל מוטציה ובדיקות התקפה אלימה של מוטציות transposon בודדים במודל חיה. גישה זו היא גוזלת זמן יקר, ודורש מספר גדול של בעלי חיים.
כאשר מוטגנזה מכוונת אקראי פותחה לראשונה על המחלה Leptospira interrogans, גנים המעורבים התקפה אלימה אותרו על-ידי בדיקת מוטציות בודדות המודל החייתי1. מוטציות נבחרו על סמך קריטריונים של תפקידיהם פוטנציאליים איתות או תנועתיות או שלהם החזוי הממברנה החיצונית או מיקום משטח. כמו ברוב חלקי leptospiral גנים קידוד חלבונים היפותטי של פונקציה לא מוכרות2, בחירת מוטציות בהתבסס על מגבלות קריטריונים אלה היכולת לגלות leptospiral הרומן גנים התקפה אלימה.
לאחרונה, בריכות של ל’ interrogans transposon מוטציות הוקרנו על infectivity של אוגר ועכבר מודלים3. כל בעל חיים היה אתגר עם בריכה של מוטציות עד 10. Infectivity של מוטציה היה הבקיע חיובי אם זה זוהה על ידי ה-PCR של תרבויות המתקבל דם וכליות. בדיקת PCR היה מפרך כי זה נדרש לתגובה PCR נפרדים עבור כל מוטציה בבריכה. בגלל התדירות של כל מוטציה בתרבויות לא הייתה לכמת, הגישה היה מוטה לטובת זיהוי של מוטציות הקלוש ביותר.
אנו מתארים transposon של רצף (Tn-Seq) טכניקה, כאסטרטגיה למסך בצורה יעילה יותר עבור גנים התקפה אלימה. Tn-seq מורכב היצירה של ספריה של מוטציות על ידי מוטגנזה מכוונת transposon ואחריו רצף מקביל מסיבי4,5,6. בקצרה, מוטציות transposon איחדו, מחוסן חיות, התאוששה מאוחר יותר איברים שונים (פלט בריכות). ה-DNA של הבריכות פלט חילוץ, מתעכל עם אנזימי הגבלה או לכסנתם על ידי sonication. שני סיבובים של PCR פילוח של צמתים של האתרים ההכנסה transposon מבוצעות. שלב זה מאפשר התוספת של מתאמים הצורך עבור הרצף. המוצרים PCR וכתוצאה מכך הם נותחו על ידי רצף תפוקה גבוהה לזיהוי האתר הכניסה transposon של כל מוטציה של הבריכה יחד עם שפע היחסי שלהם, אשר הוא לעומת ההרכב הראשוני של הבריכה של מוטציה.
היתרון העיקרי של גישה זו היא היכולת למסך בו זמנית מספר רב של מוטציות עם מספר קטן של בעלי חיים. Tn-Seq אינו דורש ידע מוקדם של האתרים ההכנסה transposon אשר מגדיל את הסיכויים של גילוי חדש Leptospira-גנים ספציפיים המעורבים התקפה אלימה עם פחות זמן ויעילות רבה יותר. כי נטל leptospiral ברקמות הוא גבוה יחסית מכרסם מודלים זיהום רגישים קטלני (בדרך כלל 104 108 חיידקים/גרם של רקמת)7,8,9 באותה מידה כמו מאגר המארחים 10,11, רקמות ניתן לנתח ישירות ללא צורך תרבות, צמצום הטיות עקב הצמיחה במבחנה .
במחקרים Tn-Seq עם רוב פתוגנים חיידקיים שתוארו עד כה, התדר של מוטגנזה מכוונת insertional מותרים זיהום עם בריכות גדולות המכיל מוטציות קולקטיבי שיש הוספות המרווחות מקרוב transposon מרובות בתוך כל ג’ין4 ,12,13,14. Tn-Seq גם פותחה עבור חיידק אשר תדירות מוטגנזה מכוונת היא נמוכה יותר,6. עם Leptospira, ספרייה של מוטציות transposon יכול להיווצר על ידי החדרת את transposon על פלסמיד mobilizable על-ידי ההטיה כפי שתואר על ידי Slamti et al15. עם זאת, התדירות של מוטגנזה מכוונת transposon של ל’ interrogans הוא נמוך. כאשר transposon Himar1 הוצג על פלסמיד conjugative, תדירות transconjugant דווחה רק 8.5 x 10-8 לכל נמען תא עם המתח לאי של ל’ interrogans16 , סביר להניח שתהיה מסכן באופן דומה עם רוב זנים אחרים של ל’ interrogans. פרוטוקול המתואר כאן הוא בחלקו מבוסס על שפותחה עבור Borrelia burgdorferi, שבו תדירות מוטגנזה מכוונת insertional transposon היא גם נמוכה6.
עבור שלנו פיילוט עם פרוטוקול ה-17, ערכנו מוטגנזה מכוונת transposon עם ל’ interrogans serovar Manilae זן L495 בגלל ההצלחה של קבוצות אחרות לבודד מוטציות ההכנסה transposon בנימה זו יחד עם שלה נמוך LD50 (מנה קטלנית) התקפה אלימה1. אנו מוקרן מוטציות 42 על ידי Tn-Seq, זיהו כמה מועמדים מוטציה פגומה בהתקפה אלימה, כולל שני עם הוספות בגן אדנילאט cyclase המועמד. בדיקה אישית של המוטציות שני באוגרים אישר כי הם היו בנכונותם התקפה אלימה17.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות תוצאות שלנו פיילוט עבור hamster תיגר intraperitoneally עם מוטציות ל’ interrogans 42 מוצגים17, אנו מצפים כי בריכות גדולות יותר של מוטציות יכולים להיות מוקרן על ידי Tn-תת סעיף. בגלל התדירות של transconjugants הוא נמוך (100-200 transconjugants/הזדווגות), מספר matings נחוצים ליצור מספר מספיק של מוטציות לניסויים Tn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס הצטיינות לענייני חיילים משוחררים (עד D.A.H.), המכון הלאומי לבריאות להעניק R01 AI 034431 (D.A.H.).
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
References
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
- Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
- Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
- Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
- Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
- Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
- Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
- Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
- Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
- Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
- Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
- Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
- Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
- Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
- Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
- Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
- McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
- Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
- Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
- Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
- Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).
