Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor gelijktijdige opname van co gelokaliseerde elektro-encefalografie (EEG) en multi-laminaire lokale veld potentieel in een narcose rat. Een burr gat geboord in de schedel voor het inbrengen van een micro-elektrode is aangetoond dat het te verwaarlozen vervorming van het EEG signaal veroorzaken.
Abstract
Hoewel elektro-encefalografie (EEG) veel als een niet-invasieve techniek gebruikt wordt voor het opnemen van neurale activiteiten van de hersenen, is ons begrip van de neurogenese van EEG nog steeds zeer beperkt. Lokale veld potentieel (LFPs) opgenomen via een multi-laminaire micro-elektrode kunnen bieden een meer gedetailleerde uiteenzetting van gelijktijdige neurale activiteit over verschillende corticale lagen in de neocortex, maar de techniek is invasief. Combineren van de EEG en LFP metingen in een preklinische model kan sterk verbeteren inzicht in de neurale mechanismen die betrokken zijn bij de generatie van EEG signalen, en vergemakkelijken van de afleiding van een realistischer en biologisch nauwkeurig wiskundig model van het EEG. Een eenvoudige procedure voor het verkrijgen van de gelijktijdige en co gelokaliseerde EEG en multi-laminaire LFP signalen in het narcose knaagdier is hier gepresenteerd. We onderzochten ook of EEG signalen waren sterk beïnvloed door een burr gat geboord in de schedel voor het inbrengen van een micro-elektrode. Onze resultaten suggereren dat het burr gat een te verwaarlozen effect op EEG opnames heeft.
Introduction
Het is algemeen aanvaard dat LFPs geregistreerd via microelectrodes voornamelijk de gewogen som van gesynchroniseerde excitatory en remmende synaptic activiteiten voor plaatselijke piramidale neurale bevolking1,2,3 weerspiegelen , 4. onze recente onderzoek aangetoond dat het profiel van de LFP signaal kan worden gescheiden in onderdelen van excitatie en inhibitie5,6. Echter zoals LFP normaliter via een invasieve procedure gemeten is, is het niet geschikt voor de meeste studies van het menselijk brein.
Aan de andere kant, de EEG is een niet-invasieve techniek voor het meten van de elektrische activiteit van de hersenen. Het wordt wijd gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma voor bepaalde soorten neurologische ziekten zoals epilepsie, en als een onderzoeksinstrument in menselijke cognitieve studies. Ondanks zijn populariteit is een belangrijk minpunt van een EEG het onvermogen om te interpreteren zijn tijdelijke profielen juist op het gebied van de onderliggende neurale signalen7,8,-9.
Steeds vaker worden wiskundige modellen van de EEG ontwikkeld om het inzicht van hersenen functie10,11,12,13,14,15te vergroten. Meeste van de bestaande modellen van de EEG zijn ontwikkeld op basis van de frequentie-domein kenmerken van het model voorspelde output naar de EEG gegevens spectrum tijdens spontane activiteit passen, en zeer weinig EEG modellen realistische sensory evoked potentials kunnen genereren. In dit verband biedt gelijktijdige opnamen van EEG en LFP belangrijk inzicht en beperkingen voor het ontwikkelen van meer accurate wiskundige modellen van de EEG.
Om aan deze behoefte voor gelijktijdige opnamen de neurale oorsprong van EEG verder te verkennen, ontwikkelden we een methode om tegelijkertijd opnemen EEG en multi-laminaire LFP signalen in de neocortex van de narcose rat. De opzet is vergelijkbaar met vorige gelijktijdige EEG/LFP uitgevoerde studies in primaten16,17. We verder onderzocht het effect van een burr gat geboord in de schedel op EEG opnames rond het gat, door het vergelijken van bilaterale EEG opnamen (dat wil zeggen, een halfrond met een burr gat, het andere halfrond intact) bij gebrek aan zintuiglijke stimulatie. Onze resultaten tonen aan dat gelijktijdige EEG/LFP opnames eenvoudig en effectief, kunnen worden uitgevoerd met weinig EEG signaalvervorming uit het burr gat in de schedel.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de bepalingen van het Britse Bureau van het huis (dieren (wetenschappelijke Procedures) Act, 1986) en goedgekeurd door de ethische commissie van onderzoek aan de Universiteit van Reading, UK.
1. dierlijke voorbereiding
Opmerking: Vrouwelijke Lister Hooded ratten werden gebruikt voor alle experimenten. Dit is een niet-survival-procedure.
- Opnemen van de rat gewicht op de laboratoriumschaal van een.
- Anesthetize de rat in een kamer met 5% Isofluraan en een zuurstof-debiet van 1 L/min.
- Plaats de rat op een stereotaxic houder met een papieren handdoek onderaan haar lichaam en haar tanden rusten via de balk beet... De papieren handdoek zal de invoeging van een warmte-pad gemakkelijker te maken (zie stap 2.3) en eventuele uitwerpselen van ratten te vangen tijdens het experiment.
- Isofluraan continu via een hard-plastic neus kegel gemonteerd op de neus klem voor rat-adapter met een concentratie van 3% met een debiet van de zuurstof van 0.5 L/min. verbinden de kegel naar een kleine dierlijke Isofluraan verdoving systeem beheren.
2. de chirurgische Procedure
- Invoegen van een thermostatische verwarming pad onder de papieren handdoek waarop de rat is rust, de rat's hoofd met twee bars van het oor veilig en controleren van de lichaamstemperatuur met behulp van een rectale thermometer.
- De top van de rat's hoofd te scheren.
- Ophthalmic zalf toepassen op de ogen om te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies.
- Voordat de schedel bloot, lidocaïne druppels van toepassing op de hoofdhuid en masseer het zachtjes in de huid.
- Maak een insnijding van de middellijn van ongeveer 2-3 cm op de hoofdhuid met behulp van een scalpel bloot van de oppervlakte van de schedel.
- Scheid zorgvuldig de temporalis spier contra-laterale naar de Bakkebaard pad worden gestimuleerd van de schedel met behulp van een Jacquette Scaler en een paar getand en gebogen ontleden pincet. Reinig de schedel met katoenen wissers wanneer dat nodig is.
- Met behulp van een gevlochten zijde, niet-absorbeerbare hechtdraad, binden de gescheiden spier op de hoofdhuid met een strakke knoop en vervolgens het binden van de hechtdraad veilig aan de stereotaxic frame18.
- Ga stereotaxic coördinaten naar het vat cortex, 2.5 mm caudal aan bregma en 6 mm lateraal middellijn19. Teken een stip op de locatie van de Somatosensorische cortex die met behulp van een potlood of een marker.
-
Boor een burr gat op de gemarkeerde locatie met behulp van een tandheelkundige boor. Toepassen om te verhinderen dat de schedel oververhitting tijdens het boren, steriele zoutoplossing (natriumchloride 0,9%) op het werkgebied elke 10-15-s. Het boren proces omvat de volgende 3 stappen:
- Boor een gat van diameter < 2 mm in de schedel met behulp van een boor #4 (0.055 in diameter). Wees voorzichtig niet te boren in de dura.
- Dun onderin het gat naar translucentie met behulp van een boor #1/4 (0.019 in diameter).
- Gebruik een 27 G naald te doorboren de dura zodat de invoeging van een micro-elektrode.
- Overdracht de rat, beveiligd en opgeslagen op een stereotaxic frame, een kooi van Faraday die zich bovenop een vibratie isolatie werkstation.
- Hechten van een oximeter sensor klem aangesloten op een oximeter controle-eenheid naar de achterste poot van de rat te controleren voortdurend de volgende fysiologische parameters: hartslag, adem tarief, arteriële zuurstof saturatie, pulse distentie en adem distentie. Deze parameters werden voortdurend op een PC-monitor, als gevolg van de fysiologische toestand en verdovend diepte van de rat getoond.
- Vervangen van de hard-plastic neus kegel voor Isofluraan administratie en de neus klem voor rat-adapter met een adempauze van de microflex voorzien van een transparante zachte neus kegel die is gewijzigd (figuur 1A) zodat gemakkelijk friemeltje stimulatie aan de ene kant van de Bakkebaard zeem zonder afbreuk te doen aan de Isofluraan administratie.
- Plaats twee RVS stimulerende elektroden voor het pad van de Bakkebaard blootgesteld door de uitsparing op de neus.
- De stimulerende elektroden aansluit op een geïsoleerde huidige stimulator.
- Til de huid van de middellijn van de nek met een tang en maken een 1 ~ 2 cm ingesneden met een schaar klaar voor de plaatsing van de referentie-elektroden. Wees voorzichtig niet te snijden het spierweefsel.
3. mede gelokaliseerde EEG/LFP Setup
- Schoon en droog de schedel rondom het burr gat met behulp van een wattenstaafje.
- Zorgvuldig plaats de geleidende EEG plakken op een platte kant van een EEG-spin-elektrode. Laat een klein gaatje vrij is van de EEG plakken op de spin elektrode dat een multi-laminaire micro-elektrode geschiedde door het gat zonder contact met de pasta en de spin-elektrode. Hiermee voorkomt u dat elektrisch contact tussen de elektrode van de EEG en de micro-elektrode.
- Sluiten de spin elektrode naar de burr gat in de schedel, bij het plakken van de EEG geconfronteerd met de schedel.
- Druk zorgvuldig op de elektrode van de spin op de schedel, waardoor stevig contact met de schedel via de EEG plakken. Verwijder eventuele plakken verduistert het burr gat met behulp van een naald op een spuit.
- Verwijder overmatige EEG plakken buiten de periferie van de spin-elektrode zodat het contact tussen de elektrode van de spin en de schedel ruimtelijk tot de grootte van de elektrode (figuur 1B beperkt is).
Figuur 1: Algemene setup voor gelijktijdige opname van de EEG/LFP. (A) de opstelling bestaat uit een gemodificeerde neus kegel voor gebruiksgemak friemeltje pad stimulatie onder Isofluraan verdoving, twee stimulerende elektroden ingevoegd in de Bakkebaard pad, een spin elektrode geplaatst op de schedel boven het vat cortex contra-laterale aan de stimulerende elektroden, een multi-kanaals micro-elektrode ingevoegd in de cortex vat door middel van de spin elektrode en referentie-elektroden geplaatst binnen een incisie aan de achterkant van de nek van de rat. (B) een beeld door middel van de Microscoop van de elektrode van de spin veilig door EEG plakken op de schedel geplaatst. De micro-elektrode wordt ingevoegd in een burr gat geboord in de schedel onder de spin-elektrode. De hoofdhuid is tegengehouden door chirurgische thread (Sutuur) gebonden aan het stereotaxic frame. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Uitstrijkje EEG plakken op de referentie-elektrode voor het EEG en plaats het veilig binnen de incisie aan de achterkant van de nek van de rat.
- De EEG elektroden aansluit op de voorversterker via een passieve signaalsplitter voor lage impedantie signalen (Figuur 2). Zorg ervoor dat de impedantie van de spin-elektrode lager is dan 5 kΩ. Als het niet het geval is, Controleer dat de EEG-pasta in goed contact met de schedel is en de elektrode stevig is ingedrukt om de EEG-pasta. Voeg indien nodig meer EEG plakken toe.
- Monteer de arm van een micromanipulator op het stereotaxic frame. Een lineaire micro-elektrode van 16-kanaals (100 µm afstand, ruimte van elke site 177 µm2) verbinden met een 16-kanaals acute headstage afgekapt veilig op de arm van de micromanipulator.
- Uitstrijkje EEG plakt in het referentie-elektroden voor de EEG en de micro-elektrode, dan plaatst u ze veilig binnen de incisie (figuur 1A).
- De hoek van de micromanipulator arm zodanig aanpassen dat de micro-elektrode loodrecht op de corticale oppervlak is. Deze hoek is normaal tussen 25-35 °.
- De micro-elektrode onder een Microscoop verlagen door te draaien aan de knoppen van de micromanipulator zodat het uiteinde van de micro-elektrode is gericht op de kleine opening aan de onderkant van het burr gat totdat de bovenste elektrode gewoon dringt door in de corticale oppervlak. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de micro-elektrode op het oppervlak van de dura dwingen als dit de elektrode breken zou.
- Koppel de 16-kanaals micro-elektrode met een voorversterker aangesloten op een gegevenseenheid verwerving via een optische glasvezelkabel (Figuur 2).
- Zet de voorversterker, de verwerving van de gegevenseenheid, en de computer is verbonden met de eenheid. Schakel in het vak stimulator.
- De micro-elektrode normaal naar de corticale oppervlakte door langzaam verandert de knop van de z-as van de micromanipulator tot een diepte van 1.500 µm20invoegen
- Micro-Stel de diepte door toepassing van een trein van stimulus aan de Bakkebaard pad en observeren van de 16-kanaals evoked LFP op een monitor van de PC met behulp van de software van de overname gegevenseenheid op de PC zijn geïnstalleerd. Zorgvuldig draai de z-as-knop op de micromanipulator totdat de hoogste amplitude van de evoked LFP rond kanaal 7 optreedt (zoals dit met laag IV in de cortex samenvalt).
Opmerking: Ipsi-laterale EEG elektrode setup: voor sommige experimenten, werd een tweede spider-elektrode geplaatst aan de ipsi-laterale kant van de intact schedel boven de cortex van het vat. Deze opstelling toegestaan bilaterale EEG opname in de rusttoestand te onderzoeken van het effect van het burr gat op het EEG signaal.
Opmerking: De chirurgische procedure voor het instellen van de EEG-elektrode is identiek aan die hierboven beschreven, behalve dat tijdens stap 2.6, de musculus temporalis aan elke kant van het hoofd was zorgvuldig gescheiden van de schedel, ingehecht terug en veilig aan de overeenkomstige kant van gebonden het stereotaxic frame.
Opmerking: De gelijktijdige EEG/LFP setup is ook identiek aan die hierboven beschreven, met een extra stap dat een tweede spider-elektrode is geladen met de EEG-pasta, dan stevig op de schedel boven de cortex ipsi-laterale vat drukt.
Figuur 2. Een stroomschema signaal. De rat wordt geplaatst in een kooi van Faraday. De elektroden van de stimulerende ontvangen opdrachten in het vak van de stimulator gecontroleerd door de Data acquisitie-Unit door middel van haar software geïnstalleerd op een PC. De neurale signaal opgenomen door de micro-elektrode wordt doorgegeven aan een voorversterker binnen de kooi van Faraday. De neurale signaal opgenomen door de EEG sonde wordt doorgegeven aan de voorversterker via een signaalsplitter. De voorversterker is verbonden met de Data-acquisitie-Unit buiten de kooi van Faraday via een optische glasvezelkabel. De neurale gegevens worden vervolgens opgeslagen op een lokaal station op de PC, terwijl ze kunnen ook worden weergegeven op een PC-monitor. Een mobiele kleine dierlijke Isofluraan systeem beheert Isofluraan van buiten de kooi van Faraday. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. elektrische stimulatie en neurale opnames
Opmerking: De bemonsteringsfrequentie voor alle neurale gegevens is 24.41 kHz met 16-bit resolutie. Een proces bestaat uit een enkele elektrische stimulatie aan het begin van de proef. Elk proces duurt 10-s, die ook de onderlinge stimulans interval (ISI). Elke stimulans is een vierkant huidige puls van 1,2 mA duurzame 0.3 ms. voor bilaterale experimenten te bestuderen van het effect van het burr gat, continue staat van 250 rusten s ook is vastgelegd.
- Open de opname-software op de computer in gebruik.
- Laad het juiste circuit voor het experiment door het selecteren van 'Load Project...' uit het dropdown menu van 'OpenProject'. Een nieuw venster ('WorkBench') verschijnt (Figuur 3).
Figuur 3. Een weergave van de GUI-software voor de Data acquisitie apparaat Het staat de juiste circuit te uploaden, stimulatie parameters worden ingesteld en gegevens worden geregistreerd en gevisualiseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Maak een nieuwe map (genoemd een 'Tank' door de software) om op te slaan van neurale opnames.
- Klik op 'Bestand' vanaf de bovenkant van het venster en selecteer 'Gegevens Task Management'. Er verschijnt een nieuw venster ('Tank-beheer').
- Druk op de rechterknop van de muis om een menu weer te geven in het venster 'Tank Management'. Selecteer 'Maak nieuwe Tank'. Een ander nieuw venster ('maken gegevens Tank') wordt weergegeven.
- In het venster 'Maken gegevens Tank' Selecteer het pad waar u van plan bent een nieuwe gegevensmap maken en typ de naam van de nieuwe map. Druk op 'OK'. Dit venster zal verdwijnen.
- De nieuwe map verschijnt in het venster 'Tank Management' maar in het grijs. Registreer deze map door met de rechtermuisknop op het, en selecteer 'Registreren Tank' uit het dropdownmenu. Een rode ster en een groene pijl verschijnt links van de naam van de nieuwe map die nu in het zwart (Figuur 4).
- Unregister vorige mappen niet in gebruik met de rechtermuisknop in het venster 'Tank Management' en 'Tank-lijst vernieuwen' selecteren in het dropdownmenu.
- Klik op 'OK' om de 'Tank Management'-venster te sluiten.
Figuur 4: een weergave van de software GUI tonen een geregistreerde gegevensmap. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Registreer de nieuwe map in 'Toepassingsgebied' weer te geven van de neurale signalen tijdens experiment.
- Klik op het pictogram 'Toepassingsgebied' in het venster 'OpenProject'. Er verschijnt een nieuw venster ('toepassingsgebied').
- Rechts klikken met de muis in het venster 'Toepassingsgebied' en selecteer 'Tank-lijst vernieuwen' in het dropdownmenu. Naam van de nieuwe map verschijnt in het grijs.
- Klik op de nieuwe map. Een rode ster en een groene pijl verschijnt links van de naam van de nieuwe map die nu in het zwart.
- De experimentele parameters voor data-acquisitie in de "WorkBench" venster instellen door te klikken op 'Setup' vanaf de bovenkant van het venster. Een nieuw venster zal verschijnen. Selecteer 'Sweep lus', stelt u de lengte van de proef en het aantal proeven moeten worden opgenomen.
- Controleer of het vak Stimulator is ingeschakeld.
- Druk op de knop 'Opnemen' in het venster 'WorkBench'. Een nieuw venster zal verschijnen. Typ de naam van het gegevensbestand dat u wilt opslaan voor de experimentele uitvoeren maar niet geraakt de toets return in dit stadium, als het EEG opname parameters moeten worden ingesteld.
-
Instellen van de EEG opnameparameters met behulp van de grafische User Interface (GUI) op de voorversterker. Raak het scherm (overal) van de voorversterker wakker van het scherm. Selecteer 'Unlock' om te ontgrendelen van het scherm (Figuur 5).
- Druk op de linker icoon in de ' 2: EEG' Configuratiescherm. Een nieuwe display wordt weergegeven.
- Druk op 'Koppeling' en selecteer 'AC'.
- Druk op 'Ref Mode' en selecteer van 'Local'.
- Druk op 'Samp Rate' en selecteer ' 25 KHz'.
- Druk op 'OK' om terug te keren naar de oorspronkelijke weergave.
Figuur 5: The GUI op de voorversterker. Hierdoor EEG opname parameters (bijvoorbeeld, bemonsteringsfrequentie en verwijzende voorkeur) worden ingesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- De impedantie van het EEG-probe(s) controleren door te drukken op het middelste pictogram in de ' 2: EEG' Configuratiescherm. Als te hoog, meer EEG plakken aan de sonde toevoegen. Druk op 'OK' om terug te keren naar de oorspronkelijke weergave.
- Wacht 20 s om te voorkomen dat de opname van de eerste schommelingen van de EEG-opnamen.
- Ga terug naar de PC-monitor (na de 20 s wachttijd) en druk op de 'Enter'-toets op het toetsenbord. De EEG en de LFP signalen zal worden opgenomen.
5. de gegevensanalyse
-
Vooraf verwerken de evoked LFP en EEG signalen op basis van trial-door-proces met behulp van de volgende stappen uit.
- Verschuiving terug de neurale gegevens tijdig door 20 monsters (equivalent aan 0.82 ms). Dit is de vertraging die is geproduceerd door het circuit gebruikt voor het verzamelen van gegevens van de neurale in TDT zelf. Door het verschuiven van de gegevens, wordt het tijdstip nul uitgelijnd met het begin van de stimulus.
- Verwijderen van de stimulus-artefact door vervanging van de neurale gegevens van 0 naar 1 ms met een rechte lijn tussen de gegevens wijzen op 0 ms met het gegevenspunt op 1 ms.
- Nul-gemiddelde elk afzonderlijk experiment door de gemiddelde waarde van de neurale signaal 200 ms voorafgaand aan het begin van de prikkel af te trekken.
- Low pass filter de gegevens onder 800 Hz met behulp van een 4th orde Butterworth IIR type filter in beide richtingen om te voorkomen dat de invoering van een tijdelijke verschuiving in de gegevens.
- De multi-laminaire gegevens uitlijnen over dieren. Voor elk dier de LFP gegevens, gelden de inverse huidige bron dichtheid (spline iCSD, bron straal R = 0,5 mm) analyse21 met een Gaussiaans filter (λ = 50 µm) te vinden van de laag zinken IV1, die wordt gegeven door de grootste negatieve piek die zich op een corticale diepte onder het pial oppervlak binnen de eerste 15 ms stimulans verschijnselen. De CSD, en de bijbehorende LFP, gegevens worden vervolgens uitgelijnd volgens hun wastafel locaties over dieren. De gemeenschappelijke wastafel bevindt zich in de laag IV, ~ 600 µm onder het pial oppervlak.
- Na uitlijning, gebruik kanalen 2, 7 en 12 van de verlegde LFP als vertegenwoordigers van neurale reacties van de supragranular, korrelig, en infragranular lagen, respectievelijk in de cortex van het vat.
- Bereken dat het gemiddelde LFP en EEG opgeroepen door gemiddeld de voorbewerkte gegevens over 100 proeven.
- Om te onderzoeken van het effect van het burr gat op het EEG, signalen down-monster de EEG tot 1.000 Hz en berekenen de spectrale vermogensdichtheid (PSD) voor de contra-laterale (met een gat in de schedel) en ipsi-laterale (intact schedel) spider elektrode opnames periode een 250 s van rust staat. PSD is berekend op basis van 0.1-100 Hz in Matlab met behulp van de functie 'pmtm', die is gebaseerd op de multitaper methode22.
- Het frequentiebereik verdelen in de volgende bekende frequentiebanden: Delta (δ): 0.1-4 Hz, Theta (): 4-8 Hz, Alpha (α): 8-13 Hz, Beta (β): 13-31 Hz, Gamma (γ): 31-100 Hz. Bereken de gemiddelde PSD binnen elke band.
- Binnen elke frequentieband, het genormaliseerde verschil in PSD, Perr, tussen de contra- en de ipsi-laterale EEG met behulp van de vergelijking te berekenen:
waar Pc en Pik de gemiddelde PSD van de contra - en ipsi-laterale EEG, respectievelijk in de frequentieband van belang zijn. - Binnen elke frequentieband, uitvoeren van een one-sample t-test om te testen van de hypothese dat er is geen significant verschil (op het significantieniveau 0,05) tussen de PSD van het EEG signaal opgenomen van de twee hemisferen.
Representative Results
Gegevens uit 4 ratten werden gemiddeld om te verkrijgen van gemiddelde tijdreeksen, indien van toepassing. De amplitude van de evoked respons van de EEG, ook bekend als de gebeurtenis gerelateerde potentieel (ERP), is meestal veel kleiner dan die van de LFP. Figuur 6 toont de gemiddelde ERP en de LFP in de supragranular, korrelig, en de infragranular lagen van de cortex van het vat, respectievelijk. De band van de fout in ieder waarnemingspunt is de overeenkomstige standaardfout. Het kan gezien worden dat ERP ongeveer 10 keer kleiner dan de evoked LFP is.
Figuur 6: betekenen (n = 4) neurale signalen van ERP, supragranular, korrelig, en infragranular LFP. Schaduw geeft aan standaardfout. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Vergelijkingen van de temporele dynamiek van ERP en LFP worden weergegeven in Figuur 7. Directe superpositie van ERP en de supragranular LFP in figuur 7A illustreert de volgorde van de amplitude verschillen tussen deze twee soorten neurale signalen. Om te vergelijken het temporal dynamics, worden ERP zowel LFP genormaliseerd ten opzichte van hun negatieve maximale amplitude. Figuur 7B en 7 C Toon dat de genormaliseerde ERP bovenop met de genormaliseerde supragranular LFP en genormaliseerde granulaire LFP, respectievelijk.
Het kan worden afgeleid uit figuur 7B dat de pieken van P1 en N1 voor ERP meer vertraagd dan de overeenkomstige pieken van LFP in de supragranular laag zijn. Echter, de stoffelijke profielen van deze twee neurale signalen zijn gelijkaardig, met de P1 voorafgaand aan N1. Aan de andere kant, het tijdelijke profiel van ERP is duidelijk verschillend van die van de granulaire (laag IV van de cortex vat) LFP (Figuur 7 c). Ze zijn vooral niet spiegelbeelden van elkaar, met granulaire LFP gedomineerd door een enkele negatieve piek (als gevolg van een grote wastafel in corticale laag IV), overwegende dat ERP bestond voornamelijk uit twee pieken met tegenovergestelde polariteit.
Figuur 7: vergelijking van de temporele dynamiek van ERP en LFP. (A) ERP (vaste lijn) bovenop met supragranular LFP (gestippelde lijn). Schaduw geeft aan standaardfout. (B) genormaliseerd ERP (vaste lijn) bovenop met genormaliseerde supragranular LFP (gestippelde lijn). (C) genormaliseerd ERP (vaste lijn) bovenop met genormaliseerde granulaire LFP (gestippelde lijn). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Het ERP-signaal werd gemeten via een spin elektrode geplaatst op de schedel met een burr gat erin geboord. Om te onderzoeken van het effect van het gat op EEG opnamen, werd een andere spin elektrode geplaatst op de intact schedel boven de cortex ipsi-laterale vat. Zorg is genomen om ervoor te zorgen dat de impedances van de twee spider-elektroden vergelijkbaar in grootte waren door het aanpassen van de hoeveelheid EEG plakken gebruikt. Gegevens uit vier ratten (die waren niet de dezelfde ratten gebruikt hierboven) worden hier gepresenteerd.
Figuur 8 toont de gelijktijdige rust staat EEG opnames van beide elektroden van een rat, met 100 s gegevens weergegeven in figuur 8A, en de gegevens in het rechthoekig frame (20 s) worden uitgevouwen in Figuur 8. De twee signalen van de EEG variëren grotendeels mede, soortgelijke gasgroep van amplitude. Figuur 9 toont de PSD van de vier rats, met de bovenste rij met behulp van een lineaire schaal op de as van de frequentie, en de onderste rij met behulp van een logaritmische schaal op de as van de frequentie waarmee een uitgebreide weergave in het onderste frequentiebereik. Uit Figuur 9lijkt er niet te zijn van consistent bias in de PSD over onderwerpen. Dit werd bevestigd door one-sample t-tests uit te voeren op de genormaliseerde verschillen in de gemiddelde PSD in de vijf frequentiebanden, weergegeven in Figuur 10. Geen van de genormaliseerde PSD verschillen in deze frequentiebanden waren beduidend verschillend van nul (p = 0.32, 0,46 0,85, 0,69 en 0.97, respectievelijk).
Figuur 8: bilaterale EEG opnames. (A) schedel EEG opname tijdens rust staat met een burr gat in de schedel (zwart) en een gelijktijdige EEG opname op het tegenovergestelde halfrond met de schedel intact (grijs). (B) Expanded bekijken van de golfvormen binnen het rechthoekig frame in (A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: macht van spectrale dichtheid (PSD) van de contra-(blauw) en de EEG ipsi-laterale (rood). Elke kolom bevat de richtlijn betalingsdiensten voor een rat. De bovenste panelen gebruiken lineaire frequentie schaal, terwijl de onderste panelen frequentie logaritmische schaal gebruiken wilt toestaan de PSD in het onderste frequentiebereik worden gevisualiseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: groep analyse. Verschil tussen de contra- en de PSD ipsi-laterale met de vijf frequentiebanden genormaliseerd: Delta, Theta, Alpha, bèta en Gamma. Elke staaf toont de gemiddelde genormaliseerde verschillen binnen de frequentieband, met de standaardfout weergegeven als de foutbalk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Wij hebben beschreven een experimentele procedure voor gelijktijdige opname van co gelokaliseerde EEG en LFP signalen voor een rat Isofluraan narcose in reactie op friemeltje pad stimulatie. Een micro-elektrode werd in de neocortex door een opening in de EEG spin elektrode die is afgestemd op een burr gat geboord in de schedel opgenomen. De elektrode aan de schedel werd vastgezet door een geleidende en lijm EEG plak23. De neus kegel gebruikt voor het beheer van Isofluraan is bewerkt zodat stimuleren elektroden kan worden ingevoegd in de Bakkebaard pad met gemak.
De EEG-pasta was effectief bij montage van de spin-elektrode veilig op de schedel, terwijl het verstrekken van uitstekende elektrische geleidbaarheid experimentele overdag zonder de noodzaak van aanvullende toepassing van plakken. Het verving het ongewenst gebruik van lijmen op het monteren van de periferie van de elektrode van de spin op de schedel, zoals lijm niet-geleidend is en de impedantie van de elektrode te verhogen kan als het loopt tussen de schedel en de elektrode. EEG plakken heeft een aantal voordelen ten opzichte van de EEG gel, die moeilijk aan shape rond de burr gat en tijdens het experiment, resulterend in slechte EEG signalen kunnen uitdrogen.
Zoals de rat werd geplaatst in een kooi van Faraday, werd elektrische ruis te wijten aan het milieu sterk verzwakt. Soms was het neurale signaal echter nog steeds behoorlijk luidruchtig. In de meeste gevallen werd dit veroorzaakt door de referentie-elektrode niet goed gepositioneerd en daarom moest worden opnieuw aangepast of meer EEG plakken gebruikt. Een ander algemeen probleem was dat de opgeroepen LFP kleine in amplitude. Dit kan te wijten zijn aan de micro-elektrode niet gepositioneerd in het midden van de corticale regio geactiveerd door de stimulerende elektroden. In plaats van opnieuw invoegen van de micro-elektrode, waardoor meer schade aan de lokale neuronen, we meestal aangepast de positie van de elektroden van de stimulerende in de Bakkebaard pad tot een redelijke amplitude van de LFP (> 3 mV) kon worden waargenomen.
Een van de beperkingen van de techniek is de slechte ruimtelijke resolutie van de spin-elektrode, die een diameter van 6 mm heeft. Dit is groot in vergelijking met de grootte van de rat's schedel. Helaas is de elektrode van de spin gebruikt hier de kleinste beschikbaar om te kopen. Het is wenselijk om de diameter van de spin-elektrode tot 2-4 mm, waardoor de ruimtelijke specificiteit van EEG opnamen, maken de vergelijking tussen het EEG signaal en de supragranular LFP signaal minder dubbelzinnig.
Verschillende kritische stappen in het protocol hebben speciale aandacht nodig. De eerste is het inbrengen van de micro-elektrode door het burr gat. Zoals de dura anders intact is, de precisie van de invoegpositie is van cruciaal belang. Een lichte weerstand op het puntje van de elektrode betekent meestal dat de elektrode niet correct gepositioneerd is. Het moet worden verhoogd, positie aangepast en opnieuw ingevoegd. De tweede is de positie van de neus op de rat. Het moet niet te los, zoals Isofluraan van de kegel ontsnappen zal. Het moet ook niet te strak, als dit kan de neusgaten van de rat belemmeren en ademhalingsproblemen veroorzaken. Speciale aandacht is ook nodig om ervoor te zorgen dat de amplitude van de EEG opname veel kleiner is (meestal 5 tot 10 keer kleiner) dan de LFP bovenste kanaal opname. Als ze op elkaar lijken, is het een indicatie dat de EEG-sonde tot direct of indirect contact met de micro-elektrode gekomen. Een indirecte contact is meestal door middel van de cerebrale spinale vloeistof (CSF), die soms het gat vult geboord in de schedel. De geleidbaarheid van CB is meestal 100 maal die van de schedel24,25. Dus, als het niveau van CB binnen het burr gat voldoende hoog is, kan het maken contact met de spin-elektrode. Om dit te vermijden, moet het gat vaak worden gereinigd met super absorberende katoenen sponzen zoals de absorptie speren.
Het effect van een burr gat (diameter < 2 mm) in de schedel op het EEG opname rond het gat werd bestudeerd door een andere spin elektrode op de intact schedel bovenop de cortex ipsi-laterale vat te plaatsen, zodat bilaterale EEG opnamen kon worden vergeleken. De resultaten die worden weergegeven in Figuur 9 en Figuur 10, suggereren het effect op de 0,05 niveau van betekenis te verwaarlozen. Andere factoren op het gebied van de amplitude van de EEG zijn hoe goed de EEG pasta was in contact met de schedel, hoe stevig de elektrode werd ingedrukt om de pasta en de ruimtelijke omvang van de EEG plakken op de schedel.
Het is ook de moeite waard om op te merken dat het protocol beschreven hier schedel EEG opgenomen, die verschilt van de hoofdhuid EEG gebruikt in menselijke studies van de EEG. De hoofdhuid gedraagt zich als een weerstand of een low-pass filter, die de signaal-ruisverhouding van de EEG opname verder zal verminderen.
Ten slotte, vergelijking van de temporele dynamiek van de ERP en die van de evoked LFP over corticale lagen suggereren dat somatosensorische evoked potentieel weerspiegelt beter de LFP in de supragranular laag van de cortex dan die in de granulaire en infragranular lagen. Dit is in overeenstemming met onze eerdere werk6, aan te tonen dat het eerste segment (P1) van de ERP is gerelateerd aan de terugkeer huidige als gevolg van de instroom van de excitatory synaptic huidige die zich voordoen in de granulaire laag, terwijl de latere dalen) N1) in ERP kan worden gerelateerd aan de vertraagde komst van de thalamus afferent aan corticale lagen II/III en/of feedforward signalen uit de diepere lagen van de corticale. Kortom, kunnen gelijktijdige opnamen van EEG/LFP inzicht van de neurale genesis van EEG te vergroten, en vergemakkelijken van de wiskundige modellering van de EEG in termen van neurale signalen over corticale lagen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Andrew Cripps en de BioResource Unit aan de Universiteit van Reading. Dit onderzoek werd gefinancierd door de BBSRC (verlenen van nummer: BB/K010123/1). Gegevens die zijn gekoppeld aan dit werk is vrij verkrijgbaar bij Y.Z. (ying.zheng@reading.ac.uk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Lister Hood rats | Charles Rivers | ||
| Spider electrode | Unimed Electrode Supplies Ltd | SCS24-426 | |
| EEG paste: Ten20 | Unimed Electrode Supplies Ltd | 10-20-S | |
| Stereotaxic holder with dual micromanipulator arms: Dual Manipulator Stereotaxic Frame with 18° Ear Bars | WPI (World Precision Instruments) | 502603 | |
| Isoflurane | National Vet Services Limited | 50878 | |
| Hard plastic nose cone: Anasthesia Gas Mask for Rat | WPI | 502054 | |
| Small animal isoflurane anaesthetic system | WPI | EZ-B800A | |
| Thermostatic heating pad: Rat Blanket System 230V | Harvard Apparatus UK | 50-7221-F | |
| Ophthalmic ointment: Optixcare eye lube | Viovet | 203865 | |
| Lidocaine Hydrochloride (Injection 2%) | Larkmead Vets | ||
| Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, Hollow | WPI | 503421 | |
| Serrated and curved dissecting forceps | WPI | 15915 | |
| Braided silk, non-absorbable suture: Mersilk Suture W502H | National Vet Services Limited | 153746 | |
| Dental drill: BONE MICRO DRILL SYST 230 VAC | Harvard Apparatus UK | 72-4860 | |
| Sterile Saline: Sodium chloride 0.9% | Animalcare Ltd | 14K26BT | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #4 | Harvard Apparatus UK | 72-4958 | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #1/4 | Harvard Apparatus UK | 72-4962 | |
| Faraday cage | Newport Corporation | VIS-FDC-3600 | |
| Vibration isolation workstation: Vision IsoStation | Newport Corporation | M-VIS3660-RG4-325A | |
| Oximeter Control Unit and sensor: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp. | WPI | O15001 | |
| Transparent soft nose cone: Microflex Non-Rebreathing Unit with a Rat Nosecone | WPI | EZ-103A | |
| Stainless steel stimulating electrodes | PlasticsOne | E363/1/SPC | |
| Isolated current stimulator | Made in House | ||
| 16-channel micro-electrode, 100 μm spacing, area of each site 177 μm2 | NeuroNexus | A1x16-10mm-100-177-A16 | |
| 16-channel acute headstage | Tucker David Technologies Inc., TDT | RA16AC-Z | |
| Pre-Amplifier: Z-Series 64-Channel Neuro-Digitizing Preamp | TDT | PZ5-64 | |
| Passive signal splitter: 32-Channel Splitter Box for PZ5 | TDT | S-BOX_PZ5 | |
| Data acquisition unit: RZ2 BioAmp Processor. Z-Series 4-DSP ultra high performance processor | TDT | RZ2-4 | |
| Software for Neurophysiology: OpenEX | TDT | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Absorption spears | Fine Sicence Tools | 18105-01 |
References
- Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiol Rev. 65 (1), 37-100 (1985).
- Logothetis, N. K. The Underpinnings of the BOLD Functional Magnetic Resonance Imaging Signal. J Neurosci. 23 (10), 3963-3971 (2003).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Zheng, Y., et al. Balanced excitation and inhibition: Model based analysis of local field potentials. Neuroimage. 63 (1), 81-94 (2012).
- Bruyns-Haylett, M., et al. The neurogenesis of P1 and N1: A concurrent EEG/LFP study. Neuroimage. 146, 575-588 (2017).
- Nunez, P. L. Electric Fields of the Brain: The Neurophysics of EEG. , Oxford University Press. (1981).
- Jackson, A. F., Bolger, D. J. The neurophysiological bases of EEG and EEG measurement: A review for the rest of us. Psychophysiology. 51 (11), 1061-1071 (2014).
- Cohen, M. X. Where Does EEG Come From and What Does It Mean? Trends Neurosci. 40 (4), 208-218 (2017).
- Bojak, I., Oostendorp, T., Reid, A., Kötter, R. Connecting Mean Field Models of Neural Activity to EEG and fMRI Data. Brain Topogr. 23 (2), 139-149 (2010).
- Coombes, S. Large-scale neural dynamics: Simple and complex. Neuroimage. 52 (3), 731-739 (2010).
- Deco, G., Jirsa, V. K., Robinson, P. A., Breakspear, M., Friston, K. J. The dynamic brain: from spiking neurons to neural-masses and cortical fields. PLoS Comput. Biol. 4 (8), e1000092 (2008).
- Pinotsis, D. A., Friston, K. J. Neural fields, spectral responses and lateral connections. Neuroimage. 55 (1), 39-48 (2011).
- Riera, J. J., et al. Pitfalls in the dipolar model for the neocortical EEG sources. J Neurophysiol. 108 (4), 956-975 (2012).
- Valdes, P. A., Jimenez, J. C., Riera, J., Biscay, R., Ozaki, T. Nonlinear EEG analysis based on a neural mass model. Biol Cybern. 81 (5), 415-424 (1999).
- Musall, S., von Pföstl, V., Rauch, A., Logothetis, N. K., Whittingstall, K. Effects of Neural Synchrony on Surface EEG. Cereb Cortex. 24 (4), 1045-1053 (2014).
- Snyder, A. C., Morais, M. J., Willis, C. M., Smith, M. A. Global network influences on local functional connectivity. Nat Neurosci. 18 (5), 736-743 (2015).
- Mayhew, J., et al. Spectroscopic analysis of neural activity in brain: Increased oxygen consumption following activation of barrel cortex. Neuroimage. 12 (6), 664-675 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Academic Press. (2005).
- Martindale, J., et al. The hemodynamic impulse response to a single neural event. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (5), 546-555 (2003).
- Pettersen, K. H., Devor, A., Ulbert, I., Dale, A. M., Einevoll, G. T. Current-source density estimation based on inversion of electrostatic forward solution: Effects of finite extent of neuronal activity and conductivity discontinuities. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 116-133 (2006).
- Thomson, D. J., et al. Multitaper analysis of nonstationary and nonlinear time series data. Nonlinear and Nonstationary Signal Processing. Fitzgerald, W. J., et al. , 317-394 (2000).
- Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (100), e52700 (2015).
- Baumann, S. B., Wozny, D. R., Kelly, S. K., Meno, F. M. The electrical conductivity of human cerebrospinal fluid at body temperature. IEEE Trans Biomed Eng. 44 (3), 220-223 (1997).
- Wendel, K., et al. The Influence of Age and Skull Conductivity on Surface and Subdermal Bipolar EEG Leads. Computational Intelligence and Neuroscience. 2010, (2010).
- Flemming, L., et al. Evaluation of the distortion of EEG signals caused by a hole in the skull mimicking the fontanel in the skull of human neonates. Clin Neurophysiol. 116 (5), 1141-1152 (2005).
