Summary
Este protocolo describe un método sencillo para grabación simultánea de co localizada electroencefalografía (EEG) y campo local multi-laminar en una rata anestesiado. Un orificio de trépano en el cráneo para la introducción de un microelectrodo se muestra para producir distorsión insignificante de la señal de EEG.
Abstract
Aunque electroencefalografía (EEG) es ampliamente utilizada como una técnica no invasiva para la grabación de actividades neuronales del cerebro, nuestra comprensión de la neurogénesis de EEG es todavía muy limitada. Potenciales de campo local (LFPs) registrados por medio de un microelectrodo multi-laminar pueden proporcionar una cuenta más detallada de la actividad simultánea de los nervios a través de diversas capas corticales en la corteza, pero la técnica es invasiva. Combinando las mediciones de EEG y de la LFP en un modelo preclínico mucho puede mejorar la comprensión de los mecanismos neuronales implicados en la generación de señales de EEG y facilitar la derivación de un modelo matemático más realista y biológicamente exacto de EEG. Aquí se presenta un procedimiento sencillo para la adquisición de EEG concurrente y co localizada y LFP multi-laminar en el roedor anestesiado. También investigamos si las señales de EEG fueron afectadas significativamente por un orificio de trépano en el cráneo para la introducción de un microelectrodo. Nuestros resultados sugieren que el agujero de las rebabas tiene un impacto insignificante en las grabaciones de EEG.
Introduction
Está generalmente aceptado que LFPs grabados mediante microelectrodos sobre todo reflejan la suma ponderada de sincronizado inhibitorias y excitatorias sináptica las actividades de las poblaciones neuronales piramidales1,2,3 , 4. nuestra investigación reciente demostró que el perfil de la señal de la LFP podría ser separado en componentes de excitación e inhibición de la5,6. Sin embargo, como LFP se mide normalmente a través de un procedimiento invasivo, no es adecuado para la mayoría de los estudios del cerebro humano.
Por el contrario, el EEG es una técnica no invasiva para medir la actividad eléctrica del cerebro. Es ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico para ciertos tipos de enfermedades neurológicas como la epilepsia y como herramienta de investigación en estudios cognitivos en humanos. A pesar de su popularidad, una limitación importante de EEG es la incapacidad para interpretar sus perfiles temporales precisamente en cuanto a las señales neuronales subyacentes7,8,9.
Cada vez más, se desarrollan modelos matemáticos de EEG para mejorar la comprensión del cerebro función10,11,12,13,14,15. La mayoría de los modelos existentes de EEG está desarrollada en base a conexión frecuencia dominio las características del modelo predicho de la salida a la gama de datos de EEG durante la actividad espontánea, y muy pocos modelos de EEG pueden generar potenciales evocados sensoriales realista. En este contexto, grabaciones simultáneas de EEG y LFP proporcionará penetración importante y limitaciones para el desarrollo de modelos matemáticos más precisos de EEG.
Para abordar esta necesidad para grabaciones simultáneas explorar más a fondo el origen neural de EEG, hemos desarrollado una metodología para grabar de manera simultánea señales LFP multi-laminar y EEG en el neocortex de la rata anestesiado. La configuración es similar a anteriores estudios EEG/LFP concurrentes en primates16,17. Además investigamos el efecto de un orificio de trépano perforado en el cráneo en las grabaciones de EEG que rodea el agujero mediante la comparación de grabaciones de EEG bilaterales (es decir, un hemisferio con un orificio de trépano, el otro hemisferio intacto) en ausencia de sensorial estimulación. Nuestros resultados demuestran que grabaciones de EEG/LFP concurrentes pueden llevarse a cabo simplemente y con eficacia, con poca distorsión de la señal de EEG desde el orificio de trépano en el cráneo.
Protocol
Todos los experimentos fueron realizados conforme a las normas del Ministerio del interior británico (los animales (procedimientos científicos) Act, 1986) y aprobados por el Comité de ética de investigación en la Universidad de Reading, UK.
1. animal preparación
Nota: Se utilizaron ratas Lister mujer con capucha para todos los experimentos. Este es un procedimiento no supervivencia.
- Registrar el peso de la rata en a escala de laboratorio.
- Anestesiar la rata en una cámara con isoflurano 5% y una tasa de flujo de oxígeno de 1 L/min.
- Colocar la rata en un soporte estereotáxicas con una toalla de papel debajo de su cuerpo y con sus dientes de descanso por medio de la picadura... La toalla de papel facilitará la inserción de una almohadilla de calor (véase el paso 2.3) y coger cualquier excremento de la rata durante el experimento.
- Administrar isoflurano continuamente a través de un cono de nariz de plástico duro montado sobre la pinza de nariz para el adaptador de la rata a una concentración de 3% con una tasa de flujo de oxígeno de 0,5 L/min Conecte el cono a un sistema anestésico isoflurano animales pequeños.
2. quirúrgico
- Coloque una almohadilla de calefacción termostático por debajo de la toalla de papel sobre el cual descansa la rata, la protección de cabeza de rata con dos barras de oído y monitorear la temperatura del cuerpo utilizando un termómetro rectal.
- Cepille la parte superior de la cabeza de la rata.
- Aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad corneal.
- Antes de exponer el cráneo, aplique gotas de lidocaína en el cuero cabelludo y masajear suavemente en la piel.
- Haga una incisión de línea media de aproximadamente 2-3 cm en el cuero cabelludo con un bisturí para exponer la superficie del cráneo.
- Cuidadosamente separe lo temporalis músculo contralateral en la almohadilla de la barba a estimular desde el cráneo usando un escalador Jacquette y un par de pinzas de disección dentadas y curvas. Limpiar el cráneo con hisopos de algodón cuando sea necesario.
- Con un trenzado de seda, sutura no absorbible, atar el músculo separado en el cuero cabelludo con un nudo apretado y luego atar la sutura firmemente al marco estereotáxicas18.
- Utilizar coordenadas estereotáxicas para localizar la corteza del cañón, caudal a bregma 2,5 mm y 6 mm lateral a la línea media19. Dibujar un punto en el lugar de la corteza somatosensorial con un lápiz o un marcador.
-
Perfore un agujero de las rebabas en el lugar marcado con un taladro dental. Para evitar que el cráneo contra el recalentamiento durante la perforación, se aplica solución salina estéril (cloruro de sodio 0,9%) al área de trabajo cada 10-15 s. El proceso de perforación consiste en los siguientes 3 pasos:
- Taladre un orificio de < 2 mm de diámetro en el cráneo usando una broca #4 (0.055 de diámetro). Tenga cuidado de no para perforar la duramadre.
- Fina el fondo del taladro para translucidez usando una broca de 1/4 (0.019 de diámetro).
- Utilice una aguja de 27 G con perforar la duramadre para permitir la inserción de un microelectrodo.
- La transferencia de la rata, en un marco estereotáxicas, a una jaula de Faraday en la parte superior de una estación de trabajo de aislamiento de vibración.
- Coloque una pinza sensor de oxímetro conectada a un oxímetro de mandos pata traseras de la rata para monitorear continuamente los siguientes parámetros fisiológicos: frecuencia cardíaca, frecuencia de respiración, saturación de oxígeno arterial, distensión de pulso y distensión de la respiración. Estos parámetros se muestran continuamente en un monitor de PC, que reflejan la condición fisiológica y la profundidad anestésica de la rata.
- Vuelva a colocar el cono de nariz de plástico duro para la administración de isoflurano y la pinza de nariz para el adaptador de la rata con un respiradero de microflex con un cono de nariz suave transparente que es modificado (figura 1A) para permitir la estimulación de la barba fácil a un lado de la barba almohadilla sin comprometer la administración de isoflurano.
- Introducir dos electrodos de acero inoxidable estimulante a la almohadilla de barba por el recorte en el cono de nariz.
- Conecte los electrodos estimulantes para un estimulador corriente aislado.
- Levantar la piel de la línea media del cuello con pinzas y hacer un 1 ~ incisión de 2 cm con tijeras para la colocación de los electrodos de referencia. Tenga cuidado de no para cortar el tejido muscular.
3. co localizada EEG/LFP configuración
- Limpie y seque el cráneo que rodea el agujero de las rebabas usando un hisopo de algodón.
- Coloque con cuidado la pasta conductora de EEG en un lado plano de un electrodo de EEG araña. Deje un pequeño agujero de la pasta del EEG en el electrodo de la araña para permitir un microelectrodo multi-laminar pasar por el agujero sin contacto con la pasta y el electrodo de la araña. Esto evita el contacto eléctrico entre el electrodo de EEG y el microelectrodo.
- Alinee el electrodo spider para el orificio de trépano en el cráneo, con la pasta de EEG hacia el cráneo.
- Presione cuidadosamente el electrodo de la araña en el cráneo, haciendo contacto firme con el cráneo a través de la pasta de EEG. Retire cualquier pasta ocultando el agujero de las rebabas utilizando una aguja en una jeringa.
- Quitar excesiva pasta EEG más allá de la periferia del electrodo spider para que el contacto entre el electrodo de la araña y el cráneo está limitado espacialmente para el tamaño del electrodo (figura 1B).
Figura 1: configuración General para la grabación simultánea de EEG/LFP. (A) la configuración consiste en un cono de nariz modificado para facilitar la estimulación del cojín de barba bajo anestesia isoflurano, dos estimulantes electrodos insertados en la barba del cojín, un electrodo de araña colocado en el cráneo por encima del barril la corteza contralateral a los electrodos de estimulación, un microelectrodo de multicanal en la corteza del cañón a través del electrodo de araña y los electrodos de referencia colocada dentro de una incisión en la parte posterior de cuello de la rata. (B) una vista a través del microscopio del electrodo spider colocado de manera segura en el cráneo por pasta de EEG. El microelectrodo se inserta en un orificio de trépano perforado en el cráneo en el electrodo de la araña. El cuero cabelludo es retenido por hilo quirúrgico (sutura) atado al marco estereotáxicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Untar pasta EEG sobre el electrodo de referencia para el EEG y colóquelo firmemente dentro de la incisión en la parte posterior de cuello de la rata.
- Conecte los electrodos de EEG al preamplificador por medio de un divisor de señal pasivo para señales de baja impedancia (figura 2). Asegúrese de que la impedancia del electrodo araña está por debajo de 5 kΩ. Si no es así, verifique que la pasta de EEG está en buen contacto con el cráneo y el electrodo está firmemente presiona la pasta EEG. Añadir más pasta EEG si es necesario.
- Montar un brazo instrumental quirúrgico en el marco de estereotáctica. Conectar un microelectrodo de 16 canales lineal (100 μm espaciado, área de cada sitio 177 μm2) con un headstage agudo de 16 canales, enganchado en el brazo de instrumental quirúrgico.
- Untar pasta de EEG en los electrodos de referencia para el EEG y el microelectrodo, luego colóquelas firmemente dentro de la incisión (figura 1A).
- Ajuste el ángulo del brazo instrumental quirúrgico para que el microelectrodo es perpendicular a la superficie cortical. Este ángulo es normalmente de 25 a 35 °.
- Baje el microelectrodo microscopio girando las perillas de instrumental quirúrgico para que la punta del microelectrodo se dirige a la pequeña abertura en la parte inferior del agujero de las rebabas de hasta que el electrodo superior sólo penetra la superficie cortical. Debe tenerse cuidado para evitar forzar el microelectrodo sobre la superficie de la duramadre que esto rompería el electrodo.
- Par el microelectrodo de 16 canales para un preamplificador conectado a una unidad de adquisición de datos a través de un cable de fibra óptica (figura 2).
- Encienda el preamplificador, la unidad de adquisición de datos y el ordenador conectado a la unidad. Gire la caja del estimulador.
- Inserte el microelectrodo normalmente a la superficie cortical girando lentamente el eje z de las amalgamas dentales a una profundidad de 1.500 μm20.
- Micro-ajusta la profundidad aplicando un tren de estímulos a la almohadilla de los bigotes y observando la LFP evocada de 16 canales en un monitor de PC usando el software de la unidad de adquisición de datos instalado en el PC. Cuidadosamente gire el eje z en el micromanipulador hasta la amplitud máxima de la LFP evocada se produce alrededor de canal 7 (como esto coincide con la capa IV en la corteza).
Nota: Configuración de electrodo EEG Ipsi-lateral: para algunos experimentos, se colocó un segundo electrodo de araña en el lado de ipsi-lateral del cráneo intacto sobre la corteza del cañón. Esta configuración permitió EEG bilateral grabación durante el estado de reposo investigar el efecto del agujero de las rebabas en la señal de EEG.
Nota: El procedimiento quirúrgico para establecer el electrodo de EEG es idéntico a la descrita, excepto en el paso 2.6, el músculo de los temporalis a cada lado de la cabeza fue cuidadosamente separado del cráneo, suturado nuevamente y atado firmemente al lado correspondiente del el marco estereotáxicas.
Nota: La configuración de EEG/LFP concurrente también es idéntica a la descrita anteriormente, con un paso adicional que un segundo electrodo de araña es cargado con la pasta de EEG, entonces presiona firmemente al cráneo por encima de la corteza del cañón ipsi-lateral.
Figura 2. Un diagrama de flujo de señal. La rata se coloca dentro de una jaula de Faraday. Los electrodos estimulantes reciban comandos desde el cuadro de estimulador controlado por la unidad de adquisición de datos a través de su software instalado en un PC. La señal neuronal por el microelectrodo se transmite a un amplificador de potencia dentro de la jaula de Faraday. La señal neuronal registrada por la sonda de EEG se transmite al amplificador de potencia a través de un divisor de señal. El preamplificador se conecta a la unidad de adquisición de datos fuera de la jaula de Faraday mediante un cable de fibra óptica. Los datos neuronales entonces se almacenan en un disco en el PC, mientras que también se pueden visualizar en un monitor de PC. Un sistema móvil pequeño isoflurano animal administra isoflurano desde fuera de la jaula de Faraday. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. electroestimulación y grabaciones de nervios
Nota: La frecuencia de muestreo para todos los datos neuronales es 24,41 kHz con una resolución de 16 bits. Un ensayo consta de una única estimulación eléctrica al comienzo del ensayo. Cada prueba dura 10 s, que es también el intervalo inter-estímulo (ISI). Cada estímulo es un pulso cuadrado de corriente de 1.2 mA duradero 0,3 ms. bilateral experimentos para estudiar el efecto del agujero de las rebabas, continuo reposo estado de 250 s también se registra.
- Abra el software de grabación en el equipo en uso.
- Cargar el circuito correcto para el experimento seleccionando 'Carga proyecto...' en el menú desplegable de 'OpenProject'. Aparecerá una nueva ventana ('Banco') (figura 3).
Figura 3. Una pantalla del software GUI para la unidad de adquisición de datos Permite que el circuito apropiado para cargar parámetros de estimulación a y datos para ser grabado y visualizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
-
Crear un nuevo directorio (llamado un 'tanque' por el software) para almacenar grabaciones de nervios.
- Haga clic en 'Archivo' de la parte superior de la ventana y seleccione 'Datos de gestión de tareas'. Aparecerá una nueva ventana (el tanque del ' Management').
- En la ventana de 'Gestión de depósito', pulse el botón derecho del ratón para mostrar un menú. Seleccione 'Crear nuevo tanque'. Aparecerá otra nueva ventana ('crear datos Tank').
- En la ventana de 'Crear datos Tank', seleccionar la ruta donde va a crear un nuevo directorio de datos y escriba el nombre del nuevo directorio. A continuación pulse 'Aceptar'. Esta ventana desaparecerá.
- El nuevo directorio aparecerá en la ventana de 'Gestión de depósito' pero en gris. Registrar este directorio haciendo clic derecho sobre ella y seleccione 'Registrar Tank' en el menú desplegable. Una estrella roja y una flecha verde aparecerá a la izquierda del nombre del nuevo directorio que está en negro (figura 4).
- Anular el registro cualquier directorio anterior no esté en uso haciendo clic en la ventana de 'Gestión de depósito' y seleccionando 'Actualizar lista de tanque' en el menú desplegable.
- Haga clic en 'OK' para salir de la ventana de 'Gestión de depósito'.
Figura 4: pantalla del software GUI que muestra un directorio de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
-
Registrar el nuevo directorio en el 'Ámbito' para mostrar señales neuronales durante el experimento.
- Haga clic en el icono de 'Alcance' en la ventana de 'OpenProject'. Aparecerá una nueva ventana ('ámbito').
- Haga clic con el botón derecho del ratón en la ventana de 'Alcance' y seleccione 'Actualizar lista de tanque' en el menú desplegable. Nombre del nuevo directorio aparecerá en gris.
- Haga clic en el nuevo directorio. Una estrella roja y una flecha verde aparecerá a la izquierda del nombre del nuevo directorio que está en negro.
- Configurar los parámetros experimentales para adquisición de datos en la ventana de 'Banco' haciendo clic en 'Configuración' de la parte superior de la ventana. Aparecerá una nueva ventana. Seleccione 'Rastrea el aro', la duración de la prueba y el número de ensayos para grabar.
- Compruebe que está activada la casilla estimulador.
- Pulse el botón 'Record' en la ventana de 'Banco'. Aparecerá una nueva ventana. Escriba el nombre del archivo de datos que quiere guardar para el experimental ejecutar pero no golpee el botón volver en esta etapa, como la necesidad de parámetros de grabación de EEG para configurar.
-
Configurar los parámetros de grabación de EEG utilizando la interfaz gráfica de usuario (GUI) en el preamplificador. La pantalla (cualquier parte) del preamplificador para activar la pantalla táctil. Seleccione 'Abrir' para desbloquear la pantalla (figura 5).
- Pulse el icono de la izquierda en el 2: EEG' panel. Aparecerá una nueva pantalla.
- Pulse 'Acoplamiento' y seleccione 'AC'.
- Pulse 'Ref Mode' y seleccione a 'Local'.
- Pulse 'Samp Rate' y seleccione 25 KHz'.
- Pulse 'Aceptar' para volver a la visualización original.
Figura 5: la interfaz gráfica de usuario en el amplificador de potencia. Permite parámetros (p. ej., frecuencia de muestreo y referencia a preferencia) a la grabación de EEG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Compruebe la impedancia de la sonda de EEG pulsando el icono del medio en el 2: EEG' panel. Si demasiado, añadir más pasta EEG a la sonda. Pulse 'Aceptar' para volver a la visualización original.
- Espera 20 s para evitar la fluctuación inicial de las grabaciones de EEG de grabación.
- Volver al monitor de la PC (después de la espera s 20) y oprima la tecla 'Return' en el teclado. Se registró el EEG y las señales de la LFP.
5. Análisis de datos
-
Procesamiento previo de las señales LFP y EEG evocadas en forma de ensayo por prueba siguiendo estos pasos.
- Desplaza hacia atrás los datos neuronales en tiempo 20 muestras (equivalentes a 0,82 m). Esto es el retardo producido por el circuito utilizado para recopilar datos neurales en TDT sí mismo. Cambiando los datos, el punto de momento cero se alinea con la aparición del estímulo.
- Quitar el artefacto del estímulo mediante la sustitución de los datos neuronales de 0 a 1 ms con una línea recta conectando los datos del punto en 0 ms con el punto de datos en 1 ms.
- Cero-media cada ensayo restando el valor medio de la señal neural 200 ms antes de la aparición del estímulo.
- Paso bajo filtrar los datos por debajo de 800 Hz con un orden deth 4 filtro IIR Butterworth en ambas direcciones para evitar la introducción de cualquier cambio temporal en los datos.
- Alinear los datos multi-laminar a través de animales. Para los datos de la LFP de cada animal, se aplica la inversa actual densidad de la fuente (spline CIDC, fuente radio R = 0,5 mm) análisis21 con un filtro gaussiano (λ = 50 μm) para localizar la capa IV fregadero1, que es dado por el mayor pico negativo que ocurre en una cortical profundidad debajo de la superficie pial en las primera 15 ms del inicio del estímulo. El CSD y la LFP correspondiente, datos entonces se alinean según la ubicación del fregadero a través de animales. El lavabo común se encuentra en la capa IV, ~ 600 μm por debajo de la superficie pial.
- Después de la alineación, utilice los canales 2, 7 y 12 de la LFP reajustada como representantes de las respuestas neuronales de la supragranular, granular y capas de infragranular, respectivamente en la corteza del cañón.
- Calcular que la media evocados LFP y EEG promediando los datos previamente procesados más de 100 ensayos.
- Para investigar el efecto del agujero de las rebabas en el EEG, abajo-muestra el EEG señales a 1.000 Hz y calcular la densidad espectral de potencia (PSD) de ipsi-lateral (cráneo intacto) y contralateral (con un agujero en el cráneo) grabaciones de electrodo de araña durante un período de s 250 de estado en reposo. PSD se computa de 0.1 a 100 Hz en Matlab usando la función 'pmtm' que se basa en el método multitaper22.
- La gama de frecuencias se dividen en las siguientes bandas de frecuencia conocida: Delta (δ): 0.1-4 Hz (Theta): 4-8 Hz, alfa (α): 8-13 Hz, Beta (β): 13-31 Hz, Gamma (γ): 31-100 Hz. Calcule lo PSD promedio dentro de cada banda.
- Dentro de cada banda de frecuencias, calcular la diferencia normalizada en PSD, Perr, entre la contra y el EEG ipsi-lateral utilizando la ecuación:
donde Pc y P son el promedio PSD de la y ipsi-contralateral EEG, respectivamente, en la banda de frecuencias de interés. - Dentro de cada banda de frecuencia, realizar un one-sample t-test para probar la hipótesis de que no hay diferencias significativas (al nivel de significación de 0,05) entre la PSD de la señal EEG registrada desde los dos hemisferios.
Representative Results
Datos de 4 ratas fueron promediados para obtener series de tiempo en su caso. La amplitud de la respuesta evocada del EEG, también conocido como el potencial relacionado del acontecimiento (ERP), es típicamente mucho más pequeño que el de la LFP. La figura 6 muestra el promedio ERP y LFP en el supragranular, granular y infragranular capas de la corteza de barril, respectivamente. La banda de error en cada parcela es el correspondiente error estándar. Puede verse que el ERP es aproximadamente 10 veces más pequeño que la LFP evocada.
Figura 6: media (n = 4) las señales neuronales de ERP, supragranular, granular y infragranular LFP. Sombra indica error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las comparaciones de la dinámica temporal de la ERP y la LFP se muestran en la figura 7. La superposición directa de ERP y supragranular LFP en la Figura 7A muestra el orden de las diferencias de amplitud entre estos dos tipos de señales neuronales. Para comparar la dinámica temporal, ERP y LFP se normalizan con respecto a su amplitud de pico negativo. Figura 7B y 7C muestran que el ERP normalizado superpuestos con supragranular normalizado LFP y LFP granular normalizado, respectivamente.
Se aprecia de la figura 7B y los picos de P1 y N1 de ERP que más retrasados de los correspondientes picos de LFP en la capa supragranular. Sin embargo, los perfiles temporales de estas dos señales neuronales son similares, con P1 anterior N1. Por otro lado, el perfil temporal de ERP es marcadamente diferente de la de la granular (capa IV de la corteza del cañón) LFP (figura 7). Lo importante es que no son imágenes de espejo uno del otro, con LFP granular dominado por un solo pico negativo (reflejando un sumidero importante en capas corticales IV), mientras que ERP consistió principalmente de dos picos con polaridad opuesta.
Figura 7: comparación de la dinámica temporal de la ERP y LFP. (A) ERP (línea sólida) superpuesto con supragranular LFP (línea discontinua). Sombra indica error estándar. (B) normalizado ERP (línea sólida) superpuestos con normalizado supragranular LFP (línea discontinua). (C) normalizado ERP (línea sólida) superpuestos con LFP granular normalizado (línea discontinua). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La señal ERP se midió a través de un electrodo de araña colocado en el cráneo con un orificio de trépano perforado en él. Para investigar el efecto del agujero en las grabaciones de EEG, electrodo de araña otro fue colocado en el cráneo intacto sobre la corteza ipsi-lateral barril. Se tuvo cuidado para asegurar que las impedancias de los electrodos de la dos araña eran comparables en magnitud ajustando la cantidad de EEG pasta utilizado. Datos de cuatro de las ratas (que no las mismas ratas se utilizaron anteriormente) se presentan aquí.
La figura 8 muestra las simultánea reposo estado las grabaciones de EEG de ambos electrodos de una rata, con 100 datos mostrados en la figura 8Ay los datos en el marco rectangular (20 s) se expanden en la figura 8B. Las dos señales de EEG en gran medida Co varían dentro de una gama similar de amplitud. La figura 9 muestra el PSD de las cuatro ratas, con la fila superior usando una escala lineal en el eje de frecuencia y la fila inferior utilizando una escala logarítmica en el eje de frecuencia para proporcionar una vista ampliada en la gama de frecuencia más baja. De la figura 9, no parece haber sesgo consistente en el PSD en materias. Esto fue confirmado al realizar pruebas t de una muestra de las diferencias normalizadas en lo PSD promedio en las cinco bandas, que se muestra en la figura 10. Ninguna de las diferencias normalizadas de PSD en estas bandas de frecuencia fueron significativamente diferente de cero (p = 0.32, 0.46, 0.85, 0.69 y 0.97, respectivamente).
Figura 8: las grabaciones de EEG bilaterales. EEG de cráneo (A) de grabación durante la reclinación estado con un orificio de trépano en el cráneo (negro) y un registro simultáneo del EEG en el hemisferio opuesto con el cráneo intacto (gris). Ampliado (B) vista de las formas de onda en el marco rectangular (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: potencia de densidad espectral (PSD) de la contra-(azul) y el EEG ipsi-lateral (rojo). Cada columna muestra el PSD para una rata. Los paneles superiores usan escala de frecuencia lineal, mientras que los paneles de fondo usan escala de frecuencia logarítmica para permitir que el PSD en la gama de frecuencia más baja a visualizarse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: análisis del grupo. Normalizado de la diferencia entre la contra y el PSD ipsi-lateral con las bandas de frecuencia de cinco: Delta, Theta, alfa, Beta y Gamma. Cada barra muestra las diferencias de medias normalizadas dentro de la banda de frecuencia, con el error estándar que se muestra en la barra de error. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Hemos descrito un procedimiento experimental para la grabación simultánea de señales EEG y LFP Co localizadas de una rata anestesia isoflurano en respuesta a la estimulación de almohadilla de barba. Un microelectrodo fue insertado en la neocorteza a través de una abertura en el electrodo de la araña de EEG que estaba alineada con un orificio de trépano perforado en el cráneo. El electrodo fue asegurado en el cráneo por un conductor y adhesivo EEG pasta23. El cono de nariz utilizado para la administración de isoflurano fue modificado para que estimular los electrodos podría insertarse en la almohadilla de los bigotes con facilidad.
La pasta de EEG fue eficaz en el montaje del electrodo de araña en el cráneo, mientras que proporciona excelente conductividad eléctrica durante todo el día experimental sin necesidad de solicitud adicional de pasta. Substituyó el indeseable uso de pegamento para fijar la periferia del electrodo spider en el cráneo, como pegamento es no conductor y puede aumentar la impedancia del electrodo si se ejecuta entre el cráneo y el electrodo. Pasta EEG tiene un número de ventajas sobre el gel de EEG, que es difícil de forma alrededor del agujero de las rebabas y puede resecar durante el experimento, dando por resultado pobres señales de EEG.
Como la rata se colocó dentro de una jaula de Faraday, interferencias eléctricas debido al ambiente grandemente fue atenuada. Sin embargo, a veces la señal neuronal todavía era bastante ruidosa. En la mayoría de los casos, esto fue causado por el electrodo de referencia no está bien posicionada y por lo tanto es necesario volver a ajustar o EEG más pasta utilizado. Otro problema común fue que la LFP evocada pequeña amplitud. Esto puede ser debido el microelectrodo no colocado en el centro de la región cortical activada por los electrodos estimulantes. En lugar de volver a insertar el microelectrodo, que podría causar más daño a las neuronas locales, generalmente nos ajusta la posición de los electrodos de estimulación en la almohadilla de los bigotes hasta una amplitud razonable de la LFP (> 3 mV) se pudo observar.
Una de las limitaciones de la técnica es la resolución espacial pobre del electrodo de la araña, que tiene un diámetro de 6 mm. Esto es grande en comparación con el tamaño del cráneo de la rata. Lamentablemente, el electrodo spider usado aquí es el más pequeño disponible para la compra. Será conveniente reducir el diámetro del electrodo spider a 2-4 mm, aumentando así la especificidad espacial de las grabaciones de EEG, haciendo la comparación entre la señal de EEG y la supragranular de la LFP señal menos ambiguo.
Varios pasos críticos en el protocolo necesitan una atención especial. La primera es la inserción de los microelectrodos a través del agujero de las rebabas. Como la duramadre es de otra manera intacta, la precisión de la inserción es crucial. Una resistencia ligera en la punta del electrodo generalmente significa que el electrodo no está bien posicionado. Debe ser levantado, posición ajustada y volver a insertar. La segunda es la posición del cono de nariz en la rata. No debe ser demasiado flojo, como isoflurano se escapará del cono. También no debe ser demasiado apretado, ya que esto puede obstruir las fosas nasales de la rata y causar dificultad para respirar. Especial atención es necesaria también para asegurarse de que la amplitud de la grabación de EEG es mucho más pequeña (generalmente 5 a 10 veces más pequeño) que la grabación de canal superior de la LFP. Si son similares, es un indicio de que la sonda de EEG ha entrado en contacto directo o indirecto con el microelectrodo. Un contacto indirecto es generalmente a través del líquido cefalorraquídeo (LCR) que a veces llena el agujero perforado en el cráneo. La conductividad de la CFS es típicamente 100 veces del cráneo24,25. Así, si el nivel de LCR en el agujero de las rebabas es suficientemente alto, puede hacer contacto con el electrodo de la araña. Para evitar esto, el agujero debe limpiarse frecuentemente con las esponjas de algodón súper absorbente como la spears de absorción.
El efecto de un orificio de trépano (diámetro < 2 mm) en el cráneo en el EEG se estudió grabación que rodea el agujero colocando otro electrodo de araña sobre el cráneo intacto encima de la corteza ipsi-lateral barril por lo que podrían compararse con las grabaciones de EEG bilaterales. Los resultados se muestra en la figura 9 y figura 10, sugieren el efecto insignificante en el nivel de significancia 0.05. Otros factores que afectan la amplitud del EEG incluyen qué tan bien la pasta EEG estaba en contacto con el cráneo, cómo firma el electrodo presionó a la pasta y la extensión espacial de la pasta del EEG en el cráneo.
También vale la pena tener en cuenta que el protocolo descrito aquí grabado calavera EEG, que es diferente del cuero cabelludo EEG en humanos estudios de EEG. El cuero cabelludo actúa como un resistor o un filtro de paso bajo, que reduce el cociente signal-to-noise del EEG más de grabación.
Finalmente, comparación de la dinámica temporal de la ERP y el de la LFP evocada a través de capas corticales sugieren que el potencial evocado somáticosensorial refleja mejor la LFP en la capa supragranular de la corteza que el granular y las capas infragranular. Esto está de acuerdo con nuestro anterior trabajo6, demostrando que el segmento inicial (P1) de la ERP se relaciona con el retorno actual derivados la entrada de la excitatoria sináptica actual que ocurre en la capa granular, mientras que la posterior disminución) N1) en ERP puede estar relacionada con la llegada retrasada de capas a corticales aferentes talámicos II/III o feedforward las señales de las capas corticales más profundas. En conclusión, grabaciones simultáneas de EEG/LFP pueden mejorar la comprensión de la génesis neuronal de EEG y facilitar la modelación matemática de EEG en términos de señales neuronales a través de capas corticales.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Andrew Cripps y la unidad de BioResource de la Universidad de Reading. Esta investigación fue financiada por el BBSRC (número: K010123/BB/1). Datos relacionados con este trabajo están disponibles de Y.Z. (ying.zheng@reading.ac.uk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Lister Hood rats | Charles Rivers | ||
| Spider electrode | Unimed Electrode Supplies Ltd | SCS24-426 | |
| EEG paste: Ten20 | Unimed Electrode Supplies Ltd | 10-20-S | |
| Stereotaxic holder with dual micromanipulator arms: Dual Manipulator Stereotaxic Frame with 18° Ear Bars | WPI (World Precision Instruments) | 502603 | |
| Isoflurane | National Vet Services Limited | 50878 | |
| Hard plastic nose cone: Anasthesia Gas Mask for Rat | WPI | 502054 | |
| Small animal isoflurane anaesthetic system | WPI | EZ-B800A | |
| Thermostatic heating pad: Rat Blanket System 230V | Harvard Apparatus UK | 50-7221-F | |
| Ophthalmic ointment: Optixcare eye lube | Viovet | 203865 | |
| Lidocaine Hydrochloride (Injection 2%) | Larkmead Vets | ||
| Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, Hollow | WPI | 503421 | |
| Serrated and curved dissecting forceps | WPI | 15915 | |
| Braided silk, non-absorbable suture: Mersilk Suture W502H | National Vet Services Limited | 153746 | |
| Dental drill: BONE MICRO DRILL SYST 230 VAC | Harvard Apparatus UK | 72-4860 | |
| Sterile Saline: Sodium chloride 0.9% | Animalcare Ltd | 14K26BT | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #4 | Harvard Apparatus UK | 72-4958 | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #1/4 | Harvard Apparatus UK | 72-4962 | |
| Faraday cage | Newport Corporation | VIS-FDC-3600 | |
| Vibration isolation workstation: Vision IsoStation | Newport Corporation | M-VIS3660-RG4-325A | |
| Oximeter Control Unit and sensor: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp. | WPI | O15001 | |
| Transparent soft nose cone: Microflex Non-Rebreathing Unit with a Rat Nosecone | WPI | EZ-103A | |
| Stainless steel stimulating electrodes | PlasticsOne | E363/1/SPC | |
| Isolated current stimulator | Made in House | ||
| 16-channel micro-electrode, 100 μm spacing, area of each site 177 μm2 | NeuroNexus | A1x16-10mm-100-177-A16 | |
| 16-channel acute headstage | Tucker David Technologies Inc., TDT | RA16AC-Z | |
| Pre-Amplifier: Z-Series 64-Channel Neuro-Digitizing Preamp | TDT | PZ5-64 | |
| Passive signal splitter: 32-Channel Splitter Box for PZ5 | TDT | S-BOX_PZ5 | |
| Data acquisition unit: RZ2 BioAmp Processor. Z-Series 4-DSP ultra high performance processor | TDT | RZ2-4 | |
| Software for Neurophysiology: OpenEX | TDT | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Absorption spears | Fine Sicence Tools | 18105-01 |
References
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