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Medicine

Blessure axée sur le ballon pour provoquer l’hyperplasie Myointimal dans l’aorte abdominale de souris

doi: 10.3791/56477 Published: February 7, 2018

Summary

Cet article illustre un modèle murin pour étudier le développement de l’hyperplasie myointimal (MH) après une lésion aortique ballon.

Abstract

L’utilisation de modèles animaux est essentielle pour une meilleure compréhension de la MH, une des principales causes de la sténose artérielle. Dans cet article, nous démontrons un modèle murin de ballon dénudation, qui est comparable aux modèles de lésion du navire établies dans les grands animaux. Le modèle de dénudation aorte avec des cathéters à ballonnet imite le contexte clinique et conduit à des changements physiologiques et pathobiological comparables. En bref, après avoir effectué une incision horizontale dans l' aorte abdominalis, un cathéter à ballonnet sera inséré dans le vaisseau, gonflé et introduit marqués. Gonflage du ballonnet conduira à des blessures de l’intima et une surdistension du navire. Après avoir retiré le cathéter, l’incision aortique sera fermée avec des points de suture unique. Le modèle présenté dans cet article est reproductible, facile à réaliser et peut être établie de manière rapide et fiable. Il est particulièrement approprié pour l’évaluation de coûteux agents thérapeutiques expérimentales, qui peuvent être appliqués de façon économique. À l’aide de différentes souches de souris knock-out, l’impact de différents gènes du développement MH peut être évaluée.

Introduction

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La sténose artérielle dans les artères coronaires et périphériques a un effet important sur la morbidité et la mortalité des patients1. Un mécanisme pathologique sous-jacent est l’hyperplasie myointima (MH), qui se caractérise par une augmentation de la prolifération, la migration et la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire du muscle lisse vasculaire des cellules (SMC)2. SMC se trouvent dans la couche de support du navire et de migrer lors de la stimulation à la surface de la lumière. Signaux stimulants incluent les facteurs de croissance, cytokines, contact cellule-cellule, lipides, les composants de la matrice extracellulaire et cisaillement mécanique et étirement les forces3,4,5,6. Lésions de la paroi des vaisseaux, pathologique ou iatrogène, causent des cellules endothéliales et les dommages aux cellules de muscle lisse et stimulent les réactions inflammatoires et donc conduisent à MH7.

Différents modèles animaux sont actuellement disponibles pour étudier les lésions artérielles et hyperplasie myointima. Grands animaux comme les porcs ou les chiens ont l’avantage d’une artère similaire et l’anatomie coronaire de partage avec les humains et sont particulièrement adaptées aux études portant sur l’angioplastie techniques, procédures et dispositifs8. Cependant, modèles de cochon ont l’inconvénient de supérieur thrombogénicité9,10, tandis que les chiens n’ont une réponse douce à navire blessures11. En outre, tous les grands modèles animaux nécessitent logement spécifique, l’équipement et le personnel, qui est lié à des coûts élevés et n’est pas toujours disponibles dans une institution. Petits modèles animaux comprennent les rats et les souris. Comparativement à des rats, des souris ont les avantages d’un coût moindre et l’existence d’une variété d’assommer de modèles. Le modèle décrit dans cette vidéo peut être associé d’ApoE-/-souris nourries avec un régime occidental pour imiter étroitement le contexte clinique d’angioplastie dans navires athéroscléreuse12. Les modèles précédents induit des lésions vasculaires via fil blessures13, dessiccation fluide14, printemps15ou des rotateurs blessures16. Étant donné la nature de la lésion affectera grandement le développement et la constitution de MH, à l’aide d’un cathéter à ballonnet pour induire la lésion en est le meilleur moyen d’imiter le contexte clinique.

Dans cet article, nous décrivons une nouvelle méthode pour induire des MH avec un cathéter à ballonnet chez la souris. L’utilisation d’un cathéter à ballonnet (1,2 mm x 6 mm) avec un RX-Port (Figure 1 a) permet le grattage de la couche intimale et, en même temps, l’induction d’une surdistension du navire. Ces deux facteurs sont des déclencheurs importants pour le développement de MH. L’heure de l’observation pour ce modèle est de 28 jours,17.

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Protocol

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Animaux a reçu tous les soins en conformité avec le Guide pour les principes des animaux de laboratoire, préparé par l’Institut des ressources animales de laboratoire et publié par le National Institutes of Health. Tous les protocoles d’animaux ont été approuvées par l’autorité locale responsable ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, (Bureau pour la santé et la Protection des consommateurs) de Hansestadt Hamburg'').

1. préparation du cathéter

Remarque : Reportez-vous à la Table des matières pour plus d’informations concernant le cathéter.

  1. Prenons cathéter de la titulaire de cathéter.
  2. Tirez le fil de guidage de la lumière par l’orifice distal dehors.
  3. Mettre dans une goutte de colle cyanoacrylate sur l’extrémité distale du cathéter.
    ATTENTION : Porter des gants en latex ou nitrile.
  4. Placez le fil de guidage dans le port de RX du cathéter et le faire avancer à travers la lumière à l’orifice distal. Ensuite, tirez le fil de guidage légèrement pour laisser un espace d’environ 5 mm à la fin.
  5. Attendre 5 min pour permettre à la colle sécher.
  6. Déplacer le fil-guide, il devrait être fixé. Si c’est toujours mobile, répétez les étapes 1.3 à 1.6.
  7. Remplir une seringue de 3 mL de sérum physiologique à 0,9 % 1,5 mL et connectez-le à l’orifice de gonflage du ballonnet.
  8. Pousser le piston de la seringue pour tester le gonflement du ballon. Laissez 0,6 mL sérum physiologique dans la seringue.

2. préparation souris

  1. Obtenir des souris mâles à l’âge de 14 semaines, pesant environ 30 g.
    NOTE : Nous avons utilisé des animaux obtenus de l’Institute of Laboratory Animals. Nous avons utilisé ici C57BL/6J.
  2. Une chambre à induction permet d’anesthésier la souris avec isofurane de 2,0 à 2,5 % (de 500 mL/min, débit d’oxygène).
  3. Placez la souris sur le dos sur un coussin chauffant et maintenir l’anesthésie avec un masque couvrant la bouche et le nez de la souris. Recherchez une profondeur suffisante de l’anesthésie en pinçant les pattes et la queue pour vérifier l’absence de réflexes.
  4. Enlever les poils abdominaux à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
  5. Écarter les pattes postérieures et fixer leur position à l’aide de ruban adhésif.
  6. Désinfecter la région abdominale à l’aide de povidone-iode, suivie de l’éthanol à 80 %. Répétez cette étape deux fois plus.
  7. Utilisez un drap chirurgical opératoire ne risque pas être contaminé. Ouvrez les couches de la peau et des muscles le long de la linea alba avec un ciseaux (ou un scalpel) pour exposer les organes abdominaux.
  8. Poser les intestins dans un gant de hydratée saline 0,9 % et les envelopper pour les garder humides.
  9. Utiliser deux pinces fines pour enlever le tissu adipeux au-dessus de l’aorte abdominale.
  10. À l’aide d’une seringue à insuline (30G), injecter 250 µL de solution d’héparine (50 U/mL) dans la veine cave inférieure (VCI) et attendre 3 minutes pour sa distribution systémique. Héparine va supprimer l’hémostase et empêcher la coagulation indésirable pendant la chirurgie.
  11. À l’aide de deux pinces, disséquer l’aorte d’approche jusqu'à la bifurcation et ses navires sortant de la branche.
  12. Ligaturer les vaisseaux secondaires, qui sont supposés être placés dans la zone fixée, avec un cauterizer à haute température.
  13. Arrêter la circulation sanguine par un clampage de l’aorte approche directement sous les artères rénales.
  14. Placez une deuxième pince à une position distale juste au-dessus de la bifurcation aortique.
  15. Effectuer une petite incision horizontale à l’aide de ciseaux au point médian entre les mâchoires le long du vaisseau.
    Remarque : La taille de l’incision doit être équivalente à 1/3 de la circonférence du vaisseau.
  16. Insérer une seringue avec une aiguille (30G) dans l’incision et rincer l’aorte avec 250 µL de solution de l’héparine (50 U/mL).
  17. 10-0 sutures, placer un seul noeud de chaque côté de l’incision.
  18. Dilatation de l’aorte en y insérant un dilatateur de navire de l’incision et la propagation du navire légèrement. Répétez la dilatation 2 à 3 fois.
  19. Hydrater le cathéter à ballonnet avec la solution saline à 0,9 %.
  20. Insérer le cathéter à ballonnet aplati dans l’aorte et le faire avancer vers la pince proximale sur l’aorte.
  21. Lorsque vous atteignez la pince proximale, soigneusement ouvrir la pince proximale et gonfler le ballonnet pour éviter les fuites de sang, en injectant ~0.6 mL de sérum physiologique.
    NOTE : Le rapport du ballonnet gonflé au bateau est de 1.5 : 1.
  22. Avancez la sonde rétrograde pendant environ 2 cm.
  23. Tirez le cathéter élargi, tout en dégonflant le ballon légèrement en libérant la seringue.
  24. Rattacher la pince proximale lorsque la sonde atteint l’incision de l’aorte. Dégonfler le ballonnet complètement et retirez-le.
  25. Rincer l’aorte avec 250 µL de solution de l’héparine (50 U/mL) à l’aide d’une seringue de 30G.
  26. Refermer l’incision aortique à l’aide de sutures de 10-0. Endroit interrompu points sur chaque côté latéral, suivie d’un ou deux points de suture sur la face ventrale.
  27. Ouvrez la pince distale. En cas de saignement, refermer la pince et placez des points supplémentaires.
  28. Ouvrir la pince proximale avec précaution.
  29. Placez deux écouvillons sur la suture pour le soutenir et arrêter tout saignement.
  30. Placer une pince hémostatique résorbable sur la suture pour le soutenir.
    Remarque : Un pouls aortique doit être visible dans la partie distale de l’incision.
  31. Replacer l’intestin dans l’abdomen.
  32. Rincer la cavité abdominale avec du sérum physiologique 0,9 % stérile, qui a été préchauffé à 37 ° C.
  33. Fermer la couche de muscles abdominaux à l’aide de sutures en cours d’exécution de 6-0.
  34. Fermer la peau avec des sutures en cours d’exécution de 5-0.
  35. Injecter par voie sous-cutanée 4 ou 5 mg/kg carprofène avant de laisser la souris de se réveiller. Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il a pris conscience, maintenir le décubitus sternal. Garder l’animal seul dans une cage jusqu'à la guérison complète.
  36. Ajouter métamizolum à l’eau potable (50 mg/100 mL) comme médicaments contre la douleur pendant 3 jours et contrôler l’animal au quotidien. Habituellement, souris comme le doux goût de métamizolum et commencent à boire immédiatement après la chirurgie. Si vous préférez, agents injectables à libération peuvent être utilisés au lieu de métamizolum.
    Remarque : La période d’observation pour ce modèle est de 28 jours.

3. histopathologie

  1. Récolter l’aorte ballon-blessé après 28 jours en préparant les souris comme décrit aux points 2.2 à 2,9.
  2. Utiliser des ciseaux pour enlever l’aorte ballon-blessés (entre la bifurcation et 0,3 mm au dessus des vaisseaux rénaux) et euthanasier la souris en découpant de son cœur.
  3. Rincer la lumière du navire avec 0,9 % NaCl.
  4. Difficulté du navire récolté dans 4 % de paraformaldéhyde (PFA) du jour au lendemain et il déshydrater dans l’augmentation des concentrations d’éthanol, commençant par l’éthanol à 70 % pour l’éthanol à 80 % pendant 1 heure, 2 heures, éthanol à 95 % pendant 2 heures et l’éthanol à 100 % pendant 5 heures. Puis, incuber les échantillons dans le xylène 2 heures 3 fois, avant de s’infiltrer dans les échantillons avec de la paraffine.
    Remarque : au lieu de chasse d’eau du navire récolté avec 0,9 % NaCl, il peut être évacuée avec 4 % PFA.
    ATTENTION : PFA et xylène sont toxiques et doivent être manipulées avec soin.
  5. Incorporer l’échantillon à la paraffine et couper en tranches de 5 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
  6. Déparaffiner les diapositives avec xylène 3 fois pendant 5 minutes.
  7. Réhydrater les lames de tissu à l’aide d’une série décroissante de l’éthanol. Commencer avec 100 % d’éthanol 2 fois pendant 5 min, puis 3 minutes d’éthanol à 95 %, 80 % et 70 %.
  8. Tacher les diapositives avec coloration trichrome de Masson comme décrit18.
  9. Déshydrater les lames colorées dans 100 % éthanol 2 fois pendant 10 min chaque. Clair avec xylène 2 fois pour 10 min chacun et montez en milieu de montage.
  10. Visionner les diapositives avec un microscope à champ lumineux. Utiliser une lentille avec 5 x grossissement et une ouverture numérique de 0,12 pour une image d’aperçu ou une lentille avec des grossissements de 20 x avec une ouverture numérique de 0,35 pour l’observation détaillée.

4. la microscopie en immunofluorescence

  1. Réhydrater les lames de tissu à l’aide d’une série décroissante de l’éthanol. Commencer avec 100 % d’éthanol 2 fois pendant 5 min, suivie de 3 min d’éthanol à 95 %, 80 % et 70 %.
  2. Effectuer des recherche d’antigène en chauffant les lames dans une solution de recherche d’antigène dans un cuit-vapeur pendant 20 min.
  3. Laissez le refroidir de diapositives à température ambiante.
  4. Après avoir lavé les diapositives pour trois fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), appliquer une solution blocage antigène sur sections pendant 30 min.
  5. Les lames trois fois pendant 5 min avec du PBS.
  6. Incuber les sections avec l’anticorps primaire dilué dans du diluant l’anticorps primaire.
    Remarque : Le bon moment de concentration et d’incubation doit être choisi séparément pour chacun des anticorps.
  7. Les lames trois fois pendant 5 min avec du PBS pour éliminer les anticorps non lié.
  8. Incuber les sections avec un anticorps secondaire conjugué pré dilué dans l’anticorps secondaire diluant.
    Remarque : Le bon moment de concentration et d’incubation doit être choisi séparément pour chacun des anticorps.
  9. Ôter les anticorps non liés en lavant les diapositives pendant 5 min trois fois.
  10. Contre-coloration noyaux cellulaires à l’aide de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 15 min ; la concentration finale de DAPI devrait être de 350 nM.
  11. Monter les diapositives en immunofluorescence compatible solution de montage.
    Remarque : En utilisant la solution de montage incorrect peut obscurcir le signal de fluorescence.
  12. Consulter les diapositives avec un microscope à fluorescence. Utiliser une lentille de grossissement 40 x avec une ouverture numérique de 1,3.

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Representative Results

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Dénudation du ballon est un modèle approprié pour étudier le développement du MH chez la souris. Les animaux se remettre bien de la chirurgie et montrent une post-opération excellente condition physique. Nous avons créé ce modèle en 50 souris ayant moins de 3 % la mortalité due à l’intervention chirurgicale. Figures 1 b -C montrent les principales étapes chirurgicales. Après une incision de la peau le long de la linea alba, identifier l' aorte abdominalis. Placez les pinces microchirurgicales (Figure 1 b). Faire une petite incision au milieu de l’aorte, placer un cathéter à ballonnet dans le navire et la faire glisser il rétrograde, dans le sens inverse de la circulation sanguine (Figure 1). Mouvement du ballonnet gonflé mène au grattage de l’intima et, en même temps, une surdistension du navire. L’incision aortique sera fermée avec des points de suture unique. Un pouls aortique doit être visible dans la partie distale de l’incision.

MH se développe progressivement dans la prothèse au fil du temps. Histologiques de coloration avec de Masson trichrome montre la formation de myointima à l’intérieur de la limitante élastique interne (Figure 2 a). Myointimal lésions étaient principalement des composants cellulaires positifs pour SM22 ou certains composants de la matrice extracellulaire (Figure 2 b). Les cellules Myointimal sont encore évaluées par immunofluorescence souillant. La population principale dans le myointima se compose de cellules musculaires lisses (actine muscle lisse (SMA) positif) et myofibroblastes (fibroblastes activation protéine (FAP) positif) cellules (Figure 2 b).

Figure 1
Figure 1. Schéma de la sonde et son implantation. (A) schéma détaillé du cathéter. Port distale, ballonnet, port d’échange rapide (RX-port), guidewire monolumière RX-port, double lumens de RX-Port à ballon, hub, orifice de gonflement du ballonnet. (B) illustration schématique d’intervention chirurgicale. Écoulement de sang de l' aorte abdominalis a été arrêté avec deux pinces micro et une petite incision est pratiquée. C. gonflé le cathéter à l’intérieur de l’aorte abdominalis. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Formation de Myointima à l’intérieur de la limitante élastique interne. (A) souris dénudé aortes sont récoltées, paraffine encastré, et un échantillon représentatif est montré dans la coloration trichrome. (B) Double immunofluorescence souillant des aortes dénudées d’info-bulle s’affiche. La rangée supérieure représente myointimal lésions colorées pour SM22 et collagène III. Dans la rangée du bas, les navires sont colorées pour SMA et FAP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Cet article illustre un modèle murin pour étudier le développement de l’hyperplasie myointimal et permet l’exploration des processus pathologiques sous-jacent et les essais de nouveaux médicaments ou les options thérapeutiques.

L’étape la plus critique dans le présent protocole est la dénudation de l’aorte. Une attention particulière devrait être accordée au cours de cette étape car dénudation excessive conduira à la formation de l’anévrisme et la défaillance de modèle. En revanche, si la dénudation est effectuée insuffisamment, trop peu myointima se développe. Par conséquent, l’intensité de l’étape de dénudation est cruciale pour le résultat et le succès de ce modèle animal.

En ce qui concerne l’intervention chirurgicale, il est essentiel des que deux parois du navire ne sont pas percés en définissant les points de suture, ce qui peuvent entraîner un échec précoce de la perméabilité vasculaire. Nous avons déjà décrit un modèle de souris dans lequel nous avons induit sténose du vaisseau dans l’aorte abdominale de souris18. Toutefois, cela et la plupart des autres modèles fournissent seulement très petites quantités de tissu pour analyse. Un avantage de cette méthode est la taille relativement grande quantité de tissu obtenu (morceau de navire de ~ 1 cm). Une greffe de même bateau peut ainsi être divisée en plusieurs parties et utilisée pour diverses analyses, réduisant ainsi le nombre d’animaux de laboratoire nécessaires.

En outre, animaux aptes de knock out peut servir à étudier le développement de l’hyperplasie myointima dans des conditions différentes de la maladie. Les antécédents génétiques est cumulable également avec ce modèle animal pour comprendre les mécanismes de l’hyperplasie myointimal dans divers milieux ou l’impact de certains gènes.

En résumé, le modèle décrit ici est reproductible, facile à réaliser et peut être établie de manière rapide et fiable. Testé avec succès traitement options dans ce modèle peuvent être confirmées en gros animal modèles19.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Christiane Pahrmann pour son aide technique.

D.W. a été soutenu par la Foundation de Kade Max. T.D. a reçu des subventions de la Fondation de Kröner Else (2012_EKES.04) et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. a reçu des subventions de recherche de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 Ethilon suture Ethicon 2814G
3 mL Syringe BD Medical 309658
37% HCl Sigma-Aldrich H1758
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
Acid Fuchsin Sigma-Aldrich F8129-25G Trichrome staining
Antigen retrieval solution Dako S1699
Azophloxin Waldeck 1B-103 Trichrome staining
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer 1578675 Eye ointment
Betadine Solution Betadine Purdue Pharma NDC:67618-152
C57BL/6J Charles River Stock number 000664
Clamp applicator Fine Science Tools 18056-14 JAW DIMS: 4 x 0.75 mm LENGTH: 13 mm
Collagen 3 abcam ab7778 Antibody
DAPI Thermo Fischer D1306
Donkey anti-Goat IgG AF555 Invitrogen A21432 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 Invitrogen A21206 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 Invitrogen A11055 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF555 Invitrogen A31572 Secondary antibody
Ethanol 70% Th. Geyer 2270
Ethanol 96% Th. Geyer 2295
Ethanol absolute Th. Geyer 2246
FAP abcam ab28246 Antibody
Forceps fine Fine Science Tools 11251-20
Forceps standard Fine Science Tools 11023-10
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 537020
Hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Heparin Rotexmedica PZN 3862340 25.000 I.E./mL
High temperature cautery kit Bovie 18010-00
Image-iT FX Signal Enhancer Invitrogen I36933 Blocking solution
Light Green SF Waldeck 1B-211 Trichrome staining
Microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine - 4mm
MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange Abbott 1012268-06U
Molybdatophosphoric acid hydrate Merck 1.00532.0100 Trichrome staining
NaCl 0,9% B.Braun PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Needle holder Fine Science Tools 12075-14
Novaminsulfon Ratiopharm PZN 03530402 Metamizole
Orange G Waldeck 1B-221 Trichrome staining
Paraffin Leica biosystems REF 39602004
PBS pH 7,4 Gibco 10010023
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S
Ponceau S solution Serva Electrophoresis 33427 Trichrome staining
Primary antibody diluent Dako S3022
Prolong Gold Mounting solution Thermo Fischer P36930 Mounting solution for immunofluorescence stained slides
Replaceable Fine Tip Bovie H101
Resorcin-Fuchsin Weigert Waldeck 2E-30 Trichrome staining
Rimadyl Pfizer 400684.00.00 Carprofen
Scissors Fine Science Tools 14028-10
Scissors Vannas-style Fine Science Tools 15000-03
Secondary antibody diluent Dako S0809
Fast acting Adhesive MINIS 3x1g UHU 45370 Cyanoacrylate
Slide Rack Ted Pella 21057
SM22 abcam ab10135 Antibody
SMA abcam ab21027 Antibody
Staining dish Ted Pella 21075
Surgical microscope Leica M651
Tabotamp fibrillar Ethicon 431962 Absorbable hemostat
Transpore Surgical Tape 3M 1527-1
U-100 Insulin syringe BD Medical 324825
Vessel Dilator Fine Science Tools 18603-14
Vitro-Clud Langenbrinck 04-0001
Weigerts iron hematoxylin Kit Merck 1.15973.0002 Trichrome staining
Xylene Th. Geyer 3410

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References

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Tediashvili, G., Wang, D., Reichenspurner, H., Deuse, T., Schrepfer, S. Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta. J. Vis. Exp. (132), e56477, doi:10.3791/56477 (2018).More

Tediashvili, G., Wang, D., Reichenspurner, H., Deuse, T., Schrepfer, S. Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta. J. Vis. Exp. (132), e56477, doi:10.3791/56477 (2018).

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