Ballong-baserade skada att inducera Myointimal hyperplasi i mus bukaorta
Summary
Denna artikel visar en murin modell för att studera utvecklingen av myointimal hyperplasi (MH) efter aorta ballong skada.
Abstract
Användningen av djurmodeller är väsentliga för en bättre förståelse för MH, en viktig orsak för arteriell stenos. I den här artikeln visar vi en murin ballong denudation modell, som är jämförbar med etablerade fartyget skada modeller i stora djur. Aorta denudation modellen med ballong katetrar härmar kliniskt och leder till jämförbara pathobiological och fysiologiska förändringar. Kort, efter ett horisontellt snitt i den aorta abdominalis, en ballongkateter kommer vara infogas i fartyget, uppblåst och införde retrogradely. Inflationen av ballongen kommer att leda till intima skada och övertänjning av fartyget. Efter att ta bort katetern, kommer att aorta snittet vara stängd med enstaka stygn. Den modell som visas i den här artikeln är reproducerbara, lätt att utföra, och kan upprättas snabbt och tillförlitligt. Den är särskilt lämplig för att utvärdera dyra experimentella terapeutiska medel, som kan tillämpas på ett ekonomiskt sätt. Genom att använda olika knockoutmus stammar, kan effekterna av olika gener på MH utveckling bedömas.
Introduction
Arteriell stenos i koronara och perifera artärer har stor effekt på sjuklighet och dödlighet för patienter1. En underliggande patologiska mekanism är myointima hyperplasi (MH), som kännetecknas av ökad spridning, migration och syntesen av extracellulära matrix proteiner från vaskulär glatt muskulatur celler (SMC)2. SMC ligger i media lagret av fartyget och migrera vid stimulering till ytan av lumen. Stimulerande signaler inkluderar tillväxtfaktorer, cytokiner, cell-cell kontakt, lipider, extracellulär matrix komponenter och mekaniska skjuvning och stretch krafter3,4,5,6. Skador i kärlväggen, patologisk eller iatrogen, orsaka endotelceller och glatt muskulatur cellskador och stimulera inflammatoriska reaktioner, och därmed leda till MH7.
Olika modeller finns tillgängliga att studera arteriell skada och myointima hyperplasi. Stora djur som grisar eller hundar har fördelen av att dela en liknande artär och koronar anatomi med människor och är speciellt lämplig för studier som undersöker angioplastik tekniker, förfarande och enheter8. Gris-modeller har dock nackdelen att högre trombogeniciteten9,10, medan hundar bara har en lindrig reaktion på fartyget skada11. Dessutom, kräver alla stora djurmodeller speciell kåpa, utrustning och personal, som förbinds med höga kostnader och finns inte alltid på en institution. Små djur modeller inkluderar råttor och möss. Jämfört med råttor, har möss fördelarna med lägre kostnad och förekomsten av en mängd knock out-modeller. Den modell som beskrivs i denna video kan kombineras med ApoE-/-möss som utfodrats med en västerländsk kost att nära efterlikna den kliniska inställningen av angioplastik i aterosklerotiska kärl12. Tidigare modeller inducerad vaskulär skada via tråd skada13, flytande uttorkning14, VT15eller manschetten skada16. Eftersom arten av skadan kommer att kraftigt påverka utveckling och konstitutionen av MH, är med hjälp av en ballongkateter inducera fartyget skada det bästa sättet att efterlikna den kliniska inställningen.
I den här artikeln beskriver vi en ny metod för att framkalla MH med en ballongkateter i möss. Användning av en ballongkateter (1,2 mm x 6 mm) med en RX-Port (figur 1A) tillåter det skrapning av intimans lagret och, samtidigt, induktion av en övertänjning av fartyget. Båda dessa faktorer är viktiga triggers för utveckling av MH. Den observation tiden för denna modell är 28 dagar17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel visar en murin modell för att studera utvecklingen av myointimal hyperplasi och låter utforskandet av de underliggande patologiska processerna och testning av nya läkemedel eller behandlingsmetoder.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är denudation av aorta. Särskild omsorg bör ägnas under detta steg eftersom överdriven denudation leder till aneurysm bildandet och modell misslyckande. Däremot, om denudation utförs otillräckligt, att för lite myointima utvecklas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Christiane Pahrmann för hennes tekniskt bistånd.
D.W. stöddes av Max Kade Foundation. T.D. fick anslag från den annan Kröner Fondation (2012_EKES.04) och den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DE2133/2-1_. S. S. fått forskningsanslag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 3 mL Syringe | BD Medical | 309658 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Antigen retrieval solution | Dako | S1699 | |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| C57BL/6J | Charles River | Stock number 000664 | |
| Clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| Collagen 3 | abcam | ab7778 | Antibody |
| DAPI | Thermo Fischer | D1306 | |
| Donkey anti-Goat IgG AF555 | Invitrogen | A21432 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A21206 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A11055 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF555 | Invitrogen | A31572 | Secondary antibody |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| FAP | abcam | ab28246 | Antibody |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Heparin | Rotexmedica | PZN 3862340 | 25.000 I.E./mL |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| Image-iT FX Signal Enhancer | Invitrogen | I36933 | Blocking solution |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine – 4mm |
| MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange | Abbott | 1012268-06U | |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| NaCl 0,9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| PBS pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Prolong Gold Mounting solution | Thermo Fischer | P36930 | Mounting solution for immunofluorescence stained slides |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Resorcin-Fuchsin Weigert | Waldeck | 2E-30 | Trichrome staining |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Scissors Vannas-style | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| Fast acting Adhesive MINIS 3x1g | UHU | 45370 | Cyanoacrylate |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| SM22 | abcam | ab10135 | Antibody |
| SMA | abcam | ab21027 | Antibody |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Tabotamp fibrillar | Ethicon | 431962 | Absorbable hemostat |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| U-100 Insulin syringe | BD Medical | 324825 | |
| Vessel Dilator | Fine Science Tools | 18603-14 | |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 |
References
- Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-116 (2011).
- Austin, G. E., Ratliff, N. B., Hollman, J., Tabei, S., Phillips, D. F. Intimal proliferation of smooth muscle cells as an explanation for recurrent coronary artery stenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 6 (2), 369-375 (1985).
- Greenwald, S. E., Berry, C. L. Improving vascular grafts: the importance of mechanical and haemodynamic properties. J Pathol. 190 (3), 292-299 (2000).
- Majesky, M. W., Schwartz, S. M. Smooth muscle diversity in arterial wound repair. Toxicol Pathol. 18 (4 Pt 1), 554-559 (1990).
- Owens, G. K. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev. 75 (3), 487-517 (1995).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Kleemann, R., Zadelaar, S., Kooistra, T. Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice. Cardiovasc Res. 79 (3), 360-376 (2008).
- Karas, S. P., et al. Coronary intimal proliferation after balloon injury and stenting in swine: an animal model of restenosis. J Am Coll Cardiol. 20 (2), 467-474 (1992).
- Ip, J. H., et al. The role of platelets, thrombin and hyperplasia in restenosis after coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 17 (6 Suppl B), 77B-88B (1991).
- Mason, R. G., Read, M. S. Some species differences in fibrinolysis and blood coagulation. J Biomed Mater Res. 5 (1), 121-128 (1971).
- Lafont, A., Faxon, D. Why do animal models of post-angioplasty restenosis sometimes poorly predict the outcome of clinical trials?. Cardiovasc Res. 39 (1), 50-59 (1998).
- Matter, C. M., et al. Increased balloon-induced inflammation, proliferation, and neointima formation in apolipoprotein E (ApoE) knockout mice. Stroke. 37 (10), 2625-2632 (2006).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Simon, D. I., et al. Decreased neointimal formation in Mac-1(-/-) mice reveals a role for inflammation in vascular repair after angioplasty. J Clin Invest. 105 (3), 293-300 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Moroi, M., et al. Interaction of genetic deficiency of endothelial nitric oxide, gender, and pregnancy in vascular response to injury in mice. J Clin Invest. 101 (6), 1225-1232 (1998).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artif Organs. 15 (2), 103-118 (1991).
- Stubbendorff, M., et al. Inducing myointimal hyperplasia versus atherosclerosis in mice: an introduction of two valid models. J Vis Exp. (87), e51459 (2014).
- Deuse, T., et al. Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury. Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).
