Summary

Ballong-baserade skada att inducera Myointimal hyperplasi i mus bukaorta

Published: February 07, 2018
doi:

Summary

Denna artikel visar en murin modell för att studera utvecklingen av myointimal hyperplasi (MH) efter aorta ballong skada.

Abstract

Användningen av djurmodeller är väsentliga för en bättre förståelse för MH, en viktig orsak för arteriell stenos. I den här artikeln visar vi en murin ballong denudation modell, som är jämförbar med etablerade fartyget skada modeller i stora djur. Aorta denudation modellen med ballong katetrar härmar kliniskt och leder till jämförbara pathobiological och fysiologiska förändringar. Kort, efter ett horisontellt snitt i den aorta abdominalis, en ballongkateter kommer vara infogas i fartyget, uppblåst och införde retrogradely. Inflationen av ballongen kommer att leda till intima skada och övertänjning av fartyget. Efter att ta bort katetern, kommer att aorta snittet vara stängd med enstaka stygn. Den modell som visas i den här artikeln är reproducerbara, lätt att utföra, och kan upprättas snabbt och tillförlitligt. Den är särskilt lämplig för att utvärdera dyra experimentella terapeutiska medel, som kan tillämpas på ett ekonomiskt sätt. Genom att använda olika knockoutmus stammar, kan effekterna av olika gener på MH utveckling bedömas.

Introduction

Arteriell stenos i koronara och perifera artärer har stor effekt på sjuklighet och dödlighet för patienter1. En underliggande patologiska mekanism är myointima hyperplasi (MH), som kännetecknas av ökad spridning, migration och syntesen av extracellulära matrix proteiner från vaskulär glatt muskulatur celler (SMC)2. SMC ligger i media lagret av fartyget och migrera vid stimulering till ytan av lumen. Stimulerande signaler inkluderar tillväxtfaktorer, cytokiner, cell-cell kontakt, lipider, extracellulär matrix komponenter och mekaniska skjuvning och stretch krafter3,4,5,6. Skador i kärlväggen, patologisk eller iatrogen, orsaka endotelceller och glatt muskulatur cellskador och stimulera inflammatoriska reaktioner, och därmed leda till MH7.

Olika modeller finns tillgängliga att studera arteriell skada och myointima hyperplasi. Stora djur som grisar eller hundar har fördelen av att dela en liknande artär och koronar anatomi med människor och är speciellt lämplig för studier som undersöker angioplastik tekniker, förfarande och enheter8. Gris-modeller har dock nackdelen att högre trombogeniciteten9,10, medan hundar bara har en lindrig reaktion på fartyget skada11. Dessutom, kräver alla stora djurmodeller speciell kåpa, utrustning och personal, som förbinds med höga kostnader och finns inte alltid på en institution. Små djur modeller inkluderar råttor och möss. Jämfört med råttor, har möss fördelarna med lägre kostnad och förekomsten av en mängd knock out-modeller. Den modell som beskrivs i denna video kan kombineras med ApoE-/-möss som utfodrats med en västerländsk kost att nära efterlikna den kliniska inställningen av angioplastik i aterosklerotiska kärl12. Tidigare modeller inducerad vaskulär skada via tråd skada13, flytande uttorkning14, VT15eller manschetten skada16. Eftersom arten av skadan kommer att kraftigt påverka utveckling och konstitutionen av MH, är med hjälp av en ballongkateter inducera fartyget skada det bästa sättet att efterlikna den kliniska inställningen.

I den här artikeln beskriver vi en ny metod för att framkalla MH med en ballongkateter i möss. Användning av en ballongkateter (1,2 mm x 6 mm) med en RX-Port (figur 1A) tillåter det skrapning av intimans lagret och, samtidigt, induktion av en övertänjning av fartyget. Båda dessa faktorer är viktiga triggers för utveckling av MH. Den observation tiden för denna modell är 28 dagar17.

Protocol

Djuren fick Human vård i enlighet med guiden för principer av laboratoriedjur, beredd av institutet av laboratorium djur resurser och utgiven av National Institutes of Health. Alla djur protokoll godkändes av den lokala myndigheten (” Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (kontoret för hälsa och konsumentskydd) Hamburg”). 1. katetern förberedelse Obs: Se Tabell av material för information om katetern. Ta katetern f…

Representative Results

Ballong denudation är en lämplig modell för att studera utvecklingen av MH i möss. Djur återhämta sig väl från operationen och visa en utmärkt kondition efter operation. Vi etablerade denna modell i 50 möss med mindre än 3% dödligheten på grund av det kirurgiska ingreppet. Siffror 1B -C visar de viktigaste kirurgiska stegen. Efter en hud snitt längs den linea alba, identifiera den aorta abdominalis. Placera mik…

Discussion

Denna artikel visar en murin modell för att studera utvecklingen av myointimal hyperplasi och låter utforskandet av de underliggande patologiska processerna och testning av nya läkemedel eller behandlingsmetoder.

Det mest kritiska steget i detta protokoll är denudation av aorta. Särskild omsorg bör ägnas under detta steg eftersom överdriven denudation leder till aneurysm bildandet och modell misslyckande. Däremot, om denudation utförs otillräckligt, att för lite myointima utvecklas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Christiane Pahrmann för hennes tekniskt bistånd.

D.W. stöddes av Max Kade Foundation. T.D. fick anslag från den annan Kröner Fondation (2012_EKES.04) och den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DE2133/2-1_. S. S. fått forskningsanslag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).

Materials

10-0 Ethilon suture Ethicon 2814G
3 mL Syringe BD Medical 309658
37% HCl Sigma-Aldrich H1758
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
Acid Fuchsin Sigma-Aldrich F8129-25G Trichrome staining
Antigen retrieval solution Dako S1699
Azophloxin Waldeck 1B-103 Trichrome staining
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer 1578675 Eye ointment
Betadine Solution Betadine Purdue Pharma NDC:67618-152
C57BL/6J Charles River Stock number 000664
Clamp applicator Fine Science Tools 18056-14
Collagen 3 abcam ab7778 Antibody
DAPI Thermo Fischer D1306
Donkey anti-Goat IgG AF555 Invitrogen A21432 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 Invitrogen A21206 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 Invitrogen A11055 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF555 Invitrogen A31572 Secondary antibody
Ethanol 70% Th. Geyer 2270
Ethanol 96% Th. Geyer 2295
Ethanol absolute Th. Geyer 2246
FAP abcam ab28246 Antibody
Forceps fine Fine Science Tools 11251-20
Forceps standard Fine Science Tools 11023-10
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 537020
Hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Heparin Rotexmedica PZN 3862340 25.000 I.E./mL
High temperature cautery kit Bovie 18010-00
Image-iT FX Signal Enhancer Invitrogen I36933 Blocking solution
Light Green SF Waldeck 1B-211 Trichrome staining
Microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine – 4mm
MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange Abbott 1012268-06U
Molybdatophosphoric acid hydrate Merck 1.00532.0100 Trichrome staining
NaCl 0,9% B.Braun PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Needle holder Fine Science Tools 12075-14
Novaminsulfon Ratiopharm PZN 03530402 Metamizole
Orange G Waldeck 1B-221 Trichrome staining
Paraffin Leica biosystems REF 39602004
PBS pH 7,4 Gibco 10010023
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S
Ponceau S solution Serva Electrophoresis 33427 Trichrome staining
Primary antibody diluent Dako S3022
Prolong Gold Mounting solution Thermo Fischer P36930 Mounting solution for immunofluorescence stained slides
Replaceable Fine Tip Bovie H101
Resorcin-Fuchsin Weigert Waldeck 2E-30 Trichrome staining
Rimadyl Pfizer 400684.00.00 Carprofen
Scissors Fine Science Tools 14028-10
Scissors Vannas-style Fine Science Tools 15000-03
Secondary antibody diluent Dako S0809
Fast acting Adhesive MINIS 3x1g UHU 45370 Cyanoacrylate
Slide Rack Ted Pella 21057
SM22 abcam ab10135 Antibody
SMA abcam ab21027 Antibody
Staining dish Ted Pella 21075
Surgical microscope Leica M651
Tabotamp fibrillar Ethicon 431962 Absorbable hemostat
Transpore Surgical Tape 3M 1527-1
U-100 Insulin syringe BD Medical 324825
Vessel Dilator Fine Science Tools 18603-14
Vitro-Clud Langenbrinck 04-0001
Weigerts iron hematoxylin Kit Merck 1.15973.0002 Trichrome staining
Xylene Th. Geyer 3410

References

  1. Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-116 (2011).
  2. Austin, G. E., Ratliff, N. B., Hollman, J., Tabei, S., Phillips, D. F. Intimal proliferation of smooth muscle cells as an explanation for recurrent coronary artery stenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 6 (2), 369-375 (1985).
  3. Greenwald, S. E., Berry, C. L. Improving vascular grafts: the importance of mechanical and haemodynamic properties. J Pathol. 190 (3), 292-299 (2000).
  4. Majesky, M. W., Schwartz, S. M. Smooth muscle diversity in arterial wound repair. Toxicol Pathol. 18 (4 Pt 1), 554-559 (1990).
  5. Owens, G. K. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev. 75 (3), 487-517 (1995).
  6. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
  7. Kleemann, R., Zadelaar, S., Kooistra, T. Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice. Cardiovasc Res. 79 (3), 360-376 (2008).
  8. Karas, S. P., et al. Coronary intimal proliferation after balloon injury and stenting in swine: an animal model of restenosis. J Am Coll Cardiol. 20 (2), 467-474 (1992).
  9. Ip, J. H., et al. The role of platelets, thrombin and hyperplasia in restenosis after coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 17 (6 Suppl B), 77B-88B (1991).
  10. Mason, R. G., Read, M. S. Some species differences in fibrinolysis and blood coagulation. J Biomed Mater Res. 5 (1), 121-128 (1971).
  11. Lafont, A., Faxon, D. Why do animal models of post-angioplasty restenosis sometimes poorly predict the outcome of clinical trials?. Cardiovasc Res. 39 (1), 50-59 (1998).
  12. Matter, C. M., et al. Increased balloon-induced inflammation, proliferation, and neointima formation in apolipoprotein E (ApoE) knockout mice. Stroke. 37 (10), 2625-2632 (2006).
  13. Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
  14. Simon, D. I., et al. Decreased neointimal formation in Mac-1(-/-) mice reveals a role for inflammation in vascular repair after angioplasty. J Clin Invest. 105 (3), 293-300 (2000).
  15. Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
  16. Moroi, M., et al. Interaction of genetic deficiency of endothelial nitric oxide, gender, and pregnancy in vascular response to injury in mice. J Clin Invest. 101 (6), 1225-1232 (1998).
  17. Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artif Organs. 15 (2), 103-118 (1991).
  18. Stubbendorff, M., et al. Inducing myointimal hyperplasia versus atherosclerosis in mice: an introduction of two valid models. J Vis Exp. (87), e51459 (2014).
  19. Deuse, T., et al. Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury. Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).

Play Video

Cite This Article
Tediashvili, G., Wang, D., Reichenspurner, H., Deuse, T., Schrepfer, S. Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta. J. Vis. Exp. (132), e56477, doi:10.3791/56477 (2018).

View Video